Name: Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Methode der simultanen Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Motorneuronen und Ziel-Skelettmuskulatur bei Zebrafischlarven. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung synaptischer Übertragung und neuromuskulärer Interaktionen in vivo.

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Gefördert durch die NIH (NS-18205).

1. Zubereitung von Fisch für gepaarte Recordings <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens vorzubereiten fünf Lösungen, darunter: Bath Solution, Badlösung mit Tricaine (MS222), Bad-Lösung mit Formamid, Neuron Internal Solution und Muscle Internal Solution. </li><li> Anschließend sammeln einen einzigen Larven Zebrafisch im Alter von 72 bis 96 Stunden und in Badlösung mit Tricaine. Innerhalb einer Minute Einwirkzeit des Anästhetikums, die Fische nicht auf Berührung reagieren. </li><li> Den Fisch auf einer Plastikschale und mit einem Stereomikroskop, mit einem Doppel-Rasierklinge zu enthaupten. </li><li> Übertragen Sie die Fische, um ein Glas Aufnahme Kammer mit Sylgard beschichtet und mit Badlösung. Befestigen Sie an jedem Ende durch Einsetzen elektrolytisch geschärften Wolfram Stifte durch die Chorda. </li><li> Erstellen Sie einen Hautlappen am rostralen Ende des Fisches mit einer Nadel, die eine ausreichend Grip für ein Paar feine Pinzette zur Verfügung stellt. Entfernen Sie die darüber liegende Haut durch Greifen es in der Nähe des rostralen Stift mit einer feinen Pinzette. Peel langsam in die kaudale Richtung die Haut abziehen. </li><li> Behandeln Sie den Fisch mit 3 ml Badlösung mit Formamid für 3-5 Minuten, um Muskelkontraktionen, die mit Aufnahmen stören könnte, zu blockieren. Wash 5 mal mit normalen Bad Solution. Nehmen Sie Teil der oberflächlichen Muskulatur über 5 bis 6 Segmente, indem Sie vorsichtig die Verschrottung mit der Seite eines Wolframstift. </li><li> Übertragen Sie die Fische zu einem aufrechten Mikroskop in einen Faraday-Käfig, um elektrische Störungen zu schützen. Das Mikroskop ist mit einer festen Bühne ausgestattet, großer Arbeitsabstand 40x und Zoom von .5 bis 4x. Das Mikroskop befindet sich auf einem motorisierten XY-Übersetzung Bühne montiert, um die Vorbereitung zwischen Nerv und Muskel unter hoher Leistung zu bewegen. Der Einsatz von Differential-Interferenz-Kontrast-Optik trägt dazu bei, die Neuronen zu visualisieren. </li><li> Unter 0,5 x-Zoom, verwenden Sie eine weite Bohrung 15-Mikrometer-Pipette darüberliegenden Muskel entfernen und setzen das Rückenmark. Negativer Druck wird durch eine 3 cc Einwegspritze und Muskelzellen angewendet werden entfernt eins nach dem anderen. Dieses Verfahren ist für 5 bis 6 dorsalen Segmente der Skelettmuskulatur wiederholt. Das gleiche weite Bohrung Pipette wird verwendet, um auch entfernen, die beiden oberen Schichten der ventralen Muskulatur zum Ziel schnell Skelettmuskulatur zu erhalten. </li><li> Damit ist die Vorbereitung für gepaarte Aufnahmen und das Mikroskop Zoom ist auf ca. 1,6 erhöht. </li></ol> 2. Gepaart Recordings von CaP Motor-Neuron-und Target Muskelzellen <ol><li> Das gereinigte Segmente werden gescannt, um die CaP Neuronen zu finden. Jeder Hemi-Segment des Rückenmarks enthält einen großen, 10 Mikron Durchmesser, CaP Motor-Neuron. Diese Tropfenform Soma ist oberflächlich unter der spinalen Dura in der Nähe des kaudalen Endes der segmentalen Grenze entfernt. Ein CaP Neuron ist für die Aufnahme ausgewählt und das ventrale Zielmuskel in den angrenzenden kaudalen Segment gescannt wird, um die Integrität zu überprüfen. </li><li> Zwei aufgesetzte Elektroden sind für die Aufnahme, einen für das Neuron und eine zweite für den Muskelaufbau positioniert. Die obere Elektrode hat eine flache Kegel für das Eindringen der harten spinalen Dura und Bahnöffnung