Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Immunzellen dringen während einer Infektion, nach einem Trauma, bei Autoimmunerkrankungen oder bei Neurodegeneration in das zentrale Nervensystem ein. Während histochemische Methoden verwendet werden können, um den Ort der eindringenden Zellen zu bestimmen und die assoziierte Pathologie zu analysieren, sind diese Techniken durch die Anzahl der gleichzeitig verwendbaren Antikörper begrenzt. Hier wird eine Methode zur schnellen Isolierung mononukleärer Zellen aus Gehirn- und Rückenmarkgewebe gezeigt, bei der das präparierte Gewebe zunächst homogenisiert wird.

Anschließend wird ein Percoll-Gradient hergestellt und nach der Zentrifugation werden die mononukleären Zellen von der Grenzschicht gesammelt. Abschließend werden die Zellen gewaschen und mit Antikörpern markiert. Mithilfe der Durchflusszytometrie-Analyse lassen sich hämatogene Zellen und Überwachungs-Mikroglia unterscheiden, und ihre relativen Anteile während krankhafter Zustände können bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Aris-Gradienten oder der histologischen Färbung besteht darin, dass sie zeitsparender ist.

Dies ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung einer größeren Anzahl von Gewebeproben. Die Einrichtung des Gradienten wird von Palino A, einer Technikerin aus meinem Labor, demonstriert. Bereiten Sie die Reagenzien vor, die für dieses Protokoll benötigt werden. Beginnen Sie mit vier Millilitern isotonischem Stock-Perohl, bezeichnet als SIP, pro Gehirn.

Um dies durchzuführen, mischen Sie neun Teile Perol mit einem Teil 10× HBSS ohne Calcium und Magnesium durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen. Bereiten Sie anschließend 70 % Per Call vor, indem Sie das vorbereitete SIP mit 1× HBSS ohne Calcium und Magnesium vermischen. Geben Sie dann zwei Milliliter der 70 % Per Cole in ein 15-Milliliter-Polypropylen-Konizfläschchen, um das Gewebe zu sammeln.

Legen Sie für diesen Vorgang die entnommenen Gehirne und Rückenmarkstücke aller Versuchsmäuse in Becher, die 10 Milliliter RPMI auf Eis enthalten. Überführen Sie anschließend das Gewebe in einen 7- oder 15-Milliliter-Down-Homogenisator, der 3 Milliliter 1× HBSS enthält, und verwenden Sie zunächst einen locker sitzenden Stößel. Vorsichtig wird eine Zellsuspension hergestellt, danach wechselt man zu einem eng sitzenden Stößel der Größe B und dissoziiert das Gewebe weiter.

Nachdem das Gewebe homogenisiert wurde, fügen Sie RPMI oder einmaliges HBSS bis zu einem Endvolumen von sieben Millilitern hinzu und fahren Sie mit dem Aufbau des Gradienten für den Percoll-Gradienten fort. Beginnen Sie damit, drei Milliliter SIP zur Zellsuspension hinzuzufügen, um eine endgültige PERCOLL-Konzentration von 30 % zu erreichen. Beachten Sie, dass das Perkol bei Raumtemperatur verwendet werden sollte. Falls es kalt verwendet wird, neigen die Zellen dazu, sich zusammenzulagern, und die Zellseparation ist weniger effizient.

Danach die 10 Milliliter Zellsuspension unter Verwendung des Pipettierhilfsgeräts im Schwerkraftmodus langsam auf die 70 % SIP aufschichten. Dabei vermeiden, dass die 70 %ige und die 30 %ige Lösung vermischt werden. Dies ist der kritischste Schritt des Verfahrens.

Eine sehr klare, gerade Linie sollte an der Grenze zwischen 70 % und 30 % sichtbar sein. In der Regel haben Anfänger Schwierigkeiten, da sich die dritte Lösung und die 70 %-Lösung während des Schichtens vermischen können. Im nächsten Schritt die Zentrifugation unter Erhalt der Grenzfläche: 30 Minuten bei 500 × g und 18 Grad Celsius.

Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge mit minimaler oder keiner Bremsung stoppt, damit die Grenzfläche nicht gestört wird. Nach dem Zentrifugieren der Gradienten sollte sich eine dicke, viskose Schicht aus Trümmern an der Oberseite des Röhrchens ansammeln. Die nächste Schicht ist die gelbliche 30%-Per-Core-Schicht, die manchmal Rückstände enthält.

Als Nächstes folgt die Grenzfläche zwischen 70 % und 30 %, die einen definierten weißen Hof aufweisen sollte und die mononukleären Zellen enthält. Ganz unten im Gefäß befindet sich schließlich die klare 70 % Percol-Schicht. Wenn keine Grenzfläche sichtbar ist, wird die Zellausbeute vermutlich sehr gering sein, was eine weitere Analyse äußerst schwierig macht.

