Whole-Cell Aufnahme von Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Ströme in menschlichen T-Lymphozyten

Calciumfreisetzung-aktivierte Calciumkanäle oder CRAC-Kanäle, die in der Plasmamembran lokalisiert sind, spielen eine wichtige Rolle bei der Proliferation von T-Zellen und der Genexpression. Die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren durch ein Antigen führt zur Bildung des sekundären Botenstoffes Adenosintriphosphat und zur Aktivierung der Calciumfreisetzung aus dem Speicher über Adenosin-RIF-phosphat-Rezeptoren. Die Abnahme der Calciumkonzentration im Speicher führt zur Aktivierung der CRAC-Kanäle und infolgedessen zu einem Anstieg der Calciumkonzentration im Cytosol. Störungen der CRAC-Kanal-Funktion in T-Zellen sind mit einer Reihe menschlicher Erkrankungen assoziiert, darunter schwere kombinierte Immundefizienzsyndrome und autoimmune Erkrankungen.

Hier wird eine Methode vorgestellt, die eine zuverlässige und reproduzierbare Ableitung endogener Calcium- und Natrium-Crack-Kanalströme aus humanen T-Zellen ermöglicht. Zunächst wird FSA garin, ein Blocker der Sarkoendoplasmatischen Retikulum-Calcium-ATPase, in einer calciumfreien extrazellulären Lösung mit drei Millimolar Magnesium angewendet, um den Speicher zu entleeren.

Dieses Verfahren öffnet Risskanäle, induziert jedoch keinen Rissstrom aufgrund der geringen Durchlässigkeit der Risskanäle für Magnesium. Anschließend wird ein Ganzzell-Spannungsclamp an einer T-Zellmembran etabliert. Die Zelle wird mit einer Pipettenlösung, die eine hohe Konzentration des Calciumchelators pta enthält, perfundiert.

Lösungen, die Calcium enthalten oder frei von zweiwertigen Kationen sind, werden anschließend nacheinander appliziert, um messbare Calcium- und Natriumströme über Crack-Kanäle zu aktivieren. Die resultierenden Daten zeigen das Ausmaß der funktionellen Expression von Crack-Kanälen in ruhenden menschlichen T-Zellen. Die Untersuchung von Membranströmen über Crack-Kanäle könnte wertvolle Informationen über die Regulation und Funktionen von Crack-Kanälen liefern und die Rolle von Crack-Kanälen bei normalen Immunantworten sowie immunologischen Erkrankungen aufklären.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der geringen Größe menschlicher T-Lymphozyten und der geringen Amplitude endogener Crack-Ströme in diesen Zellen Schwierigkeiten. Die CD3-positiven menschlichen T-Lymphozyten für dieses Experiment wurden aus einer peripheren Blutprobe eines gesunden Spenders gewonnen und mittels eines menschlichen T-Zell-Anreicherungscocktails und TEP-Dichtemedium isoliert. Gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll wurden die Zellen in T-Zell-Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator kultiviert.

Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: Lösung Nummer eins, die drei Millimolar Magnesium und kein Calcium enthält; Lösung Nummer zwei, die 20 Millimolar Calcium enthält; Lösung Nummer drei, die 10 Millimolar Calciumchelator H-E-D-T-A und keine zweiwertigen Ionen enthält; sowie eine Pipettenlösung, die 12 Millimolar Calciumchelator bta enthält. Lagern Sie die Lösungen bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius. Ziehen Sie am Tag des Experiments Pipetten mit einem Tip-Durchmesser von etwa zwei Mikron mithilfe von Glas-Kapillaren und einem Pipettenzieher.

Verwenden Sie Silikatglasrohre mit Filament und den hier gezeigten sowie im begleitenden Text aufgeführten Spezifikationen. Nach dem Ziehen werden die Pipettenspitzen mit einer halbleitenden Schutzschicht aus PEC R 61 0 1 beschichtet und feinpoliert. Lagern Sie sie an einem staubgeschützten Ort, beispielsweise in einem Pipettenhalter.

Öffnen Sie hier die Software zur Steuerung des Patch-Clamp-Verstärkers. Ein E PC 10 Patch-Clamp-Verstärker wird über die Pulse-Software gesteuert. Konfigurieren und speichern Sie die Einstellungen für die Zell- und Ganzzell-Makros, die zur Bildung des Giga-Seals und zur Herstellung der Ganzzell-Konfiguration verwendet werden.

Als Nächstes konfigurieren und speichern Sie im Aufnahmesoftware das Stimulationsprotokoll hier, um Crack-Ströme aufzuzeichnen. Das Aufnahmeprotokoll im Puls-Generierungs-Fenster wird als Spannungsrampe von minus 120 bis plus 100 Millivolt über eine Dauer von 50 Millisekunden eingestellt.