von etwa 2 Mikrometer. Die untere Elektrode hat eine steilere Kegel für geringen Widerstand Voltage-Clamp-Aufzeichnung der Skelettmuskulatur </li><li> Position des Neurons Elektrode in einem Winkel von etwa 30 Grad auf der spinalen Dura einzudringen, etwa ein halbes Segment rostral um den ausgewählten CaP Neurons. Schieben Sie die Elektrode mit einem axialen Manipulator, während eine sanfte kontinuierliche positive Druck von etwa 60 Millimeter Quecksilber. Da die Elektrode bricht durch die Dura, kann die Kappe Neuron durch die Perfusion von der Elektrode verschoben werden, erfordern eine Neujustierung des Fokus. </li><li> Wenn die Elektrode berührt die CaP Neuron soma Überdruck freigesetzt und führt in der Regel sofortige Bildung eines Gigaohm Dichtung. Doch in einigen Fällen, wo eine Abdichtung versagt zu bilden, wird es notwendig, einen sanften Unterdruck anwenden. Nach Siegel Bildung ist das Elektrodenpotential angepasst, um-80mV und Anwendung von Unterdruck Brüche der Zellmembran. Die GAP-Neuron ist mit einem Eingangswiderstand von 140 bis 180 Mega-Ohm und ein Aktionspotential, dass Überschwinger 40 Millivolt aus. Dies ist durch die Injektion schrittweise Erhöhung depolarisierende Schritte unter Stromzange bis das Aktionspotential ausgelöst wird getestet. </li><li> Als nächstes wird das Mikroskop auf ventralen Muskel mit dem XY motorisierten Übersetzer unter hohen Strom verlegt. Eine schnelle Muskelzelle wird aus dem Zielfeld ausgewählt. </li><li> Der Muskel-Elektrode ist auf das Ziel Muskelzelle unter Überdruck, der beim Loslassen, bildet eine Gigaohm Dichtung fortgeschritten. Das Elektrodenpotential wird auf -50 Millivolt eingestellt Natrium-Kanäle inaktivieren und unter leichtem Saugen der Zellmembran ist gerissen. Ein Rückgang der Widerstand gegen die 100 bis 200 Mega-Ohm und das plötzliche Auftauchen der großen kapazitiven Transienten-Eintrag. </li><li> Um zu testen,für gepaarte der Aufnahme wird die Motor-Neuron depolarisiert durch schrittweise größere Injektionen von Strom, bis ein Aktionspotential ausgelöst wird. An dieser Stelle eine Endplatte Strom sollte in der Muskulatur hervorgerufen werden. Fortsetzung Stimulation der Motoneuronen bei 1 Hertz Ergebnisse in Endplatte Ströme ohne Ausfall. Da die Reizfrequenz auf 100 Hertz erhöht wird die Endplatte Strömungen schwanken in Amplitude und unterziehen funktionalen Erschöpfung innerhalb von 10 Sekunden Stimulation. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Typischerweise ist das Neuron eine Aufnahmedauer von bis zu einer Stunde stabil, aber die Muskelzellen verschlechtern, da eine Erhöhung der Serienwiderstand wider. In diesem Fall wird der Versuch entweder beendet oder anderen Muskelzelle ist Patch gespannt. Alle Aufnahmen sollten innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. <img src="/files/ftp_upload/2351/2351fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Recordings der Motoneuron Aktionspotential (AP, oben) und die damit verbundenen muskulären Endplatte aktuellen (EPC, unten). Die Aktion Potenzial für eine CaP Neuron sollte Überschwingen +40 mV und der EPC sollte innerhalb von 300 us und Verfall entlang einer exponentiellen Zeitverlauf mit einer Zeitkonstante unter 1 ms steigen. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Rezept </td></tr><tr><td> Bad Solution (in mM) </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 </td></tr><tr><td> Badlösung mit Tricaine </td><td> Bath Lösung mit 0,02% Tricaine </td></tr><tr><td> Badlösung mit Formamid </td><td> Bath Lösung mit 2M Formamid </td></tr><tr><td> Neuron Internal Solution (in mM) </td><td> 115 K-Gluconat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 </td></tr><tr><td> Muscle Internal Solution (in mM) </td><td> 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Solutions.

