Name: Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Lernen Sie die Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark mittels Percoll-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellpopulationen im ZNS.

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Diese Arbeit wurde von der National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T, um AEC) und der University of Texas at San Antonio unterstützt.

Vorbereitung der Reagenzien Bereiten Lager isotonischen Percoll (SIP), 4 ml pro Gehirn, indem man 9 Teile Percoll mit einem Teil 10X HBSS ohne Ca + + und Mg + +. Bereiten Sie SIP bei 70% in 1X HBSS ohne Ca + + und Mg + +, 2 ml pro Kopf in einen 15 ml-Polypropylen-konischen Rohr verzichtet. Hinweis: Es wird empfohlen, Percoll bei Raumtemperatur verwendet werden sollte, falls verwendet Kälte, neigen Zellen zu verklumpen und Zellseparation ist weniger effizient. Tissue-Sammlung und Homogenisierung Anesthetize Mäusen und perfuse durch den linken Ventrikel mit eiskaltem 1X HBSS. Dissect Gehirn und Rückenmark und zu pflegen in RPMI ohne Phenolrot, bis alle Mäuse getötet werden. Legen Gewebe in 7 oder 15 ml Dounce Homogenisator mit 3 ml RPMI sanft eine Zellsuspension mit einer locker sitzenden Pistill (A-Größe) durch eine Oberschenkel-Montage Stößel (B Größe) zur weiteren distanzieren Gewebe gefolgt. Füllen Sie das Volumen des Zell-Suspensionen zu 7 ml mit RPMI. Gradient einrichten 3 ml SIP zu der Zellsuspension zu einer endgültigen 30% SIP machen Langsam Schicht der 10 mL Zellsuspension auf dem 70% SIP. Dies ist der wichtigste Schritt des Verfahrens, Verwendung einer Pipette-Hilfe in der Schwere-Modus zu vermeiden Mischen von 70% und 30%-Lösungen gesetzt. Eine sehr klare flache Linie sichtbar sein soll an die 70% -30%-Übergang. Zentrifuge 30 min bei 500G 18 ° C. Stellen Sie sicher, Zentrifuge wird mit minimalen oder keinen Bremse zu stoppen, so dass die Interphase nicht gestört wird. Mit einem Transfer-Pipette vorsichtig ab, die Schicht der Ablagerungen aus dem oberen Ende des Röhrchens sammeln und 2,0-3,0 ml der 70% -30% der Interphase in ein sauberes konisches Rohr mit 8 ml 1X HBSS. Stellen Sie sicher, dass die Percoll mit der Interphase etwa das Dreifache verdünnt wird, mischen ein paar Mal durch Umdrehen und centrifugre 7 min bei 500G bei 18 ° C. Pellet in 1 ml der Zell-Färbepuffer und überträgt es auf eine 1,5 ml-Tube und waschen ein weiteres Mal mit einem Mikro-Zentrifuge bei 10.000 G 1 min bei 4 ° C. Antikörper-Färbung Resuspendieren Pellets in 50 ul des gereinigten anti-Maus CD16/CD32 verdünnt 1:200 in Zelle Färbepuffer an den Fc-Bindungsstellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Add 50 ul Antikörper-Cocktail-Mix und Inkubation auf Eis für 30 min. Jeder Antikörper zunächst titriert werden, um eine optimale Verdünnung zu beurteilen. Verwenden Sie geeignete Fluorochrom Kombinationen ausgewählt nach den Möglichkeiten der Laser-und Filter-Einstellungen Ihres jeweiligen Durchflusszytometer. Wash-Zellen in Zellen Färbepuffer, resuspendieren Pellets in 100-200 ul der Zelle Färbepuffer und analysieren sofort im Durchflusszytometer oder alternativ Zellen können in 2% Paraformaldehyd (PFA) in PBS resuspendiert vorbereitet und gespeichert werden über Nacht bei 4 ° C . Repräsentative Ergebnisse: Nach dem Spinnen der Gradienten, sollte die 70% -30% der Interphase haben einen definierten weißen Heiligenschein, und die Quantifizierung der Zellen aus einer naiven Maus erholt sollte 3-5 x10 5 Zellen pro Maus (Gehirn und Rückenmark) zu ergeben. Entzündete Gehirn haben könnte reichen Zahl der Entzündungszellen in Abhängigkeit von der ZNS-Beleidigung oder Krankheit Modell (Abbildung 1). <img src="/files/ftp_upload/2348/2348fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Isolierung von mononukleären Zellen aus naiven und EAE-Hirn-zu Spitzenzeiten Krankheit. Gehirnzellen Suspensionen wurden über diskontinuierliche 70% / 30% Percoll Gradienten getrennt. Zellen gefärbt wurden mit Fc-Block inkubiert, gefolgt von anti-CD45-Antikörper für 30 min auf Eis. Die Zellen wurden in Zellfärbung Puffer gespült und fest in 2% PFA vor Übernahme in ein LSR-II. CD45 Intensität ist in der Y-Achse, wo drei unterschiedliche Populationen visualisiert werden gemessen. Die weitere Charakterisierung der Immunabwehr Phänotyp CD45 hallo infiltrierenden Zellen erfolgt über zusätzliche Antikörper und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.