Erstellen Sie zwei Stimulationsprotokolle mit Rampenspannungsstimulationsfrequenzen von 0,5 Hertz und fünf Hertz und speichern Sie diese im Puls-Generierungs-Fenster unter den Namen Rampeneins und Rampezwei jeweils. Um die Zellen für die Aufzeichnung vorzubereiten, geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension, die 0,2 bis 0,5 Millionen Zellen enthält, auf eine Aufzeichnungskammer, die aus einer mit Polylysin beschichteten Deckglasabdeckung mit einem befestigten Silikon-O-Ring besteht. Inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation befestigen Sie die Aufnahmekammer in einer Kammernhalterung. Hier wird eine speziell angefertigte Kammernhalterung verwendet, bei der der untere Teil die Deckglasunterlage an der Unterseite der Kammer stützt und der obere Teil gegen die Oberseite des Deckglases drückt. Stellen Sie die Kammernhalterung auf den Objekttisch des invertierten Mikroskops unter Verwendung eines 40x-Ölimmersionsobjektivs und Hellfeldbeleuchtung.

Suchen Sie ein Feld von Zellen und fokussieren Sie. Bringen Sie die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in das Bad ein. Richten Sie dann ein mehrkanaliges, gravitationsgetriebenes Perfusionsystem aus, indem Sie die Spitze des Zulaufrohrs in einem Winkel von 45 Grad nahe am Deckglas und in der Nähe des Sichtfeldes positionieren; das Absaugrohr wird in den oberen Teil des Kammersitzes eingeführt.

Drehen Sie den oberen Teil des Kammerhalters, bis das Saugrohr gegenüber dem Zuflussrohr steht, um den korrekten Kanal einzustellen. Die Stromaufnahmen beginnen, indem das Ventil am Perfusionsystem geöffnet wird, um die Aufnahmekammer mit kalziumfreier, 3 mmol Magnesium enthaltender Bat-Lösung Nummer eins zu perfundieren, die mit 0,5 bis 1 µM AP-Arnon für 8 bis 10 Minuten ergänzt wurde, um die Circa-Pumpe zu blockieren.

Dieser Schritt erschöpft den Kalziumspeicher. Verwenden Sie danach einen Eior-Mikrolader mit einer P-20-Luftverdrängungspipette. Um die Pipette mit der Pipettierlösung zu füllen, setzen Sie die Pipette hier in den Halter auf der Verstärkerkopfplatte ein.

Ein speziell angefertigtes Druck-Saug-Gerät wird an Druckluft und Vakuumleitungen angeschlossen. Um positiven oder negativen Druck in einer Patch-Pipette zu erzeugen, wird über das Verbindungsrohr die Pipette mit dem Ausgang des Druck-Saug-Geräts verbunden, wodurch ein geringer positiver Druck von etwa drei Zoll Wassersäule innerhalb der Pipette erzeugt wird. Klicken Sie auf die Setup-Steuerungstaste im EPC-10-Patch-Clamp-Fenster auf dem Computerbildschirm.

Um das Setup-Makro auszuführen, finden Sie eine runde Zelle von durchschnittlicher Größe mit einer glatten Außenfläche, die fest am Deckglas haftet. Senken Sie dann die Patch-Elektrode unter visueller Kontrolle über das Mikroskop im Oszilloskop-Fenster in das Bad ab.

Der durch die Pipette fließende Strom kann nach dem Eintauchen der Pipette in die Badlösung beobachtet werden. Eine sprunghafte Änderung der Stromamplitude wird durch den vom Setup-Makro an die Pipette angelegten Fünf-Millivolt-Spannungspuls hervorgerufen. Die Puls-Software berechnet automatisch den Pipettenwiderstand und zeigt ihn im Fenster für den Membranwiderstand an.

Auf dem Computerbildschirm beträgt der Pipettenwiderstand gewöhnlich fünf bis sechs Megaohm. Klicken Sie auf die Automatik-Steuerungstaste im Verstärkerfenster auf dem Bildschirm, um das zwischen der Pipette und der Referenzelektrode entstandene Offset-Potential zu korrigieren. Der Basisstrom verschiebt sich auf einen Nullstrompegel.

Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipettenspitze mit der Zellmembran in Kontakt zu bringen. Sobald der Kontakt hergestellt ist, wird die Amplitude des durch den Testimpuls hervorgerufenen Stroms abnehmen. Geben Sie einen negativen Druck von 20 bis 40 Zoll Wassersäule auf die Patch-Pipette.