<ol><li>Fetcho, J. R., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+networks+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal networks in behaving animals.</a> Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).</li>
<li>Fetcho, J. R., S, H. igashijima <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+and+genetic+approaches+toward+understanding+neuronal+circuits+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish.</a> Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).</li>
<li>Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethering+naturally+occurring+peptide+toxins+for+cell+autonomous+modulation+of+ion+channels+and+receptors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo.</a> Neuron. 43, 305-311 (2004).</li>
<li>Li, W., Ono, F., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurements+of+presynaptic+release+in+mutant+zebrafish+lacking+postsynaptic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors.</a> J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).</li>
<li>Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+direct+rapsyn+clusters+to+the+neuromuscular+synapse+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish.</a> J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+zebrafish+lacking+ACh+receptors+fail+to+localize+rapsyn+clusters+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse.</a> J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).</li>
<li>Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+motility+mutant+twitch+once+reveals+new+roles+for+rapsyn+in+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function.</a> J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).</li>
<li>Wang, M., Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+neuromuscular+synapses+in+the+zebrafish+choline-acetyltransferase+mutant+bajan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan.</a> J Neurophysiol. , 100-104 (2008).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+motor-neuron+muscle+recordings+in+zebrafish+test+the+receptor+blockade+model+for+shaping+synaptic+current%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current.</a> J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).</li>
</ol>

Wir verwenden Zebrafisch gepaart Aufnahmen (Wen und Brehm, 2005) hauptsächlich auf die Prozesse der Vesikelfreisetzung und Recycling bei hoher Frequenz Stimulation zu studieren. Dieser Prozess ist in Motilität Mutanten wobei normale synaptische Übertragung unterbrochen wird durch Punktmutationen in wichtigen synaptischen Komponenten beeinträchtigt. Zum Beispiel, Mutationen, die postsynaptische Rezeptor-Aggregate (Ono et al., 2001, 2002, 2004) und die Synthese von präsynaptischen Sender (Wang et al., 2008) führen in eine unkoordinierte Schwimmen stören. Gepaart Aufnahmen liefern die Informationen, die die Quelle der funktionellen Defekt lokalisieren kann, was eine Verknüpfung Verhalten, Genetik und Physiologie. Es sollte nun möglich sein, weitere sezieren die zugrunde liegenden Prozesse der synaptischen Übertragung durch transiente Expression in der GAP-Motor-Neuronen mit vernünftigen Promotoren. Auf diese Weise dominant negative oder mutierten Gene gezielt in diesen Neuronen exprimiert werden, und beide Verhaltens-und elektrophysiologischen Folgen bestimmt. Der zusätzliche Vorteil von der ganzen Zelle Konfiguration angeboten ermöglicht Dialyse des CaP Soma mit Substanzen, die potenziell verändern können Vesikel-Recycling, wie Clostridien-Toxine und Kalzium-Puffer. Aufgrund der kurzen Entfernung zwischen dem Soma und Muskeln, sollte Diffusion und treten innerhalb des Zeitrahmens von Aufnahmen. Das Potenzial dieses Präparats hat gerade erst begonnen erschlossen werden. Die Transparenz der Fische in diesem Alter und oberflächliche Lage der Synapsen erleichtert zudem die Anwendung der optischen Instrumente (Fetcho und O&#39;Malley, 1997; Fetcho und Higashijima, 2004). Wir waren sehr erfolgreich bei der Messung von Endo-und Exozytose in lebenden Fischen mit FM-Farbstoffe und genetische Indikatoren wie Synaptophluorin (Li et al., 2003). Darüber hinaus können fluoreszierenden konjugierten Toxinen verwendet werden, um synaptische Proteine ​​für die Bildgebung von lebenden Fischen (Ibanez-Tallon et al., 2004) zu kennzeichnen. Angesichts der Einfachheit dieser Vorbereitung ist es sehr vielversprechend für die Zukunft studieren.