<ol><li>Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+activation+and+proliferation+precedes+the+onset+of+CNS+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity.</a> J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Juedes, A. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+and+infiltrating+central+nervous+system+APCs+regulate+the+emergence+and+resolution+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tickets+to+the+brain%3A+Role+of+CCR2+and+CX%283%29CR1+in+myeloid+cell+entry+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS.</a> J Neuroimmunol. , (2010).</li>
<li>Mildner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+adult+brain+arise+from+Ly-6ChiCCR2%2B+monocytes+only+under+defined+host+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions.</a> Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).</li>
<li>Djukic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+monocytes+engraft+in+the+brain%2C+differentiate+into+microglia+and+contribute+to+the+pathology+following+meningitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice.</a> Brain. 129, 2394-2403 (2006).</li>
</ol>

Analysen von Zelloberflächenmarker in CNS Leukozyten aus normalen und entzündeten Mausgeweben seit mehreren Jahrzehnten 1-3 verwendet worden. Isolation Protokolle sind in der Trennung von Mikroglia und Leukozyten durch Dichtezentrifugation 4. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zur Isolierung von CNS Leukozyten mit diskontinuierlichen Percoll-Gradienten. Nach der Isolierung von Zellen, Färbung mit verschiedenen Antikörpern wie, aber nicht beschränkt auf-CD45 ermöglicht CD4, CD8...

Tissue Homogenisierung und Farbverläufe <ul><li> Percoll (Amersham) </li><li> 10x Hanks Balanced Salt Solution, ohne Calcium und Magnesium (Gibco) </li><li> RPMI Medium 1640, ohne Phenolrot (Gibco) </li><li> 7-ml-oder 15-ml Dounce Tissue Grinder (VWR) </li></ul> Durchflusszytometrie <ul><li> Zellfärbung Buffer (Biolegend) </li><li> Gereinigtem Ratten Anti-Mouse CD16/CD32 (Maus BD Fc Block), BD Pharmingen </li><li> Hämazytometer (Fisher) </li><li> Anti-Maus-CD45 (Klon 30-F11), CD4 (Klon RM4-5), CD19 (Klon 6D5), BioLegend </li><li> 10X Phosphate Buffered Saline, ohne Calcium und Magnesium (Thermo Scientific) </li><li> Paraformaldehyd (Sigma Aldrich) </li><li> Durchflusszytometrie-Analyse mit einer LSR II (BD Biosciences) durchgeführt </li></ul>

isolierung von brain and spinal cord mononukleären zellen mit percoll gradienten

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolierung von Immunzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) während der Infektion, Trauma, Autoimmunität oder Neurodegeneration zu infiltrieren, ist oft erforderlich, um ihren Phänotyp und Effektor-Funktionen zu definieren. Histochemische Ansätze sind instrumental, um die Lage der infiltrierenden Zellen zu bestimmen und die damit verbundenen ZNS-Pathologie zu analysieren. Allerdings sind in-situ Histochemie und Immunfluoreszenzfärbung Techniken durch die Anzahl der Antikörper, die zu einem einzigen Zeitpunkt genutzt werden, um Immunzellen Subtypen in einem bestimmten Gewebe zu charakterisieren können, beschränkt. Daher sind histologische Ansätze in Verbindung mit Immun-Phänotypisierung mittels Durchflusszytometrie kritischen vollständig zu charakterisieren die Zusammensetzung der lokalen ZNS Infiltration. Dieses Protokoll basiert auf der Trennung von ZNS-Zellsuspensionen über diskontinuierliche Percoll Gradienten basiert. Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für die Identifizierung von verschiedenen Immunzellen Populationen in einer einzigen Probe mittels Durchflusszytometrie verwendet werden kann.

