Name: Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Lernen Sie die Whole-Cell Patch-Clamp-Technik zur Aufnahme von CRAC-Strömen in menschlichen T-Lymphozyten. Diese Methode ermöglicht zuverlässige elektrophysiologische Messungen zur Untersuchung der Calcium-Signalgebung in Immunzellen.

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Wir sind dankbar, dass das Department of Physiology and Membrane Biology, University of California Davis, die uns mit Einrichtungen und ein ausgezeichnetes Umfeld für die Studien an Ionenkanälen.

1. Vorbereitung der Ruhe menschlichen T-Lymphozyten <ol><li> Mit RosetteSep Menschliche T-Zell-Anreicherung Cocktail und RosetteSep Density Medium, reinigen T-Zellen aus menschlichen Blutproben nach den Anweisungen des Herstellers. Die daraus resultierende Zellpopulation sollte 95% CD3 + ruhende T-Zellen. Wir reinigen menschlichen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blutproben von gesunden Freiwilligen in Übereinstimmung mit dem Protokoll von der UC Davis Internal Review Board genehmigt gesammelt. </li><li> Nach der Isolierung resuspendieren ruhende T-Zellen bei einer Dichte von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium RPMI-1640 Medium mit Glutamin und HEPES, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 2% Glutamax-I, 1% RPMI 1640 Vitamin-Lösung, 1% RPMI 1640 Aminosäuren-Lösung, 1% Natrium-Pyruvat und 0,03% β-Mercaptoethanol. </li><li> Legen Sie Zellsuspension in Zellkulturflaschen und pflegen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 bis zu 24 h vor dem Experiment. </li></ol> 2. Vorbereitung der Aufnahme Kammer <ol><li> Die folgenden sind notwendig, um die Aufnahme Kammern vorzubereiten: a) Silizium-O-Ringe, b) um, 25-mm Deckgläser mit 70% Ethanol und destilliertem H 2 O, C gereinigt) gemischt Sylgard184, zubereitet nach den Anweisungen des Herstellers, und d) zwei 60 x 15 mm Petrischalen. </li><li> Legen ~ 0,5 ml gemischt Sylgard184 in ein 60x15-mm-Petrischale. </li><li> Tauchen Sie den unteren Teil der O-Ring in die Sylgard184 mit einer Pinzette. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Sylgard184 vom Rand der O-Ring, indem Sie den O-Ring auf einer sauberen Fläche, wie eine weitere Petrischale. </li><li> Platzieren Sie den Ring auf das Deckglas und drücken Sie ihn nach unten. </li><li> Cure den Sylgard184 durch Erhitzen der Kammern bei 85 ° C für 40-60 min oder bis die Sylgard184 polymerisiert wird. </li><li> Bewahren Sie die Aufnahme Kammern in einem staubfreien Behälter. </li></ol> 3. Erstellung von Patch-Pipetten <ol><li> Am Tag des Experiments, ziehen Pipetten mit a ~ 2-um Spitzendurchmesser mit Glaskapillaren und einer Pipette Abzieher. Wir verwenden Borosilikat Schlauch mit Filament (OD: 1,5 mm und ID: 1,10 mm). Shop-Pipetten in einem staubfreien Ort. </li><li> Coat Pipettenspitzen mit Sylgard184 oder HIPEC R6101 Semiconductor Schutzschicht, nach einem Standard-Verfahren 9. </li><li> Gently Feuer-polish die Pipetten vor dem Experiment. </li></ol> 4. Patch-Clamp-Setup Vorbereitung <ol><li> Konfigurieren und speichern Sie die Makros für Gigaseal Bildung in der Software-Steuerung Ihres Patch-Clamp-Verstärker. Wir verwenden ein EPC-10-Verstärker von Windows XP und Pulse-Software für die Datenerfassung unterstützt. Wir setzen die "set-up", "on-cell" und "whole-cell"-Makros nach dem EPC-10 Bedienungsanleitung und verwenden Sie sie für alle Experimente. </li><li> Bereiten Bad-Lösungen und-Pipette Lösungen in Tabelle 1 aufgeführten vor dem Experiment und lagern Sie sie bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Chemicals </td><td colspan="3"> Bath Solutions (mM) </td><td> Pipette Solutions (mM) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-aspartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Lösungen für whole-cell CARC aktuelle Aufnahmen. Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO gekauft. <ol start="3"><li> Bestimmen Sie Flüssigkeitsverbindung Potentiale (LJ) zwischen der Patch-Pipette Lösung und jede Badlösung 10. Speichern Sie die LJ-Wert an der entsprechenden Stelle mit Ihrem Erwerb Software. Zum Beispiel in der Pulse-Programm legen Sie die LJ-Wert in "LJ" Kontrolle im "Amplifier"-Fenster. </li><li> Konfigurieren und speichern Sie die Stimulationsprotokolle, wie in Abbildung 1 gezeigt, an der entsprechenden Stelle Ihrer Software zur Erfassung, bevor die Experimente. In der Pulse-Programm setzen wir die Übernahme-Protokoll in der "Pulse Generation"-Fenster. <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. . Stimulationsprotokoll Spannungsrampe von -120 bis +100 mV von 50 ms Dauer wird alle 0,2 angewendet - 2 s (5 bis 0,5 Hz). Halten Potential (V h) zwischen Rampen ist bei +30 mV aufrechterhalten. </li></ol> 5. Montage Cells auf dem Mikroskoptisch <ol><li> Bestreichen Sie die Aufnahme Kammern mit Poly-L-Lysin für ~ 20 min und wäscht mit H 2 O und dann mit Hanks balanced salt solution (HBSS) vor dem Ausplattieren der Zellen. </li><li> Platte 500 ul Zellsuspension mit 0,2-0,5 x10 6 Zellen in die Kammer und inkubieren für 20 min bei 37 ° C. </li><li> Sichern Sie die Aufnahme Kammer mit der anhaftenden Zellen in eine Kammer Halter. Wir verwenden eine maßgeschneiderte Kammer Halter, wo die Basis unterstützt der Unterseite des Deckglases, während der obere Teil sanft drückt gegen die Oberseite des Deckglases. </li><li> Setzen Sie die Kammer Halter auf der Bühne des inversen Mikroskop. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Zellen im Durchlicht. Wir verwenden ein 40X Ölimmersionsobjektiv. </li><li> Legen Sie die Ag / AgCl-Referenzelektrode in die Wanne. </li><li> Richten Sie die mehrgehäusigen, Schwerkraft-Perfusion System. Die Spitze des Zulaufrohr sollte in einem 45 ° Winkel zur Deckglas in der Nähe des Sichtfeldes platziert werden. </li><li> Positionieren Sie den Saugschlauch gegenüber der Spitze des Zulaufrohr. </li><li> Versorgen die Kammer mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) oder HBSS abzuwaschen den Zellkulturmedien und lose anhaftenden Zellen. </li></ol> 6. CRAC-Channel Currents Recording <ol><li> Finden Sie eine Zelle, die fest mit dem Deckglas befestigt ist. Wir in der Regel wählen Sie einen durchschnittlich großen, runden Zellen mit einer glatten Außenfläche. </li><li> Versorgen die Aufnahme Kammer mit Ca 2 +-frei, 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 (Tabelle 1) mit 0,5-1 pM Thapsigargin für 8-10 min auf die SERCA-Pumpe blockieren. Wir führen diesen Schritt, um das Geschäft vor Gigaseal Bildung führen. </li><li> Mit einer Eppendorf Microloader und eine P-20 Pipette, füllen Sie die Patch-Pipette mit der Pipette Lösung (Tabelle 1) und legen Sie die Patch-Pipette in die Pipettenhalter am Verstärker headstage. Die Ca 2 +-Chelator BAPTA ist in der Pipette Lösung enthalten, passiv zum Abbau der zu speichern und Ca 2 +-abhängigen Inaktivierung CRAC Kanal zu reduzieren. </li><li> Eine kleine Menge von positivem Druck (~ 3 Zoll H 2 O) in der Patch-Pipette vor dem Betreten des Bades. Wir verwenden eine maßgeschneiderte Druck-Saug-Gerät, das an Druckluft-und Vakuum-Leitungen zu positiven oder negativen Druck innerhalb einer Patch-Pipette zu schaffen. </li><li> Senken Sie die Patch-Pipette in das Bad unter visueller Kontrolle über das Mikroskop. In der "Oszilloskop"-Fenster, sollten Sie einen Strom durch die Pipette. Eine Schritt-für, wie Änderung der Stromamplitude sollte durch eine kleine Amplitude Spannungsimpuls (Test-Impuls) durch die voreingestellten Makro angewendet induziert werden. Zu diesem Zeitpunkt sollte es möglich sein, den Wert der Pipette Widerstand zu bestimmen. Der Widerstand der Pipetten ist in der Regel 5-6 MOhm. </li><li> Korrigieren Sie die "Offset" Potential zwischen der Pipette und der Referenz-Elektrode erzeugt. </li><li> Unter visueller Kontrolle über das Mikroskop bringen die Pipettenspitze näher an die Zelle, bis sie die Zellmembran berührt. </li><li> Bewerben Unterdruck (20-40 cm H 2 O) in der Patch-Pipette. </li><li> Überwachen Sie die Gigaseal Bildung in der "Oszilloskop"-Fenster. Sie sehen die Amplitude des Stromes, durch den Test Puls sinkt und der Wert der Pipette Widerstand steigt auf&gt; 5 GOhm induziert. Normalerweise Gigaseal Formen innerhalb einer few Sekunden, aber es kann 1-2 min, um eine stabile Gigaseal erreichen. </li><li> Kompensieren Sie die Pipette Kapazität ("C-Fast"). </li><li> Break the patch Membran durch zusätzliche Unterdruck mittels einer 20 ml-Spritze. </li><li> Stellen Sie die Haltepotential bis +30 mV. Eine positive Haltepotential hilft, Calcium-abhängigen Inaktivierung CRAC Kanal zu verhindern. </li><li> Ausgleich für die Membran Kapazität der Zelle ("C-slow"); speichern oder notieren Sie den Wert von C-slow. </li><li> Überprüfen Sie den Wert des Zugangs Widerstand "R s". In unseren Experimenten ist die R s in der Regel 7-20 MOhm. </li><li> Starten Sie zu einer