<table><tbody><tr><td>Prüfgerät für pneumatische Wandler</td><td>Fluke Biomedical</td><td>DPM1B</td><td></td></tr><tr><td>0,002 x 3 Zoll Wolframstift</td><td>A-M Systems</td><td>715000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Die Dicke der Auftragsmenge beeinflusst die DIC-Optik</td></tr></tbody></table>

gepaart patch clamp messungen von motor-neuron-und target skelettmuskulatur bei zebrafisch

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Zielmuskel ermöglichen. Dies ist eine direkte Folge der Zugang zu beiden Zelltypen und die Fähigkeit zur visuellen Unterscheidung der einzelnen segmentalen CaP Motor-Neuron auf der Basis von Morphologie und Lage. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um einen CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren. Bezeichnung des CaP Motor-Neuron-Typs ist entweder Farbstoff Füllung oder durch die biophysikalischen Eigenschaften wie Aktionspotential Wellenform und Zelle Eingangswiderstand bestätigt. Motor-Neuron-Aufnahmen routinemäßig zuletzt für 1 Stunde ermöglichen, langfristige Aufzeichnungen aus mehreren unterschiedlichen Ziel Muskelzellen. Die Kontrolle über den Motor-Neuron feuern Muster ermöglicht Messungen der Frequenz-Abhängigkeit der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse. Aufgrund einer großen quantal Größe und der geringen Geräuschentwicklung gesamte Zellspannung Klammer vorgesehen, können alle an der einheitlichen Ereignisse im Muskel gelöst werden. Diese Funktion erlaubt Erforschung grundlegender synaptischen Eigenschaften wie Release-Eigenschaften, Vesikel-Recycling, sowie synaptische Depression und Erleichterung. Die Vorteile dieser in vivo Vorbereitung eclipse früheren neuromuskulären Modell angebotenen Systeme untersucht, wobei die Motor-Neuronen in der Regel durch extrazelluläre Elektroden stimuliert werden und die Muskeln sind zu groß für die gesamte Zelle Patch-Clamp. Der Zebrafisch Vorbereitung ist offen für die Kombination von elektrophysiologischen Analyse mit einer Vielzahl von Ansätzen, einschließlich transgenen Linien, Morpholino Knockdown, pharmakologische Intervention und in-vivo-Bildgebung. Diese Ansätze, verbunden mit der wachsenden Zahl von neuromuskulären Erkrankungen Modelle von mutierten Linien der Zebrafisch zur Verfügung gestellt, die Tür öffnen für ein neues Verständnis der menschlichen neuromuskulären Erkrankungen.

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Zebrafischlarven stellen das erste wirbeltierbasierte Modellsystem dar, das gleichzeitige Patch-Clamp-Ableitungen von einem spinalen Motoneuron und dem Zielmuskel ermöglicht.