Überwachen Sie die Bildung des Giga-Seals im Oszilloskop-Fenster. Die Amplitude des durch den Testimpuls hervorgerufenen Stroms sollte allmählich abnehmen, während der Wert des Pipettenwiderstands auf mehr als fünf Gigaohm ansteigt. Gewöhnlich bildet sich der Giga-Seal-Kontakt schnell, es kann jedoch auch eine bis zwei Minuten dauern, bis ein stabiler Giga-Seal erreicht ist.

Nachdem die Giga-Dichtung erreicht ist, trennen Sie den Pipettenhalter von der Drucksaugvorrichtung, indem Sie das Verbindungsrohr vom Auslass entfernen. Klicken Sie auf der Computerschnittstelle die Onsell-Steuerungstaste, um das Onsell-Makro auszuführen, das vor dem Experiment eingerichtet wurde. Gemäß der EPC-10-Anleitung kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie im cfat-Fenster auf die Automatik-Steuerungstaste klicken.

Im Oszilloskop-Fenster wird der Stromtransient verschwinden und der Wert der Pipettenkapazität erscheint im cfat-Fenster, um die Zellmembran zu durchbrechen. Verbinden Sie innerhalb der Pipette die Pipette über das Verbindungsrohr mit einer 20 Kubikzentimeter großen Spritze und ziehen Sie den Kolben zurück, um zusätzlichen negativen Druck auf die Pipette auszuüben. Wenn die Zellmembran innerhalb der Pipette reißt, erscheinen zwei Stromtransienten, die die Zellmembran auf ein neues Spannungsniveau aufladen. Klicken Sie auf der Computerschnittstelle auf die Ganzzell-Steuerungstaste, um das voreingestellte Ganzzell-Makro auszuführen.

Danach im V-Membran-Fenster +30 Millivolt für das Haltepotential eingeben; ein positives Haltepotential hilft, die kalziumabhängige Aktivierung von Risskanälen zu verhindern. Als Nächstes im C-slow-Fenster die Taste „Auto Control“ anklicken. Um die Zellkapazität im Oszilloskopfenster zu kompensieren, verschwindet der Stromtransient.

Die Werte für die Zellkapazität und den Serienwiderstand werden jeweils in den Fenstern C slow und R series angezeigt. Der Serienwiderstand liegt typischerweise im Bereich von sieben bis 20 Mega. Die Werte von C slow, die den Werten der Zellkapazität entsprechen, liegen typischerweise im Bereich von 1,5 bis 2,5 Pikoferad.

Bei ruhenden humanen T-Zellen klicken Sie in dem Oszilloskop-Fenster auf die Rampensteuerung, um eine Serie von Spannungsrampen mit einer Frequenz von 0,5 Hertz anzulegen. Dadurch wird das vor dem Experiment im Oszilloskop-Fenster erstellte und gespeicherte Stimulationsprotokoll ausgeführt. Die durch die Spannungsrampen hervorgerufenen Ströme werden angezeigt. Aufzeichnen.

Diese Stromspuren in kalziumfreier Lösung Nummer eins, die drei Millimolar Magnesium enthält. In dieser Lösung ist der Crack-Strom aufgrund der geringen Durchlässigkeit der Crack-Kanäle für Magnesium Saban sehr gering. Verwenden Sie diese Spuren in zukünftigen Analysen als Leckströme.

Die absolute Amplitude des Lecks bei minus 100 Millivolt sollte gleich oder kleiner als fünf pA sein. Falls die Zelle undicht ist, beenden Sie das Experiment und beginnen Sie erneut mit einer neuen Patch-Pipette und einer neuen Zelle.

Wechseln Sie als Nächstes die Perfusionsventile, um die Badelektrolytlösung Nummer eins durch die Badelektrolytlösung Nummer zwei mit 20 Millimolar Calcium zu ersetzen, um den Kalziumstrom über Crack-Kanäle aufzuzeichnen. Dadurch können Kalziumionen über die Crack-Kanäle fließen und im Oszilloskopfenster einen einwärts gerichteten Strom erzeugen. Ein einwärts gerichteter Kalziumstrom über Crack-Kanäle entwickelt Stromamplitude bei negativen Spannungen und nimmt ungefähr eine Minute lang weiter zu, bedingt durch die kalziumabhängige Potenzierung des Crack-Stroms.

Klicken Sie in dem Oszilloskop-Fenster auf die Ramp-Zwei-Steuerungstaste, um ein voreingestelltes Stimulationsprotokoll auszuführen, das die Stimulationsfrequenz mittels Spannungsrampen verändert, wobei die Frequenz um fünf Hertz erhöht wird. Diese Erhöhung der Stimulationsfrequenz hilft dabei, den maximalen Natriumstrom über Crack-Kanäle zu erfassen, der vorübergehender Natur ist. Wechseln Sie anschließend erneut die Perfusionsventile, um die Badlösung Nummer zwei durch die natriumhaltige, divalente-Kationen-freie Lösung Nummer drei im Oszilloskop-Fenster zu ersetzen. Ein vorübergehender, größerer nach innen gerichteter Natriumstrom über Crack-Kanäle entwickelt sich.