Reihe von Spannung Rampen mit einer Frequenz von 0,5 Hz (Abbildung 1) in Ca 2 +-freien 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung Nr. 1 gelten. In dieser Lösung ist CRAC aktuellen vernachlässigbar klein wie bei den "Leck" aktuellen aufgrund der schlechten Durchlässigkeit von CRAC Kanäle für Mg 2 + verglichen. Speichern und verwenden Sie die aktuelle Spuren in Badlösung Nr. 1 in zukünftigen Analysen aufgezeichnet als "Leck" Ströme. Die absolute Amplitude der "Leck" Strom bei -100 mV sollte weniger als oder gleich 5 pA. Wenn die Zelle "leaky", den Test beenden und neu zu beginnen mit einem neuen Patch-Pipette und eine neue Zelle. </li><li> Zur Aufnahme Ca 2 + Strom über CRAC Kanäle (I Ca-CRAC), ersetzen Ca 2 +-freien 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung Nr. 1 mit 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 (Tabelle 1) durch Einschalten der Perfusion Ventile. Dies ermöglicht eine Ca 2 + zu fließen über CRAC Kanäle und erzeugen eine nach innen gerichteten Strom. In der "Oszilloskop" Fenster, sehen Sie die Entwicklung von nach innen Behebung I Ca-CRAC (Abbildung 2). Die Stromamplitude bei negativen Spannungen wird weiterhin für ca. 1 min durch die Ca 2 +-abhängige Potenzierung der CRAC aktuellen erhöhen. </li><li> Erhöhen Sie die Frequenz der Stimulation mit Spannung Rampen bis 5 Hz, die notwendig sind, um die transiente Na + Strom über CRAC Kanäle aufnehmen wird. </li><li> Ersetzen Sie die 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 mit Na +-haltigem zweiwertiges Kation-freie Lösung # 3 (Tabelle 1) durch Einschalten der Perfusion Ventile. In der "Oszilloskop" Fenster, sehen Sie eine vorübergehende Entwicklung größerer Amplitude innerlich Behebung Na + Strom über die CRAC-Kanäle (I Na-CRAC; Abbildung 2). </li><li> Man kann gelten 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung Nr. 2 mit 1-5 uM La 3 + am Ende des Experiments, die "Leck" aktuellen Datensatz. Allerdings haben wir nicht finden, dieser Ansatz nützlich, da die "Leck" aktuelle Veränderungen im Laufe der Zeit und es kann größer oder kleiner werden am Ende des Experiments. Wir bevorzugen es, den Strom in der Ca 2 +-freien aufgezeichnet 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 am Anfang des Experiments als "Leck" Strom. Nehmen </li><li> Speichern Sie die aufgezeichneten Strom Spuren für die weitere Analyse. </li></ol> 7. Data Analysis <ol><li> Abrufen der gespeicherten aktuellen Datensätze in die Analyse-Software. Wir nutzen die Pulse-Programm für die Analyse. </li><li> Messen Sie den Strom Amplituden am Anfang und am Ende des Spannungsrampen. Wir messen typischerweise die Stromamplituden bei -100 mV und +100 mV unter Verwendung von Paaren von Cursor in die "Oszilloskop" Fenster der Pulse-Programm. </li><li> Exportieren Sie die Werte der Stromamplituden in ein Grafikprogramm zur weiteren Analyse und grafische Darstellung. Wir verwenden Origin Wissenschaftliche Visualisierungs-und Analyse-Software, Version 7. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. CRAC Ströme in einem ruhenden humanen T-Zell. (A), Zeitlicher Verlauf der CRAC Ströme in whole-cell Voltage-Clamp-Konfiguration bei -100 mV (gefüllte Kreise) und +100 mV (offene Kreise) aufgezeichnet. Vor Gigaseal Bildung, wurde die Zelle für ~ 10 min in Ca 2 +-freien vorinkubiert 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung Nr. 1 mit 0,5 uM Thapsigargin. Nach Einbruch, wurden Badlösungen nacheinander wie folgt angewandt: Ca 2 +-freien 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 (0 Ca + 3 Mg), gefolgt von 20 mM, gefolgt Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 (20 Ca), durch zweiwertige Kationen-freie Badlösung # 3 (DVF), gefolgt von Badlösung # 2 (20 Ca) gefolgt. Die Zelle wurde mit einer Reihe von Spannungsrampen wie in Abbildung 1 gezeigt, stimuliert. Die Häufigkeit der Rampen wurde 5 Hz in Badlösung # 3 (DVF) und 0,5 Hz in allen anderen Lösungen. Beachten Sie die langsame Entwicklung von I Ca-CRAC nach der Applikation von 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung Nr. 2 und die schnelle transiente Entwicklung von I Na-CRAC in DVF Badlösung Nr. 3. (B), Vertreter aktuellen Spuren während Spannungsrampen in Ca 2 +-freien aufgezeichnet 3 mM Mg 2 +-haltigen Badlösung # 1 ("Leck"), 20 mM Ca 2 +-haltigen Badlösung # 2 (20 Ca) und Badlösung # 3 (DVF). (C, D), Strom-Spannungs-Beziehungen von I Ca-CRAC (C) und ich Na-CRAC (D) durch Subtraktion "Leck" Strom aus der Strömung während des Spannungs-Rampen in 20 mM aufgezeichnet Ca 2 +-haltigen Bad erhalten Lösung # 2 (20 Ca) und Badlösung # 3 (DVF) in Panel dargestellt (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