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, simultane elektrophysiologische Ableitungen eines Aktionspotentials eines Motoneurons und der zugehörigen synaptischen Antwort im Zielmuskel zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Haut auf der Oberseite des Fisches entfernt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Rückenmark freizulegen, indem alle darüberliegenden dorsalen Muskelzellen entfernt werden.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Ziel-Schnellmuskel freizulegen, indem die obere Schicht des Langsam-Muskels entfernt wird. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Stromklemmung des primären Coddle- oder Cap-Neurons und die Spannungsklemmung des Ziel-Skelettmuskels. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die synaptischen Antworten im Muskel zeigen, die mit der Feuerung von Aktionspotentialen des Motoneurons assoziiert sind, durch gleichzeitige Stromklemmung des Motoneurons und Spannungsklemmung des Zielmuskels.LaVar Super Fish bot eine Kombination von Vorteilen, die es ermöglichen, gepaarte motorische Neuronen und Skelettmuskulatur zu untersuchen, wobei die geringe Muskelgröße effektives Voltage-Clamp erlaubt, und die stereotypen Merkmale des cap-motorischen Neurons eine einfache Identifizierung und Zugänglichkeit bieten. Im Folgenden werde ich die Schritte beschreiben, die erforderlich sind, um die Patch-Clamp-Technik sowohl am Neuron als auch am Muskel einzurichten. Vor Beginn des Verfahrens bereiten Sie fünf wichtige Lösungen vor, darunter Badesolution, Badesolution mit Trica, Badesolution mit IDE, Neuron-Innenlösung und Muskel-Innenlösung.Sammeln Sie anschließend einen einzelnen Zebrafischlarven zwischen 72 und 96 Stunden Alter und geben Sie ihn in Badelösung mit Trica. Innerhalb einer Minute nach der Exposition gegenüber dem Anästhetikum reagiert der Fisch nicht mehr. Um den Fisch auf eine Kunststoffschale zu legen und unter Verwendung eines Stereomikroskops mit einer Rasierklinge mit Doppelschneide zu enthaupten.Überführen Sie den Fisch in eine mit Sard beschichtete Glas-Aufnahmekammer, die mit Bass-Lösung gefüllt ist. Erstellen Sie mit einer Nadel in der Nähe des rostralen Endes des Fisches eine Hautklappe, die einen ausreichenden Halt für eine feine Pinzette bietet. Entfernen Sie die daraufliegende Haut, indem Sie sie nahe der rostralen Nadel mit einer feinen Pinzette greifen.Schälen Sie langsam in Coddle-Richtung, um die Haut zu entfernen. Behandeln Sie den Fisch mit drei Millilitern Badelösung mit Form IDE für drei bis fünf Minuten, um Muskelkontraktionen zu blockieren, die die Aufnahmen stören könnten. Waschen Sie fünfmal mit normaler Badelösung.Entfernen Sie einen Teil der oberflächlichen Muskelschicht über fünf bis sechs Segmente, indem Sie vorsichtig mit der Seite einer Wolframelektrode abkratzen. Überführen Sie den Fisch in ein aufrechtes Mikroskop, das sich in einer Faraday-Kabine befindet, um elektrische Störungen abzuschirmen. Das Mikroskop ist mit einem Objektiv mit festem Objekttisch und großer Arbeitsweite, 40x Vergrößerung und einem Zoombereich von 0,5 bis 4x ausgestattet.Das Mikroskop ist auf einer motorisierten XY-Translationsstufe montiert. Um die Probe unter hoher Vergr&ouml;&szlig;erung zwischen Nerv und Muskel zu bewegen, hilft der Einsatz von Differentialinterferenzkontrastoptik, die Neuronen bei 0,5-facher Zoomstufe zu visualisieren. Verwenden Sie eine Pipette mit gro&szlig;em Durchmesser und 15 &mu;m &Ouml;ffnung, um den dar&uuml;berliegenden Muskel zu entfernen und das R&uuml;ckenmark freizulegen.Über eine Einwegspritze mit einem Volumen von drei Kubikzentimetern wird Unterdruck erzeugt, und die Muskelzellen werden einzeln entfernt. Dieses Verfahren wird für fünf bis sechs dorsale Abschnitte der Skelettmuskulatur wiederholt. Derselbe breite Pipettenspitze wird ebenfalls verwendet, um die oberen beiden Schichten der ventralen Muskulatur zu entfernen, um die Zielmuskulatur der schnellen Skelettmuskulatur zu gewinnen.Hiermit ist die Vorbereitung für Doppelaufnahmen abgeschlossen, und die Mikroskopvergrößerung wird auf etwa 1,6 x erhöht. Die sauberen Segmente werden abgesucht, um die Kap-Neurone zu lokalisieren. Jedes HEMI-Segment des Rückenmarks enthält ein großes kap-Motoneuron mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern.Dieses tränentropfenförmige Soma befindet sich oberflächlich unterhalb des spinalen Jira in der Nähe des kaudalen Endes der segmentalen Grenze. Ein Cap-Neuron wird zur Ableitung ausgewählt, und das zugehörige kaudale Segment sowie