Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Generierung von Transgenen unter Verwendung von genomischer Wurm-DNA, die in einem SMID-Bibliotheksklon transportiert wird. Durch die Verwendung von genomischer DNA bleiben alle nativen Kontrollelemente wie Enhancer in drei Haupt-UTR-Regionen erhalten. Dies wird erreicht, indem das FO-Smid in den Coli-Stamm SW 1 0 6 E verschoben wird, um die induzierbare Lambda-Rot-Rekombinationsmaschine zu nutzen.

In einem zweiten Schritt wird das GAL-K-Gen an die gewünschte Stelle im FO-SMID eingefügt, die die Stelle markiert, an der das GFP- oder Tap-Tag platziert wird. Als nächstes wird das Gade-Gen durch GFP oder ein tap-TAC durch homologe Rekombination ersetzt, gefolgt von einer negativen Selektion mit Desoxy-Galactose, um das modifizierte Transgen zu erzeugen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass diese Transgene schnell und erfolgreich erzeugt werden können, basierend auf der Verifizierung der T-Insertion durch Kolonie-PCR.

Hallo, mein Name ist Love Ship. Ich arbeite im Fisher Lab an der University of Pittsburgh. Heute demonstriere ich die Technik, um C elegant transgen zu machen.

Warum Rekombination mit GK als wählbarem Marker? Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Erzeugung von Cogan-Transgenen besteht darin, dass wir bei dieser Technik die genomische DNA des interessierenden Gens verwenden und somit in der Lage sind, alle kritischen Elemente der Genregulation abzudecken, wie z.B. Kontrollelemente in drei Haupt-UTR-Regionen, alternative Gewürztranskripte, alternative Promotoren und distale Antworten, die in herkömmlichen Standard-Klonierungs-basierten Ansätzen übersehen werden könnten. Also lasst uns loslegen.

Bestellen Sie den FO-Smid-Klon für das Gen of Interest oder GOI beim Gen-Service unter Verwendung von Worm Base als Richtlinie. Bei der Auswahl von Klonen wählen wir diejenigen aus, bei denen sich die GOI in der Mitte der Sequenz befindet. Klone, die benachbarte Gene ausschließen, könnten zwar vorzuziehen sein, aber es könnte schwierig sein, eine Kultur zu finden.

Der SMID-Klon für die GOI in LB enthält 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol, die Smids werden im Stamm EPI 300 verschickt und können bei 37 Grad Celsius gezüchtet werden. Züchten Sie als Nächstes eine 1,5-Milliliter-Übernachtkultur der SMID bei 37 Grad Celsius und bereiten Sie die SMID-DNA vor. Mit dem Epicenter SMID-Vorbereitungskit folgen wir dem in der Anleitung beschriebenen alternativen Protokoll, bei dem die Ribo-Kurzmischung hinzugefügt wird. Bestimmen Sie in einem früheren Schritt die FOSS-DNA-Konzentration.

Die Verwendung eines Spektralphotometers ist in der Regel sehr gering, aber ausreichend. Für eine erfolgreiche Elektroporation. Bereiten Sie elektrokompetente SW 1 0 6-Zellen vor, indem Sie eine Fünf-Milliliter-Übernachtkultur in LB-Medien bei 32 Grad Celsius in einem 14-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen züchten.

Am nächsten Morgen. Impfen Sie einen Milliliter der Kultur in 100 Milliliter Pfund in einem Zwei-Liter-Kolben. Züchten Sie SW 1 0 6 Bakterien auf einen OD 600 von 0,6 bis 0,8.

Keinen Hitzeschock durchführen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 g für fünf Minuten. Suspendieren Sie das Pellet erneut, indem Sie es vorsichtig in einem Milliliter eiskaltem 10%igem Glycerin einreiben.

Fügen Sie dann 50 Milliliter eiskaltes, 10%iges Glycerin hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt einmal. Zum Schluss wird der SW 1 0 6 durch Zentrifugation wieder pelletiert und DEC kann nur etwa 500 Mikroliter von jedem Überstand Resus aufnehmen.

Suspendieren Sie die Pellets durch sanftes Vortexen, frieren Sie 100 Mikroliter Ali Watt in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Verarbeitung bereit sind. Transformieren Sie die fosson-DNA in elektrokompetente SW 1 0 6-Zellen, indem Sie die Bakterien mit etwa 50 Nanogramm fos-DNA in Küvetten mit einem EOR 25 10-Elektroperter bei 1.350 Volt elektroparadieren. Die Bakterien in einem Milliliter LB für eine Stunde bei 32 Grad Celsius zurückgewinnen, Eloqua auf LB-Platten mit Chloramphenicol auffüllen und über Nacht bei 32 Grad Celsius inkubieren.