Die elektrophysiologische Untersuchung von CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Zellen ist eine anspruchsvolle Aufgabe, da die endogene CRAC Stromamplitude in diesen Zellen ist wegen der geringen Größe der Zellen (die ruhende humane T-Zell-Durchmesser liegt im Bereich von 5-8 um). Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zuverlässig zu erfassen CRAC Ströme in Ruhe menschlichen T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen isoliert. Diese Technologie ermöglicht es uns, die Physiologie und funkt...

<table><tbody><tr><td>Koktail zur Anreicherung menschlicher T-Zellen mit RosetteSep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep-Dichtemittel</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640-Medium mit Glutamin/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>Fetalkalbserum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100×-Lösung)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Vitaminlösung für RPMI 1640 (100×)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>Aminosäurenlösung für 1640 (50×)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Inosit-trisphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Hydrobromid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Lanthanchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>HIPEC R6101 Halbleiterschutzlack</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63-500 Serie Hochleistungs-Vibrationsisolations-Labortisch</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>EPC 10 Patch-Clamp-Verstärker mit Kopfverstärker</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 1X71 inverses Mikroskop mit 40×-Ölimmersionsobjektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>Windows-Computer</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulse-Software</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin Scientific Graphing and Analysis Software</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch-Pipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borsilikatglas mit Filament (Außendurchmesser: 1,5 mm und Innendurchmesser: 1,10 mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Narashige&amp;rsquo;s Mikroföhn</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-O-Ringe</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell aufnahme von calcium release-activated calcium (crac) ströme in menschlichen t-lymphozyten

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T-Lymphozyten, die Erschöpfung des Ca 2 + aus den intrazellulären Ca 2 + zu speichern führt zur Aktivierung von plasmalemmal Ca 2 +-Kanäle, genannt Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Kanäle. CRAC-Kanäle spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der T-Zell-Proliferation und Genexpression. Abnormal CRAC-Kanal-Funktion in T-Zellen hat schwere kombinierte Immundefizienz und Autoimmunerkrankungen 1, 2 in Verbindung gebracht worden. Studieren CRAC-Kanal-Funktion in menschlichen T-Zellen können gemeinsam neue molekulare Regulationsmechanismen normalen Immunantwort und lösen die Ursachen verwandter Krankheiten beim Menschen. Elektrophysiologischen Ableitungen von Membran-Ströme liefern die genaue Beurteilung der funktionellen Kanal Eigenschaften und ihre Regulation. Elektrophysiologische Beurteilung der CRAC Kanal Ströme in Jurkat T-Zellen, einer menschlichen Leukämie-T-Zell-Linie, zuerst durchgeführt wurde mehr als 20 Jahren 3, jedoch bleibt CRAC Strommessungen in normalen menschlichen T-Zellen eine anspruchsvolle Aufgabe. Die Schwierigkeiten bei der Aufnahme CRAC Kanal Ströme in normalen T-Zellen werden durch die Tatsache, dass Blut gewonnene T-Lymphozyten viel kleiner als Jurkat T-Zellen und sind daher die endogene whole-cell CRAC Ströme sehr gering in der Amplitude zusammengesetzt sind. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, das wir regelmäßig verwenden, um die Ca 2 + Rekord oder Na +-Ströme über CRAC Kanäle in Ruhe menschlichen T-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden isoliert. Die hier beschriebene Methode wurde von den Verfahren für die Aufnahme der CRAC Ströme in Jurkat T-Zellen und aktivierten humanen T-Zellen 4-8 verwendet hat.