Der aktuelle Artikel beschreibt eine schnelle Protokoll zur effizienten Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark Gewebe, die effektiv für den durchflusszytometrischen Analysen genutzt werden können.

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Die Isolierung von Immunzellen, die während einer Infektion, eines Traumas, einer Autoimmunerkrankung oder einer Neurodegeneration in das Zentralnervensystem (ZNS) infiltrieren, ist häufig erforderlich ...

Immunzellen dringen während einer Infektion, nach einem Trauma, bei Autoimmunerkrankungen oder bei Neurodegeneration in das zentrale Nervensystem ein. Während histochemische Methoden verwendet werden können, um den Ort der eindringenden Zellen zu bestimmen und die assoziierte Pathologie zu analysieren, sind diese Techniken durch die Anzahl der gleichzeitig verwendbaren Antikörper begrenzt. Hier wird eine Methode zur schnellen Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn- und Rückenmarkgewebe gezeigt, bei der das präparierte Gewebe zunächst homogenisiert wird.Anschließend wird ein Percoll-Gradient hergestellt und nach der Zentrifugation werden die mononukleären Zellen von der Grenzschicht gesammelt. Abschließend werden die Zellen gewaschen und mit Antikörpern markiert. Mithilfe der Durchflusszytometrie-Analyse lassen sich hämatogene Zellen und Überwachungs-Mikroglia unterscheiden, und ihre relativen Anteile während krankhafter Zustände können bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Aris-Gradienten oder der histologischen Färbung besteht darin, dass sie zeitsparender ist.Dies ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung einer größeren Anzahl von Gewebeproben. Die Einrichtung des Gradienten wird von Palino A, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie die Reagenzien vor, die für dieses Protokoll benötigt werden. Beginnen Sie mit vier Millilitern isotonischem Stock-Perohl, bezeichnet als SIP, pro Gehirn.Um dies durchzuführen, mischen Sie neun Teile Perol mit einem Teil 10× HBSS ohne Calcium und Magnesium durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen. Bereiten Sie anschließend 70 % Per Call vor, indem Sie das vorbereitete SIP mit 1× HBSS ohne Calcium und Magnesium vermischen. Geben Sie dann zwei Milliliter der 70 % Per Cole in ein 15-Milliliter-Polypropylen-Konizfläschchen, um das Gewebe zu sammeln.Legen Sie für diesen Vorgang die entnommenen Gehirne und Rückenmarkstücke aller Versuchsmäuse in Becher, die 10 Milliliter RPMI auf Eis enthalten. Überführen Sie anschließend das Gewebe in einen 7- oder 15-Milliliter-Down-Homogenisator, der 3 Milliliter 1× HBSS enthält, und verwenden Sie zunächst einen locker sitzenden Stößel. Vorsichtig wird eine Zellsuspension hergestellt, danach wechselt man zu einem eng sitzenden Stößel der Größe B und dissoziiert das Gewebe weiter.Nachdem das Gewebe homogenisiert wurde, fügen Sie RPMI oder einmaliges HBSS bis zu einem Endvolumen von sieben Millilitern hinzu und fahren Sie mit dem Aufbau des Gradienten für den Percoll-Gradienten fort. Beginnen Sie damit, drei Milliliter SIP zur Zellsuspension hinzuzufügen, um eine endgültige PERCOLL-Konzentration von 30 % zu erreichen. Beachten Sie, dass das Perkol bei Raumtemperatur verwendet werden sollte. Falls es kalt verwendet wird, neigen die Zellen dazu, sich zusammenzulagern, und die Zellseparation ist weniger effizient.Danach die 10 Milliliter Zellsuspension unter Verwendung des Pipettierhilfsgeräts im Schwerkraftmodus langsam auf die 70 % SIP aufschichten. Dabei vermeiden, dass die 70 %ige und die 30 %ige Lösung vermischt werden. Dies ist der kritischste Schritt des Verfahrens.Eine sehr klare, gerade Linie sollte an der Grenze zwischen 70 % und 30 % sichtbar sein. In der Regel haben Anfänger Schwierigkeiten, da sich die dritte Lösung und die 70 %-Lösung während des Schichtens vermischen können. Im nächsten Schritt die Zentrifugation unter Erhalt der Grenzfläche: 30 Minuten bei 500 × g und 18 Grad Celsius.Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge mit minimaler oder keiner Bremsung stoppt, damit die Grenzfläche nicht gestört wird. Nach dem Zentrifugieren der Gradienten sollte sich eine dicke, viskose Schicht aus Trümmern an der Oberseite des Röhrchens ansammeln. Die nächste Schicht ist die gelbliche 30%-Per-Core-Schicht, die manchmal Rückstände enthält.Als Nächstes folgt die Grenzfläche zwischen 70 % und 30 %, die einen definierten weißen Hof aufweisen sollte und die mononukleären Zellen enthält. Ganz unten im Gefäß befindet sich schließlich die klare 70 % Percol-Schicht. Wenn keine Grenzfläche sichtbar ist, wird die Zellausbeute vermutlich sehr gering sein, was eine weitere Analyse äußerst schwierig macht.Daher müssen zu diesem Zeitpunkt möglicherweise frische Zellsuspensionen verwendet werden, um die Kontamination zu verringern. Entfernen Sie vorsichtig die Debrisschicht von der Oberseite des Röhrchens und entsorgen Sie sie. Anschließend führen Sie eine Plastikpipette durch die oberen 30 % jeder Kernschicht und sammeln zwei bis drei Milliliter der 70-30-Interphase, die Sie in ein sauberes kegelförmiges Röhrchen mit acht Milliliter einmaliger HBSS überführen.Mischen Sie die verdünnten Phasen mehrmals durch Umstülpen und zentrifugieren Sie sie anschließend sieben Minuten lang bei 500 ×g und 18 °C. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie das Überstand und resuspendieren das Pellet. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Zellpuffer für die Färbung und waschen Sie sie ein weiteres Mal.Verwenden Sie eine Mikrozentrifuge bei 10.000 × g für eine Minute bei vier Grad Celsius, bevor Sie mit der Antikörpermarkierung fortfahren. Resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern gereinigtem anti-murinem CD16, CD32, verdünnt im Verhältnis 1:200 in Zellpuffer für die Färbung, um die Fc-Bindungsstellen zu blockieren. Wie bei jedem Färbeverfahren ist es unerlässlich, dass alle Antikörper angemessen titriert werden; inkubieren Sie die Probe 10 Minuten auf Eis. Während der Inkubation entnehmen Sie zwei bis fünf Mikroliter Zellen und zählen Sie mithilfe eines Hämozytometers.Das kombinierte naive Gehirn- und Rückenmarkgewebe sollte etwa drei bis fünf mal zehn hoch fünf Zellen pro Maus liefern. Entzündete Gehirne weisen je nach Zeitpunkt der Gewinnung und dem Krankheitsmodell unterschiedliche Anzahlen an entzündlichen Zellen auf. Nach der Inkubation mit CD 16 und CD 32 fügen Sie 50 Mikroliter einer immunzell-spezifischen Antikörper-Cocktail-Mischung hinzu. Die in diesem Beispiel verwendete Mischung enthält Antikörper gegen CD 45, CD vier und CD 19. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.Wichtig ist, dass jeder Antikörper zunächst titriert werden muss. Um die optimale Verdünnung zu ermitteln, verwenden Sie geeignete Fluorochrom-Kombinationen, die gemäß den Möglichkeiten der Laser- und Filtereinstellungen Ihres spezifischen Durchflusszytometers gewählt werden. Nach der Zellfärbung waschen Sie die Zellen in Zellfärbepuffer, indem Sie einen Milliliter Zellfärbepuffer hinzufügen und die Zellen eine Minute lang zentrifugieren.Bei 10.000 G nach dem Zentrifugieren verwerfen Sie die Überstände, resuspendieren Sie die Pellets anschließend in 100 bis 200 Mikrolitern Zellfärbepuffer für die sofortige Durchflusszytometrie oder für eine spätere Analyse. Resuspendieren Sie die Zellen alternativ in 2 % paraformaldehyd, hergestellt in PBS, und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Dargestellt sind hier mononukleäre Zellen, die gewonnen und mit FC-Block inkubiert wurden, gefolgt von Anti-CD45-, CD4- und CD19-Antikörpern.Entsprechend dem dargestellten Protokoll trennt die CD45-Färbung mittels Durchflusszytometrie CD45-hochexprimierende hämatogene Zellen klar von CD45-dim exprimierenden Überwachungsmikroglia. Diese Abbildung vergleicht die Zellen, die aus einem naiven und einem entzündeten Gehirn eines Mäuses isoliert wurden, das experimentell eine autoimmune Enzephalomyelitis entwickelt hat. Die CD45-APC-Intensität ist auf der Y-Achse dargestellt, wobei im naiven Gehirn drei deutlich unterscheidbare Populationen sichtbar sind.Es werden nur sehr wenige CD45-hohe Zellen nachgewiesen. Gewöhnlich weniger als 2 % der gesamten isolierten Population. Im Vergleich dazu zeigen Gehirne von Mäusen mit EAE einen massiven Zustrom von Blutzellen, die ins Gehirn rekrutiert wurden.Die Hinzugabe weiterer Oberflächenmarker wie CD11b, CD4, CD8 usw. ermöglicht eine genauere Charakterisierung der CD45-hoch-Population. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass histologische Ansätze in Kombination mit der immunphänotypischen Analyse mittels Durchflusszytometrie entscheidend sind, um die Zusammensetzung der entzündlichen Infiltrate im ZNS vollständig zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video zeigen wir, wie man mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis isolieren.

