Name: Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die effiziente Transgenherstellung in C. elegans mittels Recombineering mit dem GalK-Selektionsmarker. Diese Methode bewahrt native regulatorische Elemente und ermöglicht präzise genetische Modifikationen für funktionale Analysen.

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Die Autoren bedanken sich bei Lindsey Nash für die Hilfe bei der Entwicklung der Technik zu danken. Diese Arbeit wurde vom NIH AG028977 zu ALF, ein Pilotprojekt Zuschuss von der University of Pittsburgh OAIC (AG024827), und Anschubfinanzierung von der University of Pittsburgh finanziert.

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<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
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<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
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<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

Die Erzeugung von Transgenen aus Fosmide bietet den Vorteil der Beibehaltung aller von den nativen Promotor-Elemente, Splice-Varianten und 3 &#39;UTR regulatorische Elemente. Dies kann mit dem Bau eines Transgens, das eher auf den einheimischen Ausdruck Muster oder den Bau eines funktionalen Transgen, wenn andere Ansätze 5 alle fehlschlagen wird führen können. Die daraus resultierende Transgene tragen kann eine Vielzahl von Epitop-Tags einschließlich GFP oder ein TAP-Tag. Der Bau ...

<table><tbody><tr><td>FosmidMAX-Kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>MOPS-Medien</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>0,132 M Kaliumphosphatlösung</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-Desoxygalactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Phusion-DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>MacConkey-Agar-Grundmedium</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

die produktion von c. elegans transgene via recombineering mit dem galk selektionsmarker

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

Die Erzeugung transgener Tiere ist weit verbreitet in C genutzt elegans Forschung einschließlich der Verwendung von GFP Fusionsproteine ​​auf die Regulation und Expression von Genen von Interesse oder die Erzeugung von Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) markierten Versionen bestimmter Gene, um ihre Reinigung zu erleichtern studieren. Typischerweise Transgene werden durch einen Promotor stromaufwärts von einem GFP-Reportergen oder cDNA von Interesse erzeugt, und dies führt oft zu einer repräsentativen Expressionsmuster. Allerdings kritischen Elemente der Genregulation, wie Steuerelemente in der 3 &#39;untranslatierten Region oder alternative Promotoren, konnte durch diesen Ansatz fehlen. Weitere nur eine einzige Spleißvariante können in der Regel auf diese Weise untersucht werden. Im Gegensatz dazu die Verwendung von Wurm genomischer DNA von Fosmid DNA-Klone durchgeführt beinhaltet wahrscheinlich die meisten, wenn nicht alle Elemente in der Genregulation in vivo, die die größere Fähigkeit, die echten Ausdruck Muster und Timing zu erfassen erlaubt beteiligt. Zur Erleichterung der Erzeugung von Transgenen mit Fosmid DNA beschreiben wir ein E. coli basierten Recombineering Verfahren zur GFP, einem TAP-tag oder andere Sequenzen von Interesse in jeder beliebigen Stelle im Gen einzufügen. Das Verfahren nutzt die galK-Gen als Selektionsmarker für die positiven und negativen Selektion Schritte in die Rekombination in den Erhalt der gewünschten Modifikation mit hohem Wirkungsgrad zur Folge. Außerdem sind Plasmide, die die galK Gens durch Homologie Arme auf häufig verwendete GFP flankiert und TAP Fusionsgene zur Verfügung, die Reduzierung der Kosten für Oligos um 50% bei der Erzeugung eines GFP-oder TAP-Fusionsprotein. Diese Plasmide verwenden R6K Replikationsursprung, der die Notwendigkeit einer umfassenden PCR-Produkt Reinigung ausschließt. Schließlich haben wir auch zeigen, eine Technik, um die unc-119-Marker auf die Fosmid Rückgrat der die Fosmid direkt injiziert werden oder bombardiert zu Würmern, um transgene Tiere zu erzeugen erlaubt integrieren. Dieses Video zeigt die Verfahren bei der Erzeugung eines Transgens über Rekombination mit dieser Methode beteiligt.