Wir bieten Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für whole-cell Patch-Clamp-Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in peripheren mononukleären Zellen gewonnenen humanen T-Lymphozyten.

Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten

In T-Lymphozyten führt die Verarmung des intrazellulären Ca2+-Speichers zur Aktivierung von plasmalemmalen Ca2+-Kanälen, sogenannten Calcium Release-Activated ...

Calciumfreisetzung-aktivierte Calciumkanäle oder CRAC-Kanäle, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, spielen eine wichtige Rolle bei der Proliferation von T-Zellen und der Genexpression. Die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren durch ein Antigen führt zur Bildung des sekundären Botenstoffes Adenosintriphosphat und zur Aktivierung der Calciumfreisetzung aus dem Speicher über Adenosin-RIF-phosphat-Rezeptoren. Die Abnahme der Calciumkonzentration im Speicher führt zur Aktivierung der CRAC-Kanäle und infolgedessen zu einem Anstieg der Calciumkonzentration im Cytosol. Störungen der CRAC-Kanal-Funktion in T-Zellen sind mit einer Reihe menschlicher Erkrankungen assoziiert, darunter schwere kombinierte Immundefizienzsyndrome und autoimmune Erkrankungen.Hier wird eine Methode vorgestellt, die eine zuverlässige und reproduzierbare Ableitung endogener Calcium- und Natrium-Crack-Kanalströme aus humanen T-Zellen ermöglicht. Zunächst wird FSA garin, ein Blocker der Sarkoendoplasmatischen Retikulum-Calcium-ATPase, in einer calciumfreien extrazellulären Lösung mit drei Millimolar Magnesium angewendet, um den Speicher zu entleeren.Dieses Verfahren öffnet Risskanäle, induziert jedoch keinen Rissstrom aufgrund der geringen Durchlässigkeit der Risskanäle für Magnesium. Anschließend wird ein Ganzzell-Spannungsclamp an einer T-Zellmembran etabliert. Die Zelle wird mit einer Pipettenlösung, die eine hohe Konzentration des Calciumchelators pta enthält, perfundiert.Lösungen, die Calcium enthalten oder frei von zweiwertigen Kationen sind, werden anschließend nacheinander appliziert, um messbare Calcium- und Natriumströme über Crack-Kanäle zu aktivieren. Die resultierenden Daten zeigen das Ausmaß der funktionellen Expression von Crack-Kanälen in ruhenden menschlichen T-Zellen. Die Untersuchung von Membranströmen über Crack-Kanäle könnte wertvolle Informationen über die Regulation und Funktionen von Crack-Kanälen liefern und die Rolle von Crack-Kanälen bei normalen Immunantworten sowie immunologischen Erkrankungen aufklären.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der geringen Größe menschlicher T-Lymphozyten und der geringen Amplitude endogener Crack-Ströme in diesen Zellen Schwierigkeiten. Die CD3-positiven menschlichen T-Lymphozyten für dieses Experiment wurden aus einer peripheren Blutprobe eines gesunden Spenders gewonnen und mittels eines menschlichen T-Zell-Anreicherungscocktails und TEP-Dichtemedium isoliert. Gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll wurden die Zellen in T-Zell-Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert.Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: Lösung Nummer eins, die drei Millimolar Magnesium und kein Calcium enthält; Lösung Nummer zwei, die 20 Millimolar Calcium enthält; Lösung Nummer drei, die 10 Millimolar Calciumchelator H-E-D-T-A und keine zweiwertigen Ionen enthält; sowie eine Pipettenlösung, die 12 Millimolar Calciumchelator bta enthält. Lagern Sie die Lösungen bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius. Ziehen Sie am Tag des Experiments Pipetten mit einem Tip-Durchmesser von etwa zwei Mikron mithilfe von Glas-Kapillaren und einem Pipettenzieher. Verwenden Sie Silikatglasrohre mit Filament und den hier gezeigten sowie im begleitenden Text aufgeführten Spezifikationen. Nach dem Ziehen werden die Pipettenspitzen mit einer halbleitenden Schutzschicht aus PEC R 61 0 1 beschichtet und feinpoliert. Lagern Sie sie an einem staubgeschützten Ort, beispielsweise in einem Pipettenhalter.