Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Das Hauptziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aufnahme und den Transport von Prionen durch Immunzellen innerhalb von Stunden nach der Infektion zu überwachen. Zunächst werden aggregierte Prionenstäbchen aus infiziertem Gehirn gereinigt und mit einem Fluorochrom markiert, anschließend werden diese Prionenstäbchen in die Bauchhöhle von Mäusen injiziert. Nach zwei Stunden werden Zellen aus dem Peritoneum, der Milz sowie den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten gewonnen. Schließlich werden die gewonnenen Zellen mit immunphänotypischen Markern gefärbt und auf die Bindung von Prionen untersucht.

Zum Beispiel können die Durchflusszytometrie-Ergebnisse zeigen, dass Prionen-Stäbchen vorrangig von Makrophagen und dendritischen Zellen, sekundär von Monozyten und tertiär von B-Zellen zurückgehalten und transportiert werden. Dieses experimentelle System soll Einblicke in Prionen-Reservoire und potenzielle therapeutische Zielstrukturen ermöglichen, indem es zentrale Fragen beantwortet, beispielsweise welche Zellen Prionen unmittelbar nach der Infektion aufnehmen, wohin sie diese transportieren und wie schnell sie dort ankommen.

Crystal Mt. And Brady Michael, Doktoranden aus meinem Labor, werden dieses Verfahren demonstrieren, um die PreOn-Proteine zu gewinnen. Homogenisieren Sie 100 Milligramm mit PreOn infiziertes Hirngewebe für eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit in 900 Milliliter eiskaltem Homogenisierungspuffer in einem handelsüblichen Mixer und stellen Sie den Ansatz anschließend unverzüglich für zwei Minuten auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um die Proteinausbeute zu erhöhen.

Zentrifugieren Sie das Homogenat 10 Minuten bei 3000 Gs und vier Grad Celsius. Entfernen und bewahren Sie das Überstand auf Eis auf. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Liter hp und wiederholen Sie die Homogenisierung und Zentrifugationsschritte.

Vereinigen Sie nun die sNAT und zentrifugieren Sie 60 Minuten bei 100.000 ×g und 0 °C. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Milliliter TBST.

Schätzen Sie die Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay und stellen Sie das Volumen auf fünf Milligramm pro Milliliter Protein in TBST ein. Kühlen Sie 30 Minuten auf Eis. Zentrifugieren Sie erneut 30 Minuten bei 100.000 ×g und 0 °C.

Entsorgen Sie das SNA und waschen Sie das Pellet zunächst mit 50 Milliliter TBST. Anschließend resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 100 Milliliter TBS mit 100 Milliliter 1 % Sarcosyl und Protease-Inhibitor-Cocktail und rühren 120 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um einen Saccharose-Gradienten durchzuführen, schichten Sie die Probe auf 900 Milliliter 320 Millimolar Saccharose und zentrifugieren 60 Minuten.

Bei 100.000 GS 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter 2,3 molarer Natriumchloridlösung mit 5 % Sarco seal. Sonizieren Sie nun die Probe fünfmal je 40 Sekunden bei 70 % maximaler Leistung in Abständen von jeweils einer Minute.

Zentrifugieren Sie eine Milliliter Probe in Eppendorf-Röhrchen 15 Minuten bei 13.000 × g und 4 °C. Waschen Sie die Pellets zweimal mit TBS und lagern Sie die Bestände bei −70 °C. Konjugieren Sie ein Röhrchen gereinigter PreOn-Stäbchen unter Verwendung einer Ampulle DITE 649-Fluorochrom gemäß Herstellervorschrift.

Entfernen Sie schließlich den Dite-Markierungspuffer durch Zentrifugation über Filterkolonnen und ersetzen Sie ihn durch PBS. Lagern Sie die Proben in Aliquots zu 20 µL bei minus 70 °C, lichtgeschützt, bis zur Verwendung. Dieser Abschnitt umfasst die intraperitoneale Applikation von Prionen, die Inokulation sowie die Gewinnung von Zellen aus dem Peritoneum, den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten und der Milz unmittelbar vor der Verwendung des D-Schleifen-fluoreszenten Prions.

Halten Sie die Stäbchen eins bis 50 in PBS fest, indem Sie das Nackenfell der Maus mit Daumen und Zeigefinger ergreifen. Drehen Sie die Maus sanft zu sich herum und fixieren Sie den Schwanz mit dem kleinen Finger. Bringen Sie die Maus in die Supinationsposition, heben Sie den hinteren Rumpf über den Kopf und halten Sie sie leicht kopfüber.

Unter Verwendung einer 30-Gauge-Insulinspritze 100 Mikroliter fluoreszierende Pion-Stäbchen eininjizieren, einen Zentimeter lateral zur Mittellinie und ein bis zwei Zentimeter anterior zum Spina-iliaca-anterior-superior-Gelenk. Die Nadel bei Kontrollmäusen einen Zentimeter tief durch die Haut in einem Winkel von 45 Grad medial einbringen, wobei eine Verdünnung der fluoreszierenden Kügelchen im Verhältnis 1:50 oder allein PBS verwendet wird. Gemäß dem experimentellen Design die Mäuse für die vorgesehene Zeit inkubieren, um mit den Analysen zu beginnen.

Töten Sie die Mäuse gemäß den genehmigten Protokollen des Ausschusses für Tierversuche und Tierschutz. Injizieren Sie 10 Milliliter PBS mittels einer 12-Milliliter-Spritze und einer 25-Gauge-Nadel in die Bauchhöhle. Schaukeln Sie die Maus eine Minute lang vorsichtig in Längsrichtung, um mit der Maussektion fortzufahren.