Die Fähigkeit, Transgene für produzieren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Verwendung von genomischer DNA von Fosmide durchgeführt Besonders attraktiv ist wie alle nativen regulatorischen Elemente beibehalten werden. Beschrieben wird eine einfache und robuste Verfahren zur Herstellung von Transgenen über Rekombination mit dem<em&gt; GalK</em&gt; Selektionsmarker.

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

Die Erzeugung transgener Tiere wird in der C. elegans-Forschung weit verbreitet eingesetzt, einschließlich der Verwendung von GFP-Fusionsproteinen zur Untersuchung der Regulation und ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Transgene mithilfe von genomischer DNA aus Würmern zu erzeugen, die in einem SMID-Bibliotheksklon enthalten ist. Die Verwendung von genomischer DNA erhält sämtliche nativen Kontrollelemente, wie beispielsweise Enhancer in den drei-primär-gelegenen UTR-Bereichen. Dies wird erreicht, indem der FO-Smid in den SW-1-0-6-E.-coli-Stamm übertragen wird, um die induzierbare Lambda-Red-Rekombinationsmaschinerie zu nutzen. Im zweiten Schritt wird das GAL-K-Gen an die gewünschte Position in der FO-smid eingefügt, die die Stelle markiert, an der das GFP- oder Tap-Tag platziert wird. Anschließend wird das Gade-Gen durch GFP oder ein Tap-TAC mittels homologer Rekombination ersetzt, gefolgt von einer negativen Selektion mit Desoxygalactose, um das modifizierte Transgen zu erzeugen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Transgene schnell und erfolgreich hergestellt werden können, basierend auf der Verifizierung der T-Insertion durch Kolonie-PCR.Hallo, mein Name ist Love Ship. Ich arbeite im Fisher-Labor an der University of Pittsburgh. Heute demonstriere ich die Technik zur Herstellung eines C. elegans-Transgens.Warum die Rekombination mit

the-production-c-elegans-transgenes-via-recombineering-with-galk

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Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Technik der Mikroinjektion in die Gonade von C. elegans, um transgene Tiere zu schaffen.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Erzeugung von transgenen C. elegans Nach Biolistic Transformation

Wir beschreiben eine Methode, um sensibilisiert postembryonalen Regulatoren der Protein-Expression und Lokalisation in...

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Dieses Protokoll beschreibt ein schnelles und materialsparendes Verfahren zur Integration von transgenen extrachromosomalen Arrays in das Genom von Caenorhabditis elegans mittels ultravioletter (UV) Bestrahlung. Darüber hinaus eignet sich dieses Protokoll besonders gut für transgene Linien, die extrachromosomale Arrays mit hoher Geschwindigkeit übertragen.

Ein schnelles Protokoll zur Integration extrachromosomaler Arrays mit hoher Übertragungsrate in das Genom von C. elegans

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Hier wird eine Methode zur gezielten, markerlosen Genlöschung bei Chlamydia trachomatis mit Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenese, FLAEM beschrieben.

Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Ein CRISPR/Cas9-Mikroinjektions-Workflow für endogene fluoreszierende Markierung in der Keimlinie Caenorhabditis elegans , um homozygote Knock-in-Linien für die In-vivo-Proteinlokalisationsanalyse zu erhalten.

CRISPR/Cas9-vermittelte endogene fluoreszierende Markierung keimbahnspezifischer Gene in Caenorhabditis elegans

Die Anwendung der Elektrophysiologie, barrierefreie Synapsen eine quantifizierbare Messung der synaptischen Aktivität, nützlich bei der Analyse synaptischer Mutanten. Dieser Artikel beschreibt ein Dissektion Methode verwendet, um die motorischen Endplatten (NMJ) von...

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Lernen Sie die effiziente Transgenherstellung in C. elegans mittels Recombineering mit dem GalK-Selektionsmarker. Diese Methode bewahrt native regulatorische Elemente und ermöglicht präzise genetische Modifikationen für funktionale Analysen.

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