Öffnen Sie hier die Software zur Steuerung des Patch-Clamp-Verstärkers. Ein E PC 10 Patch-Clamp-Verstärker wird über die Pulse-Software gesteuert. Konfigurieren und speichern Sie die Einstellungen für die Zell- und Ganzzell-Makros, die zur Bildung des Giga-Seals und zur Herstellung der Ganzzell-Konfiguration verwendet werden.Als Nächstes konfigurieren und speichern Sie im Aufnahmesoftware das Stimulationsprotokoll hier, um Crack-Ströme aufzuzeichnen. Das Aufnahmeprotokoll im Puls-Generierungs-Fenster wird als Spannungsrampe von minus 120 bis plus 100 Millivolt über eine Dauer von 50 Millisekunden eingestellt.Erstellen Sie zwei Stimulationsprotokolle mit Rampenspannungsstimulationsfrequenzen von 0,5 Hertz und fünf Hertz und speichern Sie diese im Puls-Generierungs-Fenster unter den Namen Rampeneins und Rampezwei jeweils. Um die Zellen für die Aufzeichnung vorzubereiten, geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension, die 0,2 bis 0,5 Millionen Zellen enthält, auf eine Aufzeichnungskammer, die aus einer mit Polylysin beschichteten Deckglasabdeckung mit einem befestigten Silikon-O-Ring besteht. Inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation befestigen Sie die Aufnahmekammer in einer Kammernhalterung. Hier wird eine speziell angefertigte Kammernhalterung verwendet, bei der der untere Teil die Deckglasunterlage an der Unterseite der Kammer stützt und der obere Teil gegen die Oberseite des Deckglases drückt. Stellen Sie die Kammernhalterung auf den Objekttisch des invertierten Mikroskops unter Verwendung eines 40x-Ölimmersionsobjektivs und Hellfeldbeleuchtung.Suchen Sie ein Feld von Zellen und fokussieren Sie. Bringen Sie die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in das Bad ein. Richten Sie dann ein mehrkanaliges, gravitationsgetriebenes Perfusionsystem aus, indem Sie die Spitze des Zulaufrohrs in einem Winkel von 45 Grad nahe am Deckglas und in der Nähe des Sichtfeldes positionieren; das Absaugrohr wird in den oberen Teil des Kammersitzes eingeführt.Drehen Sie den oberen Teil des Kammerhalters, bis das Saugrohr gegenüber dem Zuflussrohr steht, um den korrekten Kanal einzustellen. Die Stromaufnahmen beginnen, indem das Ventil am Perfusionsystem geöffnet wird, um die Aufnahmekammer mit kalziumfreier, 3 mmol Magnesium enthaltender Bat-Lösung Nummer eins zu perfundieren, die mit 0,5 bis 1 µM AP-Arnon für 8 bis 10 Minuten ergänzt wurde, um die Circa-Pumpe zu blockieren.Dieser Schritt erschöpft den Kalziumspeicher. Verwenden Sie danach einen Eior-Mikrolader mit einer P-20-Luftverdrängungspipette. Um die Pipette mit der Pipettierlösung zu füllen, setzen Sie die Pipette hier in den Halter auf der Verstärkerkopfplatte ein.Ein speziell angefertigtes Druck-Saug-Gerät wird an Druckluft und Vakuumleitungen angeschlossen. Um positiven oder negativen Druck in einer Patch-Pipette zu erzeugen, wird über das Verbindungsrohr die Pipette mit dem Ausgang des Druck-Saug-Geräts verbunden, wodurch ein geringer positiver Druck von etwa drei Zoll Wassersäule innerhalb der Pipette erzeugt wird. Klicken Sie auf die Setup-Steuerungstaste im EPC-10-Patch-Clamp-Fenster auf dem Computerbildschirm.Um das Setup-Makro auszuführen, finden Sie eine runde Zelle von durchschnittlicher Größe mit einer glatten Außenfläche, die fest am Deckglas haftet. Senken Sie dann die Patch-Elektrode unter visueller Kontrolle über das Mikroskop im Oszilloskop-Fenster in das Bad ab.Der durch die Pipette fließende Strom kann nach dem Eintauchen der Pipette in die Badlösung beobachtet werden. Eine sprunghafte Änderung der Stromamplitude wird durch den vom Setup-Makro an die Pipette angelegten Fünf-Millivolt-Spannungspuls hervorgerufen. Die Puls-Software berechnet automatisch den Pipettenwiderstand und zeigt ihn im Fenster für den Membranwiderstand an.Auf dem Computerbildschirm beträgt der Pipettenwiderstand gewöhnlich fünf bis sechs Megaohm. Klicken Sie auf die Automatik-Steuerungstaste im Verstärkerfenster auf dem Bildschirm, um das zwischen der Pipette und der Referenzelektrode entstandene Offset-Potential zu korrigieren. Der Basisstrom verschiebt sich auf einen Nullstrompegel.Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipettenspitze mit der Zellmembran in Kontakt zu bringen. Sobald der Kontakt hergestellt ist, wird die Amplitude des durch den Testimpuls hervorgerufenen Stroms abnehmen. Geben Sie einen negativen Druck von 20 bis 40 Zoll Wassersäule auf die Patch-Pipette. Überwachen Sie die Bildung des Giga-Seals im Oszilloskop-Fenster. Die Amplitude des durch den Testimpuls hervorgerufenen Stroms sollte allmählich abnehmen, während der Wert des Pipettenwiderstands auf mehr als fünf Gigaohm ansteigt. Gewöhnlich bildet sich der Giga-Seal-Kontakt schnell, es kann jedoch auch eine bis zwei Minuten dauern, bis ein stabiler Giga-Seal erreicht ist.Nachdem die Giga-Dichtung erreicht ist, trennen Sie den Pipettenhalter von der Drucksaugvorrichtung, indem Sie das Verbindungsrohr vom Auslass entfernen. Klicken Sie auf der Computerschnittstelle die Onsell-Steuerungstaste, um das Onsell-Makro auszuführen, das vor dem Experiment eingerichtet wurde. Gemäß der EPC-10-Anleitung kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie im cfat-Fenster auf die Automatik-Steuerungstaste klicken.Im Oszilloskop-Fenster wird der Stromtransient verschwinden und der Wert der Pipettenkapazität erscheint im cfat-Fenster, um die Zellmembran zu durchbrechen. Verbinden Sie innerhalb der Pipette die Pipette über das Verbindungsrohr mit einer 20 Kubikzentimeter großen Spritze und ziehen Sie den Kolben zurück, um zusätzlichen negativen Druck auf die Pipette auszuüben. Wenn die Zellmembran innerhalb der Pipette reißt, erscheinen zwei Stromtransienten, die die Zellmembran auf ein neues Spannungsniveau aufladen. Klicken Sie auf der Computerschnittstelle auf die Ganzzell-Steuerungstaste, um das voreingestellte Ganzzell-Makro auszuführen.Danach im V-Membran-Fenster +30 Millivolt für das Haltepotential eingeben; ein positives Haltepotential hilft, die kalziumabhängige Aktivierung von Risskanälen zu verhindern. Als Nächstes im C-slow-Fenster die Taste „Auto Control“ anklicken. Um die Zellkapazität im Oszilloskopfenster zu kompensieren, verschwindet der Stromtransient. Die Werte für die Zellkapazität und den Serienwiderstand werden jeweils in den Fenstern C slow und R series angezeigt. Der Serienwiderstand liegt typischerweise im Bereich von sieben bis 20 Mega. Die Werte von C slow, die den Werten der Zellkapazität entsprechen, liegen typischerweise im Bereich von 1,5 bis 2,5 Pikoferad.Bei ruhenden humanen T-Zellen klicken Sie in dem Oszilloskop-Fenster auf die Rampensteuerung, um eine Serie von Spannungsrampen mit einer Frequenz von 0,5 Hertz anzulegen. Dadurch wird das vor dem Experiment im Oszilloskop-Fenster erstellte und gespeicherte Stimulationsprotokoll ausgeführt. Die durch die Spannungsrampen hervorgerufenen Ströme werden angezeigt. Aufzeichnen.Diese Stromspuren in kalziumfreier Lösung Nummer eins, die drei Millimolar Magnesium enthält. In dieser Lösung ist der Crack-Strom aufgrund der geringen Durchlässigkeit der Crack-Kanäle für Magnesium Saban sehr gering. Verwenden Sie diese Spuren in zukünftigen Analysen als Leckströme.Die absolute Amplitude des Lecks bei minus 100 Millivolt sollte gleich oder kleiner als fünf pA sein. Falls die Zelle undicht ist, beenden Sie das Experiment und beginnen Sie erneut mit einer neuen Patch-Pipette und einer neuen Zelle.Wechseln Sie als Nächstes die Perfusionsventile, um die Badelektrolytlösung Nummer eins durch die Badelektrolytlösung Nummer zwei mit 20 Millimolar Calcium zu ersetzen, um den Kalziumstrom über Crack-Kanäle aufzuzeichnen. Dadurch können Kalziumionen über die Crack-Kanäle fließen und im Oszilloskopfenster einen einwärts gerichteten Strom erzeugen. Ein einwärts gerichteter Kalziumstrom über Crack-Kanäle entwickelt Stromamplitude bei negativen Spannungen und nimmt ungefähr eine Minute lang weiter zu, bedingt durch die kalziumabhängige Potenzierung des Crack-Stroms.Klicken Sie in dem Oszilloskop-Fenster auf die Ramp-Zwei-Steuerungstaste, um ein voreingestelltes Stimulationsprotokoll auszuführen, das die Stimulationsfrequenz mittels Spannungsrampen verändert, wobei die Frequenz um fünf Hertz erhöht wird. Diese Erhöhung der Stimulationsfrequenz hilft dabei, den maximalen Natriumstrom über