Befeuchten Sie die Bauchseite des Mausfell gründlich mit 70 %igem Ethanol. Heben Sie die Haut entlang der Mittellinie knapp unterhalb des Rippenbogens mit einer Pinzette an und schneiden Sie mit einer Schere eine kleine Öffnung in die Haut. Führen Sie dann einen drei bis fünf Zentimeter langen Schnitt in der Haut in Richtung Kopf und Schwanz aus.

Zwei Zentimeter lange Schnitte von der Mittellinie ausgehend seitlich an beiden Enden vornehmen, die Haut zurückklappen und fixieren, um die Bauch- und Brusthöhle freizulegen. Die Zellsuspension aus dem Peritoneum mit derselben Spritze und einer 16-Gauge-Nadel gewinnen. Das Exsudat in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen füllen und auf Eis lagern.

Schneiden Sie vorsichtig durch die dünne, durchscheinende Membran, die das Peritoneum umgibt, und klappen Sie den Thorax zurück, um das Mediastinum freizulegen. Suchen Sie nun zwei bis vier mediastinale Lymphknoten, die sich leicht dorsal und seitlich angrenzend an den Thymus, medial angrenzend an die Arteria brachiocephalica, an der ventralen Seite der Trachea befinden, und entfernen Sie diese. Danach suchen und entfernen Sie bis zu sechs mesenteriale Lymphknoten, die im weichen, weißen Mesenterialgewebe eingebettet sind, das den Darm an der hinteren Bauchwand verankert.

Die Lymphknoten bis zum Ende des Abschnitts in einem Milliliter PMI 1640 Medium auf Eis aufbewahren. Zuletzt die Milz finden und entfernen. Ein längliches, dunkelrotes Organ, das sich knapp seitlich der Mittellinie und dorsal zu den Därmen auf der linken Seite der Maus befindet.

Unter Verwendung des Kolbens einer Ein-Milliliter-Spritze die Lymphknoten in einer Plastikpetrischale durch ein 40-Mikron-Sieb in drei Milliliter PBS hinein zerkleinern und durchdrücken. Spülen Sie das Sieb mit weiteren zwei Millilitern PBS ab und überführen Sie die gesamte fünfmilliliter Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie außerdem die Petrischale mit weiteren fünf Millilitern PBS ab und geben Sie diese zum selben Gefäß hinzu.

Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten bei 250 ×g. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet. Überführen Sie die isolierten Zellen in ein 1,5-Milliliter-EOR-Röhrchen mit einem Milliliter Fax-Puffer.

Typischerweise kann dieses Färbeprotokoll zur Identifizierung von Immunzellsubpopulationen verwendet werden, wobei fluoreszierende Antikörper gegen gut charakterisierte Oberflächenmarker von Immunzellen verwendet werden, um alle Antikörper in Fax-Puffer aufzulösen. Unmittelbar vor der Verwendung die Zellen zählen und 10 hoch 6 Zellen in Einwegröhrchen aliquotieren, die Zellen durch Zentrifugation pelletieren und das Pellet zweimal mit einem Milliliter Fax-Puffer waschen, um endogene FC-Rezeptoren zu blockieren.

Die Zellen in 100 Mikrolitern zweier Nanogramm pro Milliliter Ratten-anti-US-CD 1632 für 20 Minuten auf Eis pelletieren und die Zellen mit Fax-Puffer waschen. Danach 100 Mikroliter eines geeigneten fluoreszierenden Antikörpers oder mehrerer geeigneter fluoreszierender Antikörper mit einer Konzentration von einem Nanogramm pro Milliliter zu jeder Probe hinzufügen und auf Eis inkubieren. Für eine Stunde 100 Mikroliter Fax-Puffer allein zu den Kontrollzellen hinzufügen, pelletieren und die Zellen zweimal mit Fax-Puffer waschen.

Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Act-Puffer und inkubieren Sie sie eine Minute lang auf Eis. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, pelletieren Sie diese und waschen Sie die Zellen mit Fax-Puffer; suspendieren Sie die Zellen anschließend in einem Milliliter Fax-Puffer. Analysieren Sie die Proben typischerweise an einem Durchflusszytometer mit 405-, 488- und 633-Nanometer-Anregungslasern sowie fünf bis zehn Detektoren für fluoreszente Emission.

Rohe Prionen, infiziertes Gehirnhomogenat, sind stark angereichert an Prionen. Der Reinigungsprozess umfasst die Verwendung von Detergens, Solubilisierung und Ultrazentrifugation des E2-Gehirnhomogenats von Elchen. Das Produkt ist Protease.

Die K-resistente Fax-Analyse spezifischer Zellpopulationen zeigt, dass antigenpräsentierende Zellen innerhalb von zwei Stunden zum Peritoneum wandern und die fluoreszierenden Kügelchen sowie Prionenstäbchen aufnehmen. Zellen aus mit Kügelchen und Prionen infizierten Mäusen wiesen eine signifikante Fluoreszenz auf, insbesondere an Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen.

PräOn-tragende Monozyten, dendritische Zellen und Makrophagen wurden ebenfalls in den mediastinalen Lymphknoten gefunden. Zwei Stunden nach der Inokulation detektierten wir keine Kügelchen oder PräOn-Stäbchen in den mesenterialen Lymphknoten. In diesem Experiment demonstrierte das Video mehrere Protokolle zur Reinigung aggregierter Prionenstäbchen aus infiziertem Gehirn, um intraperitoneale Injektionen durchzuführen, Lymphknoten korrekt zu identifizieren und zu isolieren sowie schließlich Immunzellen zu isolieren und anzufärben.