Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Immunzellen infiltrieren das zentrale Nervensystem bei Infektionen, Traumata, Autoimmunität oder Neurodegeneration. Während histochemische Ansätze verwendet werden können, um die Position der infiltrierenden Zellen zu bestimmen und die damit verbundene Pathologie zu analysieren, sind diese Techniken durch die Anzahl der Antikörper, die gleichzeitig verwendet werden können, begrenzt. Hier wird eine Methode zur schnellen Isolierung von mononukleären Zellen aus Hirn- und Rückenmarksgewebe gezeigt, bei der das präparierte Gewebe zunächst homogenisiert wird.

Als nächstes wird ein Perolgradient aufgebaut und nach der Zentrifugation werden die mononukleären Zellen von der Grenzfläche gesammelt. Abschließend werden die Zellen gespült und mit Antikörpern gefärbt. Durch die durchflusszytometrische Analyse werden hämatogene Zellen und Überwachungsmikroglia unterschieden und ihre relativen Anteile während des Krankheitszustands können bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Aris-Gradienten oder in einer solchen Histochemie besteht darin, dass sie weniger zeitaufwändig ist.

So können Sie mehr Gewebe gleichzeitig verarbeiten. Die Demonstration des Gradienten-Setups wird von palino Ein Techniker aus meinem Labor Bereiten Sie die Reagenzien vor, die für dieses Protokoll benötigt werden. Beginnend mit vier Millilitern isotonischem Perol, das als SIP bezeichnet wird, pro Gehirn.

Kombinieren Sie dazu neun Teile Perol mit einem Teil 10 mal HBSS ohne Calcium und Magnesium, gemischt durch Inversion. Bereiten Sie als nächstes 70% pro Anruf vor, während Sie das vorbereitete SIP mit einmal HBSS ohne Kalzium und Magnesium mischen. Geben Sie dann zwei Milliliter der 70 % pro Cole in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen, um Gewebe zu sammeln.

Für dieses Verfahren werden die präparierten Gehirne und das Rückenmark aller Studienmäuse in Bechergläser mit 10 Millilitern RPMI auf Eis gelegt. Übertragen Sie das Gewebe anschließend in einen Sieb- oder 15-Milliliter-Down-Homogenisator, der drei Milliliter einmaliges HBSS mit einer locker sitzenden Größe enthält. Ein Stößel stellt vorsichtig eine Zellsuspension her, wechselt dann zu einem eng anliegenden Stößel der Größe B und dissoziiert das Gewebe weiter.

Sobald das Gewebe homogenisiert ist, fügen Sie RPMI oder einmal HBSS zu einem endgültigen Volumen von sieben Millilitern hinzu und fahren Sie mit der Einrichtung des Gradienten fort, um den Percoco-Gradienten einzurichten. Beginnen Sie mit der Zugabe von drei Millilitern SIP zur Zellsuspension bis zu einer endgültigen PERCOCO-Konzentration von 30 %Denken Sie daran, dass das Perol bei Raumtemperatur verwendet werden sollte. Wird es kalt verwendet, neigen die Zellen zum Verklumpen und die Zelltrennung ist weniger effizient.

Als nächstes schichten Sie mit unserer Pipettenhilfe zur Einstellung des Schwerkraftmodus langsam die 10-Milliliter-Zellsuspension auf die 70%SIP. Vermeiden Sie es, die 70%- und 30%ige Lösung zu mischen. Dies ist der kritischste Schritt des Verfahrens.

An der Kreuzung von 70 bis 30 % sollte eine sehr deutliche flache Linie sichtbar sein. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sich die dritte und 70%ige Lösung während der Schichtung vermischen. Nächster Schritt, Kompromittieren der Schnittstelle Zentrifugieren Sie 30 Minuten von 500 Gs bei 18 Grad Celsius.

Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge mit minimaler oder keiner Pause stoppt, damit die Schnittstelle nicht gestört wird. Nach dem Schleudern der Gradienten sollte sich eine dicke und viskose Schicht aus Schmutz an der Oberseite des Rohrs ansammeln. Die nächste Schicht ist die gelbliche Schicht mit 30 % pro Kern, die manchmal Ablagerungen enthält.

Als nächstes folgt die 70 bis 30 Grenzfläche, die einen definierten weißen Halo haben sollte und die mononukleären Zellen enthält. Am Boden der Tube befindet sich schließlich die klare 70%Perol-Schicht. Wenn keine Grenzfläche beobachtet wird, wird die Ausbeute der Zellen wahrscheinlich sehr gering sein, was eine weitere Analyse extrem schwierig macht.