Crack-Kanäle zu erfassen, der vorübergehender Natur ist. Wechseln Sie anschließend erneut die Perfusionsventile, um die Badlösung Nummer zwei durch die natriumhaltige, divalente-Kationen-freie Lösung Nummer drei im Oszilloskop-Fenster zu ersetzen. Ein vorübergehender, größerer nach innen gerichteter Natriumstrom über Crack-Kanäle entwickelt sich.Nach Beendigung des Experiments schließen Sie die Datei, wodurch die aufgezeichneten Stromspuren zur weiteren Analyse gespeichert werden. Rufen Sie die gespeicherten Stromdatensätze in eine Analyse-Software ab. Hier wird die Pulse-Software verwendet, um mithilfe von Cursorpaaren im Oszilloskop-Fenster des Pulse-Programms zu analysieren. Messen Sie hier die Stromamplituden zu Beginn und am Ende der Spannungsrampen.Die Stromamplituden werden bei minus 100 Millivolt und bei plus 100 Millivolt gemessen. Exportieren Sie die Werte der Stromamplituden in ein Grafikprogramm wie die Origin-Wissenschafts-Software für Grafikerstellung und Analyse. Für weitere Analysen und grafische Darstellungen wurden Crackströme in CD3-positiven ruhenden T-Zellen eines gesunden menschlichen Probanden mit der hier beschriebenen Methode gemessen; diese Abbildung zeigt einen Zeitverlauf von Crackströmen, die im Ganzzell-Spannungsclamp-Modus bei minus 100 Millivolt (angegeben durch die ausgefüllten Kreise) und bei plus 100 Millivolt (angegeben durch die offenen Kreise) aufgezeichnet wurden.Vor der Bildung des Giga-Seals wurde die Zelle für etwa 10 Minuten in kalziumfreier, 3 mmolarer Magnesium enthaltender Badlösung Nummer eins mit 0,5 Mikromolar Orthogon vorinkubiert. Die Lösungen wurden nacheinander wie folgt appliziert: kalziumfreie, 3 mmolare Magnesium enthaltende Badlösung Nummer eins, gefolgt von der 20 mmolaren Kalzium enthaltenden Badlösung Nummer zwei, gefolgt von der divalenten Kationen freien Badlösung Nummer drei, gefolgt von der 20 mmolaren Kalzium enthaltenden Badlösung Nummer zwei. Die Zelle wurde mit einer Serie von Spannungsrampen von minus 120 Millivolt bis plus 100 Millivolt wie hier gezeigt stimuliert.Spannungsrampen wurden alle 200 Millisekunden oder mit einer Frequenz von fünf Hertz in bat-Lösung Nummer drei ohne zweiwertige Kationen und alle zwei Sekunden oder mit einer Frequenz von 0,5 Hertz in allen anderen Lösungen angewendet. Beachten Sie die langsame Entwicklung des Calciumstroms über Crack-Kanäle nach Zugabe der bat-Lösung Nummer zwei, die 20 Millimolar Calcium enthält, sowie die schnelle transiente Entwicklung des Natriumstroms über Crack-Kanäle in bat-Lösung Nummer drei ohne zweiwertige Kationen. Diese Abbildung zeigt repräsentative Stromspuren, die während Spannungsrampen in kalziumfreier Lösung aufgezeichnet wurden.3 mM Magnesium enthaltende Badlösung Nummer eins, 20 mM Calcium enthaltende Badlösung Nummer zwei und divalente Kationen-freie Badlösung Nummer drei. Die Calcium- und Natriumstromspuren während der einzelnen Spannungsrampen können erhalten werden, indem die in calciumfreier, 3 mM Magnesium enthaltender Badlösung Nummer eins aufgezeichneten Ströme von den in 20 mM Calcium enthaltender Badlösung Nummer zwei und der divalenten Kationen-freien Badlösung Nummer drei gemessenen Strömen subtrahiert werden. Die resultierenden Stromspuren zeigen Strom-Spannungs-Beziehungen, die typisch sind für Calcium- und Natriumströme über Crack-Kanäle, wie hier dargestellt. Nachdem diese Technik beherrscht wurde und alle Schritte des Verfahrens ordnungsgemäß durchgeführt werden, können fünf bis zehn Zellen pro Tag aufgezeichnet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ruhestrom in humanen T-Zellen aufzeichnet. Mit dieser Methode sollten Sie außerdem in der Lage sein, korrekte Ströme in anderen Zellen des Immunsystems wie aktivierten humanen T-Zellen, Monozyten, Makrophagen sowie Zelllinien aufzuzeichnen. Elektrophysiologisch.Die Aufzeichnung von Crack-Kanalströmen in Zellen des Immunsystems könnte es Forschern ermöglichen, deren Rolle bei der Kalziumhomöostase in Immunzellen zu klären.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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