Isolierung von mononukleären Zellen aus dem zentralen Nervensystem von Ratten mit EAE

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und Kultur des Kleinhirns Granulat Neuron Vorläuferzellen und Kleinhirn Nervenzellen Granulat aus postnatalen Maus.

Isolierung und Kultivierung von Post-Natal-Maus Cerebellar Granule Neuron Vorläuferzellen und Neuronen

Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

In diesem Video führen wir die Isolierung von mononukleären Zellen aus dem Gehirn einer Maus mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation durch. Die isolierte mononukleäre Zellsuspension kann für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden.

Isolierung mononukleärer Zellen aus dem Gehirn von Mäusen: Eine Dichtegradienten-Zentrifugationstechnik zur Isolierung von im Gehirn ansässigen mononukleären Zellen

In diesem Video beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung von Rückenmarksneuronen aus einer neugeborenen Maus für in vitro Studien.

Isolierung von Rückenmarksneuronen: Ein Dichtegradientenverfahren zur Isolierung von neonatalen Rückenmarksneuronen für In-vitro-Studien

Das Video zeigt die Isolierung von tumorinfiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus einem Mäusegehirn durch mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung. Daran schließt sich eine Dichtegradientenzentrifugation an, um die Immunzellen für die weitere Analyse zu sammeln.

Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Das Video zeigt die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Immunzellen aus einem murinen Gehirngewebe. Es beinhaltet eine enzymatische Verdauung, um Zellen aus dem Gehirngewebe freizusetzen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die Immunzellen basierend auf ihrer Dichte zu isolieren und die Einzelzellsuspension zu erhalten.

Herstellung einer einzelligen Suspension von Immunzellen aus murinem Hirngewebe

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von primären gemischten Gliazellen aus adultem Rückenmarksgewebe von Mäusen. Das Protokoll beinhaltet die enzymatische Verdauung des Gewebes, gefolgt von der Entfernung von gebrochenen Zellmembranen und Myelintrümmern, um eine Einzelzellpopulation zu erhalten. Die Zellen werden dann in Medien kultiviert, die für das Wachstum gemischter Gliazellen optimiert sind.

Etablierung primärer gemischter Gliazellkulturen aus dem Rückenmark einer Maus

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellen

Bis heute sind Protokolle für die gleichzeitige Isolierung aller wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus derselben Maus ein ungedeckter Bedarf. Das Protokoll zeigt ein Verfahren, das in naiven und experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mäusen angewendet werden kann, um komplexe zelluläre Netzwerke während der Neuroinflammation zu untersuchen und gleichzeitig die erforderliche Anzahl von Mäusen zu reduzieren.

Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

Lernen Sie die Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn und Rückenmark mittels Percoll-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellpopulationen im ZNS.

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

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