Überprüfen Sie das Vorhandensein des interessierenden Gens mithilfe der Kolonie-PCR, indem Sie eine Fünf-Milliliter-Übernachtkultur in LB mit 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol bei 32 Grad Celsius züchten. Anschließend wird bei 0,5 Mikrolitern der Kultur eine Standard-PCR-Reaktion mit den flankierenden Oligos durchgeführt und die anfängliche Inkubation bei 95 Grad Celsius auf fünf Minuten erhöht, um die Bakterien vor der Reaktion in Scheiben zu schneiden. Bereiten Sie schließlich eine Glycerinbrühe für die Langzeitlagerung vor, um das Gal-K-Gen in das FO-Smid einzufügen, das das gewünschte Gen trägt.

Bereiten Sie zunächst Mopp-Minimum-Media-Platten mit 0,2 % Galaktose vor. Das Rezept finden Sie im schriftlichen Teil dieses Protokolls. Als nächstes PCR-Amplifikation der P mod four gal, k, g oder P mod four gal K GT Kassette

Wir verwenden Fusion oder Go Tac Gel. Reinigen Sie das resultierende PCR-Produkt. Quantifizieren Sie die Ausbeute auf einem Gel oder mit einem NanoDrop-Spektralphotometer.

Lagern Sie das PCR-Produkt bis zur Gebrauchsbereitschaft bei vier Grad Celsius, inokulieren Sie fünf Milliliter und Chloramphenicol mit SW 1 0 6 Zellen, die die Foss-DNA enthalten, wachsen über Nacht bei 32 Grad Celsius. Fügen Sie einen Milliliter Übernachtkultur zu 100 Millilitern lb und Chloramphenicol hinzu. In einem Zwei-Liter-Kolben wachsen Sie auf einen OD von 0,6 bis 0,8.

Dies dauert in der Regel drei bis vier Stunden, während die Kultur wächst. Stellen Sie ein Schüttelwasserbad auf 42 Grad Celsius ein, um sich mit einem sterilen 250-Milliliter-Kolben in der Halterung aufzuwärmen. Die Verwendung eines Schüttelwasserbads für den nächsten Schritt ist entscheidend, um einen hohen Wirkungsgrad zu erzielen.

Anschließend 50 Milliliter der Kultur SW 1 0 6 in den 250-Milliliter-Kolben überführen und bei 42 Grad Celsius und 100 U/min genau 20 Minuten lang im Schüttelwasserbad einen Hitzeschock versetzen. Lassen Sie die restlichen Bakterien bei 32 Grad Celsius, um sie als uninduzierte Kontrolle zu verwenden. Kühlen Sie die induzierten und nicht induzierten Bakterien 10 Minuten lang auf Eis ab.

Übertragen Sie die Proben in zwei sterile Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie sie fünf Minuten lang bei etwa 5.000 g. Gießen Sie den gesamten Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eiskaltem 10%igem Glycerin durch sanftes Vortexen. Fügen Sie weitere 49 Milliliter eiskaltes, 10%iges Glycerin hinzu.

Wiederholen Sie diese Wäsche und pelletieren Sie sie erneut. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Röhrchen umdrehen und das Pellet in der kleinen Menge des verbleibenden flüssigen Eloqua in 100-Mikroliter-Proben resuspendieren. Auf Trockeneis einfrieren und am Folgetag bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Elektroparade, die induzierten und uninduzierten SW 1 0 6 Zellen mit 150 Nanogramm des hergestellten PCR-Produkts unter Verwendung von Küvetten mit einem Abstand von 0,1 Zentimetern in einem 25 Tonnen Elektrorassel. Eingestellt auf 1.350 Volt. Verwerten Sie die Bakterien in einem Milliliter LB in einem 14-Milliliter-Falcon-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Bakterien nach der Inkubation viereinhalb Stunden lang bei 32 Grad Celsius, pelletieren Sie sie bei 13.200 U/min für 15 Sekunden und resuspendieren Sie in M neun Medium. Bitte beachten Sie für das Rezept den schriftlichen Teil dieses Protokolls. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.

Um jegliches Reichhaltiges Medium zu entfernen, werden die Zellen erneut pelletiert und in einem Milliliter M neun resuspendiert, bevor die serielle Verdünnung auf Mopps plattiert wird. Minimales Medium: Drei bis fünf Tage bei 32 Grad Celsius in einem Inkubator inkubieren. Seien Sie geduldig, während die wirklich positiven Ergebnisse langsam wachsen und eine Kolonie auf Macon-Agar streifen, um die Kolonie zu reinigen und zu überprüfen, ob sie GLK-positiv ist.