Daher müssen zu diesem Zeitpunkt möglicherweise frische Zellsuspensionen verwendet werden, um die Kontamination zu verringern. Entfernen Sie vorsichtig die Debrisschicht von der Oberseite des Röhrchens und entsorgen Sie sie. Anschließend führen Sie eine Plastikpipette durch die oberen 30 % jeder Kernschicht und sammeln zwei bis drei Milliliter der 70-30-Interphase, die Sie in ein sauberes kegelförmiges Röhrchen mit acht Milliliter einmaliger HBSS überführen.

Mischen Sie die verdünnten Phasen mehrmals durch Umstülpen und zentrifugieren Sie sie anschließend sieben Minuten lang bei 500 ×g und 18 °C. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie das Überstand und resuspendieren das Pellet. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Zellpuffer für die Färbung und waschen Sie sie ein weiteres Mal.

Verwenden Sie eine Mikrozentrifuge bei 10.000 × g für eine Minute bei vier Grad Celsius, bevor Sie mit der Antikörpermarkierung fortfahren. Resuspendieren Sie die Pellets in 50 Mikrolitern gereinigtem anti-murinem CD16, CD32, verdünnt im Verhältnis 1:200 in Zellpuffer für die Färbung, um die Fc-Bindungsstellen zu blockieren. Wie bei jedem Färbeverfahren ist es unerlässlich, dass alle Antikörper angemessen titriert werden; inkubieren Sie die Probe 10 Minuten auf Eis. Während der Inkubation entnehmen Sie zwei bis fünf Mikroliter Zellen und zählen Sie mithilfe eines Hämozytometers.

Das kombinierte naive Gehirn- und Rückenmarkgewebe sollte etwa drei bis fünf mal zehn hoch fünf Zellen pro Maus liefern. Entzündete Gehirne weisen je nach Zeitpunkt der Gewinnung und dem Krankheitsmodell unterschiedliche Anzahlen an entzündlichen Zellen auf. Nach der Inkubation mit CD 16 und CD 32 fügen Sie 50 Mikroliter einer immunzell-spezifischen Antikörper-Cocktail-Mischung hinzu. Die in diesem Beispiel verwendete Mischung enthält Antikörper gegen CD 45, CD vier und CD 19. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.

Wichtig ist, dass jeder Antikörper zunächst titriert werden muss. Um die optimale Verdünnung zu ermitteln, verwenden Sie geeignete Fluorochrom-Kombinationen, die gemäß den Möglichkeiten der Laser- und Filtereinstellungen Ihres spezifischen Durchflusszytometers gewählt werden. Nach der Zellfärbung waschen Sie die Zellen in Zellfärbepuffer, indem Sie einen Milliliter Zellfärbepuffer hinzufügen und die Zellen eine Minute lang zentrifugieren.

Bei 10.000 G nach dem Zentrifugieren verwerfen Sie die Überstände, resuspendieren Sie die Pellets anschließend in 100 bis 200 Mikrolitern Zellfärbepuffer für die sofortige Durchflusszytometrie oder für eine spätere Analyse. Resuspendieren Sie die Zellen alternativ in 2 % paraformaldehyd, hergestellt in PBS, und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Dargestellt sind hier mononukleäre Zellen, die gewonnen und mit FC-Block inkubiert wurden, gefolgt von Anti-CD45-, CD4- und CD19-Antikörpern.

Entsprechend dem dargestellten Protokoll trennt die CD45-Färbung mittels Durchflusszytometrie CD45-hochexprimierende hämatogene Zellen klar von CD45-dim exprimierenden Überwachungsmikroglia. Diese Abbildung vergleicht die Zellen, die aus einem naiven und einem entzündeten Gehirn eines Mäuses isoliert wurden, das experimentell eine autoimmune Enzephalomyelitis entwickelt hat. Die CD45-APC-Intensität ist auf der Y-Achse dargestellt, wobei im naiven Gehirn drei deutlich unterscheidbare Populationen sichtbar sind.

Es werden nur sehr wenige CD45-hohe Zellen nachgewiesen. Gewöhnlich weniger als 2 % der gesamten isolierten Population. Im Vergleich dazu zeigen Gehirne von Mäusen mit EAE einen massiven Zustrom von Blutzellen, die ins Gehirn rekrutiert wurden.

Die Hinzugabe weiterer Oberflächenmarker wie CD11b, CD4, CD8 usw. ermöglicht eine genauere Charakterisierung der CD45-hoch-Population. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei bis vier Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass histologische Ansätze in Kombination mit der immunphänotypischen Analyse mittels Durchflusszytometrie entscheidend sind, um die Zusammensetzung der entzündlichen Infiltrate im ZNS vollständig zu charakterisieren.