Daher könnten zu diesem Zeitpunkt frische Zellsuspensionen erforderlich sein, um die Kontamination zu verringern. Entfernen Sie vorsichtig die Schmutzschicht von der Oberseite des Rohrs und entsorgen Sie sie. Gehen Sie dann mit einer Kunststoffpipette durch die oberen 30 % pro Kernschicht, sammeln Sie zwei bis drei Milliliter der 70 30 Interphase und übertragen Sie sie in ein sauberes konisches Röhrchen mit acht Millilitern einmaligem HBSS.

Mischen Sie die verdünnten Grenzflächen einige Male durch Inversion und zentrifugieren Sie sie dann sieben Minuten lang bei 500 GS bei 18 Grad Celsius. Nach dem Schleudern die Supena entfernen und das Pellet wieder aufbügeln. In einem Milliliter Zellfärbepuffer die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und noch einmal waschen.

Unter Verwendung einer Mikrozentrifuge bei 10.000 GS für eine Minute bei vier Grad Celsius, bevor mit der Antikörperfärbung zur Durchführung der Antikörperfärbung fortgefahren wird, resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern gereinigtem Anti-US-Präparat CD 16, CD 32, verdünnt von eins bis 200 in Zellfärbepuffer, um die FC-Bindungsstellen zu blockieren. Wie bei jedem Färbeverfahren ist es zwingend erforderlich, dass alle Antikörper ausreichend titriert werden und 10 Minuten lang auf Eis inkubieren. Während der Inkubation werden zwei bis fünf Mikroliter Zellen entnommen und mit einem Hämozytometer gezählt.

Das kombinierte naive Hirn- und Rückenmarksgewebe sollte etwa drei- bis fünfmal 10 Zellen pro Maus liefern. Entzündete Gehirne haben eine unterschiedliche Anzahl von Entzündungszellen, abhängig vom Zeitpunkt, zu dem sie entnommen werden, und dem Krankheitsmodell. Nach der Inkubation mit CD 16 und CD 32 fügen Sie 50 Mikroliter immunzellspezifischen Antikörper-Cocktail-Mix hinzu. Die in diesem Beispiel verwendete Mischung enthält Antikörper gegen CD 45, CD 4 und CD 19, die 30 Minuten lang auf Eis inkubieren.

Wichtig ist, dass jeder Antikörper zuerst titriert werden muss. Um die optimale Verdünnung zu beurteilen, verwenden Sie geeignete Fluorochrom-Kombinationen, die entsprechend den Möglichkeiten der Laser- und Filtereinstellungen Ihrer speziellen Strömung ausgewählt werden. Zytometer, nach dem Färben der Zellen, waschen Sie sie in Zellfärbepuffer, indem Sie einen Milliliter Zellfärbepuffer hinzufügen und sie eine Minute lang drehen.

Bei 10.000 g nach dem Schleudern verwerfen Sie das Mittel in Rückenlage und suspendieren Sie die Paletten in 100 bis 200 Mikrolitern Zellfärbepuffer für die sofortige durchflusszytometrische Analyse für die spätere Analyse. Reus suspendiert die Zellen in 2%par Formaldehyd, das in PBS hergestellt wurde, und lagert sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Hier sind mononukleäre Zellen zu sehen, die mit dem FC-Block gewonnen und inkubiert wurden, gefolgt von Anti-CD 45-, CD 4- und CD 19-Antikörpern.

In Übereinstimmung mit dem durch Durchflusszytometrie demonstrierten Protokoll trennt die CD 45-Färbung CD 45 hochhämatogene Zellen gut von CD 45, DIM-Überwachungsmikroglia. Diese Abbildung vergleicht die Zellen, die aus einem naiven und einem entzündeten Gehirn einer Maus isoliert wurden, die zur Entwicklung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis induziert wurden. CD 45 Die PC-Intensität ist auf der Y-Achse dargestellt, wo drei verschiedene Populationen im naiven Gehirn sichtbar sind.

Es werden nur sehr wenige CD45-Zellen nachgewiesen. In der Regel weniger als 2 % der isolierten Gesamtbevölkerung. Im Vergleich dazu zeigen Gehirne von EAE-betroffenen Mäusen einen massiven Zustrom von Blutzellen, die in das Gehirn rekrutiert werden.

Die Zugabe anderer Zelloberflächenmarker wie CD 11 b, CD vier, CD acht usw. ermöglicht eine weitere Charakterisierung der CD 45 hohen Population. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei der Teilnahme an diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass histologische Ansätze in Verbindung mit der Immunphänotypisierung durch Durchflusszytometrie entscheidend sind, um die Zusammensetzung der entzündlichen ZNS-Infiltrate vollständig zu charakterisieren.