Nach Beendigung des Experiments schließen Sie die Datei, wodurch die aufgezeichneten Stromspuren zur weiteren Analyse gespeichert werden. Rufen Sie die gespeicherten Stromdatensätze in eine Analyse-Software ab. Hier wird die Pulse-Software verwendet, um mithilfe von Cursorpaaren im Oszilloskop-Fenster des Pulse-Programms zu analysieren. Messen Sie hier die Stromamplituden zu Beginn und am Ende der Spannungsrampen.

Die Stromamplituden werden bei minus 100 Millivolt und bei plus 100 Millivolt gemessen. Exportieren Sie die Werte der Stromamplituden in ein Grafikprogramm wie die Origin-Wissenschafts-Software für Grafikerstellung und Analyse. Für weitere Analysen und grafische Darstellungen wurden Crackströme in CD3-positiven ruhenden T-Zellen eines gesunden menschlichen Probanden mit der hier beschriebenen Methode gemessen; diese Abbildung zeigt einen Zeitverlauf von Crackströmen, die im Ganzzell-Spannungsclamp-Modus bei minus 100 Millivolt (angegeben durch die ausgefüllten Kreise) und bei plus 100 Millivolt (angegeben durch die offenen Kreise) aufgezeichnet wurden.

Vor der Bildung des Giga-Seals wurde die Zelle für etwa 10 Minuten in kalziumfreier, 3 mmolarer Magnesium enthaltender Badlösung Nummer eins mit 0,5 Mikromolar Orthogon vorinkubiert. Die Lösungen wurden nacheinander wie folgt appliziert: kalziumfreie, 3 mmolare Magnesium enthaltende Badlösung Nummer eins, gefolgt von der 20 mmolaren Kalzium enthaltenden Badlösung Nummer zwei, gefolgt von der divalenten Kationen freien Badlösung Nummer drei, gefolgt von der 20 mmolaren Kalzium enthaltenden Badlösung Nummer zwei. Die Zelle wurde mit einer Serie von Spannungsrampen von minus 120 Millivolt bis plus 100 Millivolt wie hier gezeigt stimuliert.

Spannungsrampen wurden alle 200 Millisekunden oder mit einer Frequenz von fünf Hertz in bat-Lösung Nummer drei ohne zweiwertige Kationen und alle zwei Sekunden oder mit einer Frequenz von 0,5 Hertz in allen anderen Lösungen angewendet. Beachten Sie die langsame Entwicklung des Calciumstroms über Crack-Kanäle nach Zugabe der bat-Lösung Nummer zwei, die 20 Millimolar Calcium enthält, sowie die schnelle transiente Entwicklung des Natriumstroms über Crack-Kanäle in bat-Lösung Nummer drei ohne zweiwertige Kationen. Diese Abbildung zeigt repräsentative Stromspuren, die während Spannungsrampen in kalziumfreier Lösung aufgezeichnet wurden.

3 mM Magnesium enthaltende Badlösung Nummer eins, 20 mM Calcium enthaltende Badlösung Nummer zwei und divalente Kationen-freie Badlösung Nummer drei. Die Calcium- und Natriumstromspuren während der einzelnen Spannungsrampen können erhalten werden, indem die in calciumfreier, 3 mM Magnesium enthaltender Badlösung Nummer eins aufgezeichneten Ströme von den in 20 mM Calcium enthaltender Badlösung Nummer zwei und der divalenten Kationen-freien Badlösung Nummer drei gemessenen Strömen subtrahiert werden. Die resultierenden Stromspuren zeigen Strom-Spannungs-Beziehungen, die typisch sind für Calcium- und Natriumströme über Crack-Kanäle, wie hier dargestellt.

Nachdem diese Technik beherrscht wurde und alle Schritte des Verfahrens ordnungsgemäß durchgeführt werden, können fünf bis zehn Zellen pro Tag aufgezeichnet werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Ruhestrom in humanen T-Zellen aufzeichnet. Mit dieser Methode sollten Sie außerdem in der Lage sein, korrekte Ströme in anderen Zellen des Immunsystems wie aktivierten humanen T-Zellen, Monozyten, Makrophagen sowie Zelllinien aufzuzeichnen. Elektrophysiologisch.

Die Aufzeichnung von Crack-Kanalströmen in Zellen des Immunsystems könnte es Forschern ermöglichen, deren Rolle bei der Kalziumhomöostase in Immunzellen zu klären.