das ventrale Zielmuskelfeld werden auf ihre Integrität überprüft. Zwei Patch-Elektroden werden zur Ableitung positioniert, eine für das Neuron und eine zweite für den Muskel.Die obere Elektrode weist eine flache Abschrägung zum Durchdringen der harten Rückenmarksdura auf und hat eine Öffnung an der Spitze von etwa zwei Mikrometern. Die untere Elektrode besitzt eine stärker ausgeprägte Abschrägung für die spannungsgesteuerte Ableitung mit geringem Widerstand an der Skelettmuskulatur. Positionieren Sie die Neuronenelektrode in einem Winkel von etwa 30 Grad, um die Rückenmarksdura zu durchdringen.Etwa eine halbe Strecke rostral zum ausgewählten Kappen-Neuron bewegen Sie die Elektrode mithilfe eines axialen Manipulators vorwärts, während Sie einen sanften, kontinuierlichen positiven Druck von etwa 60 Millimeter Quecksilber anlegen. Wenn die Elektrode durch die Dura bricht, kann das Kappen-Neuron durch die Perfusionsflüssigkeit aus der Elektrode verschoben werden, was eine erneute Fokussierung erforderlich macht. Sobald die Elektrode das SOMA des Kappen-Neurons berührt, wird der positive Druck abgelassen, wodurch normalerweise unmittelbar eine Giga-Dichtung entsteht.Jedoch ist es in einigen Fällen, in denen sich kein Dichtschluss bildet, notwendig, einen sanften negativen Druck anzuwenden. Nach der Bildung des Dichtschlusses wird das Elektrodenpotential auf minus 80 Millivolt eingestellt, und die Anwendung von negativem Druck führt zum Platzen der Zellmembran. Das Kap-Neuron zeichnet sich durch einen Eingangswiderstand von 140 bis 180 Megaohm und ein Aktionspotential aus, das plus 40 Millivolt überschreitet.Dies wird getestet, indem unter Stromklemmung schrittweise zunehmende depolarisierende Impulse injiziert werden, bis das Aktionspotential ausgelöst wird. Anschließend wird das Mikroskop mithilfe des motorisierten XY-Verfahrgeräts auf den ventralen Muskel verschoben. Im Hochleistungsbereich wird aus dem Zielbereich eine schnelle Muskelzelle ausgewählt.Die Musikelektrode wird unter positivem Druck in Richtung der Zielmuskelzelle vorgeschoben, wodurch beim Freisetzen des Drucks ein Giga-Seal entsteht. Das Elektrodenpotential wird auf minus 50 Millivolt eingestellt, um Natriumkanäle zu inaktivieren. Unter sanftem Sog wird die Zellmembran perforiert. Ein Abfall des Widerstands auf 100 bis 200 Megaohm und das plötzliche Auftreten großer kapazitiver Transientensignale signalisieren den Eintritt in die Testphase für das Paar.Die Aufzeichnung des Motoneurons erfolgt durch schrittweise größere Strominjektionen, bis ein Aktionspotential ausgelöst wird. Zu diesem Zeitpunkt sollte ein Endplattenstrom im Muskel ausgelöst werden. Eine fortgesetzte Stimulation des Motoneurons mit einem Hertz führt zu Endplattenströmen ohne Ausfälle. Wenn die Reizfrequenz auf 100 Hertz erhöht wird, schwanken die Endplattenströme in ihrer Amplitude und zeigen innerhalb von 10 Sekunden Stimulation eine funktionelle Erschöpfung.In der Regel ist die Neuronenablesung bis zu einer Stunde stabil, doch die Muskelzellen verschlechtern sich, was sich in einem Anstieg des Serienwiderstands widerspiegelt. In diesem Fall wird das Experiment entweder beendet oder eine andere Muskelzelle patchgeclampet. Alle Ableitungen sollten innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein.Nachdem ein Paar beherrscht wurde, kann die Aufnahme innerhalb von einer bis anderthalb Stunden abgeschlossen werden. Es ist außerdem möglich, ein oder zwei zusätzliche Paare in den benachbarten Segmenten zu erhalten. Ein typischer Aufnahmetag liefert zwei bis drei Paare.Gekoppelte Aufzeichnungen von motorischen Neuronen und Skelettmuskulatur bieten eine einzigartige Möglichkeit, die grundlegenden Abläufe der neuromuskulären Übertragung zu untersuchen. In Kombination mit Motilitäts-Mutanten-Fischnachkommen können sie die Ursache einer neuromuskulären Dysfunktion genau lokalisieren und neue Einblicke in die Mechanismen menschlicher Erkrankungen wie des metastatischen Syndroms liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Der Zweck dieses Videos ist es, Verfahren zur Gewinnung von gesunden, intakten Haarzellen aus den Innenohr Organe ausgewachsener Zebrafisch und dann mit ihnen für Patch-Clamp-Untersuchungen zur Charakterisierung der biophysikalischen Eigenschaften ihrer spannungsabhängigen Kanälen ausgerichtet demonstrieren.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik namens Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Mauthner-Neuronen und anderen retikulospinalen Zellen in Zebrafischembryonen ist.

Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie: Eine Methode zur Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von Neuronen

Dieses Video zeigt einen nicht-invasiven Assay zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen. Bei der Messung des Schwanzcoilings in den Embryonen als Folge der spontanen Depolarisation der Motoneuronen des Rückenmarks wird ein Natriumkanalblocker angewendet, um die Windungsfrequenz zu reduzieren. Anschließend werden die Embryonen in Agarose immobilisiert und unter ein Fluoreszenzmikroskop gelegt. Die gentechnisch veränderten Motoneuronen exprimieren einen...

Ein nicht-invasiver Ansatz zur Untersuchung der Elektrophysiologie von Motoneuronen in Zebrafischembryonen

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von elektrischen Signalen von den afferenten Neuronen in einer gelähmten Zebrafischlarve, indem eine Mikropipette in der Nähe des Ganglions der Seitenlinie positioniert und eine lose Dichtung für die Signalerfassung gebildet wird. Die extrazelluläre Lösung erhält während dieses Prozesses die neuronale Lebensfähigkeit.

Überwachung der elektrischen Signale der afferenten Neuronen in einer immobilisierten Zebrafischlarve

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Wir haben ein intaktes Gehirn-Rückenmarks Vorbereitung über Patch-Clamp-Aufzeichnung von den Mauthner Neuronen und anderen Zellen retikulospinale in Zebrafischembryonen zu erfassen und überwachen elektrische Aktivität entwickelt. So sind wir in der Lage, erregende und hemmende synaptische Ströme, spannungsgesteuerte Kanalaktivität und Aktionspotentiale von wichtigen Nervenzellen im sich entwickelnden Embryos aufzeichnen.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung von Veränderungen der afferenten Neuronenaktivität während motorischer Befehle in einem Modell-Wirbeltier-Haarzellsystem.

Aktivität von posterioren Lateral Line Afferent Neuronen beim Schwimmen im Zebrafisch

Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.

Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind

Die neuromuskuläre Verbindung der Zebrafischlarve ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie. Es ist für viele experimentelle Techniken zugänglich, einschließlich Elektrophysiologie und optischer Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Abbildung der synaptischen Übertragung mit einer pHluorin-basierten Sonde unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Methode der simultanen Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Motorneuronen und Ziel-Skelettmuskulatur bei Zebrafischlarven. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung synaptischer Übertragung und neuromuskulärer Interaktionen in vivo.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

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