Die Völker sollten sich leuchtend rosa färben. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus und impfen Sie eine fünf Milliliter Pfund plus Chloramphenicol, die über Nacht bei 32 Grad Celsius inkubiert wird. Bestätigen Sie das Einsetzen des Gallenkäfigs an der richtigen Stelle mittels PCR mit den flankierenden Oligos.

Siehe Tabelle eins im schriftlichen Teil dieses Protokolls. Für die Oligosequenzen fügen Sie 0,5 Mikroliter der Kultur zu einer Standard-PCR-Reaktion hinzu und erhöhen die anfängliche Inkubation von 95 Grad Celsius auf fünf Minuten, um die Bakterien zu entleeren. Das PCR-Produkt sollte aufgrund des Vorhandenseins des GAL K-Gens in der Größe nach oben verschoben werden.

Bereiten Sie abschließend die Glycerinbrühe für die Lagerung vor. Bereiten Sie Mopps mit minimalen Medienplatten vor, die 0,2 % Desoxygalaktose oder DOG und 0,2 % Glycerin enthalten. Das Rezept finden Sie im schriftlichen Teil dieses Protokolls. PCR.

Amplifizieren Sie die Tag-Fragmente von PMO 4G, FP, PBS 1761 oder PBS 1479 mit denselben Oligos, die in der ersten Runde verwendet wurden, oder mit kürzeren GFP- oder Tap-spezifischen Oligos. Wenn Sie mehrere Konstrukte herstellen, ist es besonders nützlich, die kürzeren Oligos zu verwenden, da das gleiche PCR-Produkt für alle Konstrukte Gel verwendet werden kann. Reinigen Sie das PCR-Produkt und messen Sie die Konzentration auf einem Gel oder mit einem Spektralphotometer, erzeugen Sie induzierte und nicht induzierte kompetente W 1 0 6 Zellen, die die SMID mit dem Gale K-Gen tragen, wie oben beschrieben, essen Sie die induzierten und uninduzierten SW 1 0 6 Zellen mit etwa 100 Nanogramm PCR-Produkt unter Verwendung eines 0,1 Zentimeter großen Abstands Q vets in einem EINOR 25 10 Ator, der auf 1 eingestellt ist, 350 Volt.

Gewinnen Sie in einem Milliliter LV in einem 14-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen und inkubieren Sie es viereinhalb Stunden lang in einem 32-Grad-Celsius-Shaker. Waschen und verdünnen Sie die Zellen in M neun wie zuvor gezeigt. Platten Sie die Bakterien auf Mopps, minimales Medium mit 0,2 % DOG und 0,2 % Glycerin, inkubieren Sie die Platten drei Tage lang bei 32 Grad Celsius, um das Vorhandensein der Insertion zu bestätigen.

Verwenden Sie vier Kolonien, um fünf Milliliter-Übernachtkulturen in LB mit 12,5 Mikrogramm pro Milliliter zu beimpfen. Chloramphenicol führt eine Kolonie-PCR durch, wie zuvor beschrieben. Wir verwenden sowohl die kürzeren GFP-Tap-spezifischen Oligos als auch die flankierenden Oligos, um den richtigen Einsatz und die richtige Stelle zu demonstrieren.

GFP besteht aus etwa 800 Basenpaaren. TAP beträgt etwa 550 Basenpaare und gal KT 1,4. Kilobasen bereiten schließlich einen Glycerinvorrat für die Langzeitlagerung vor.

Die Modifikation von FO smed durch Rekombination führt zu robusten Ergebnissen und Erfolgsraten von mehr als 90% im negativen Selektionsschritt werden routinemäßig beobachtet. Darüber hinaus dauert es etwa zwei Wochen, bis dieses Protokoll abgeschlossen ist, was die Vorbereitung von Transgenen ziemlich schnell macht, wie unsere 48 Kolonien zeigten, die auf DOG-Platten identifiziert und für die Kolonie-PCR unter Verwendung der Flagge GFP Oligos verwendet wurden, die das GFP-Insert in diesem Experiment amplifizierten. 47 von 48 Kolonien sind korrekt und eine Kolonie ist nicht korrekt modifiziert, gezeigt sind 48 Kolonien, die auf DOG-Platten identifiziert und für die Kolonie-PCR unter Verwendung der Flagge GFP Oligos verwendet wurden, die das GFP-Insert in diesem Experiment amplifizierten.

46 von 48 Völkern sind korrekt und zwei Völker sind nicht korrekt verändert. Der wichtigste Punkt, den Sie bei der Durchführung dieses Experiments beachten sollten, ist, dass die SW 1 0 6-Bakterien bei 32 Grad Celsius und nicht bei höheren Temperaturen gezüchtet werden müssen, da das Wachstum bei höheren Temperaturen Mutanten mit Mutationen selektiert, die die Lambda-Rot-Maschinerie beeinträchtigen. Viel Glück bei Ihrem Experiment.