Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, simultane elektrophysiologische Ableitungen eines Aktionspotentials eines Motoneurons und der zugehörigen synaptischen Antwort im Zielmuskel zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Haut auf der Oberseite des Fisches entfernt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Rückenmark freizulegen, indem alle darüberliegenden dorsalen Muskelzellen entfernt werden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Ziel-Schnellmuskel freizulegen, indem die obere Schicht des Langsam-Muskels entfernt wird. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Stromklemmung des primären Coddle- oder Cap-Neurons und die Spannungsklemmung des Ziel-Skelettmuskels. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die synaptischen Antworten im Muskel zeigen, die mit der Feuerung von Aktionspotentialen des Motoneurons assoziiert sind, durch gleichzeitige Stromklemmung des Motoneurons und Spannungsklemmung des Zielmuskels.

LaVar Super Fish bot eine Kombination von Vorteilen, die es ermöglichen, gepaarte motorische Neuronen und Skelettmuskulatur zu untersuchen, wobei die geringe Muskelgröße effektives Voltage-Clamp erlaubt, und die stereotypen Merkmale des cap-motorischen Neurons eine einfache Identifizierung und Zugänglichkeit bieten. Im Folgenden werde ich die Schritte beschreiben, die erforderlich sind, um die Patch-Clamp-Technik sowohl am Neuron als auch am Muskel einzurichten. Vor Beginn des Verfahrens bereiten Sie fünf wichtige Lösungen vor, darunter Badesolution, Badesolution mit Trica, Badesolution mit IDE, Neuron-Innenlösung und Muskel-Innenlösung.

Sammeln Sie anschließend einen einzelnen Zebrafischlarven zwischen 72 und 96 Stunden Alter und geben Sie ihn in Badelösung mit Trica. Innerhalb einer Minute nach der Exposition gegenüber dem Anästhetikum reagiert der Fisch nicht mehr. Um den Fisch auf eine Kunststoffschale zu legen und unter Verwendung eines Stereomikroskops mit einer Rasierklinge mit Doppelschneide zu enthaupten.

Überführen Sie den Fisch in eine mit Sard beschichtete Glas-Aufnahmekammer, die mit Bass-Lösung gefüllt ist. Erstellen Sie mit einer Nadel in der Nähe des rostralen Endes des Fisches eine Hautklappe, die einen ausreichenden Halt für eine feine Pinzette bietet. Entfernen Sie die daraufliegende Haut, indem Sie sie nahe der rostralen Nadel mit einer feinen Pinzette greifen.

Schälen Sie langsam in Coddle-Richtung, um die Haut zu entfernen. Behandeln Sie den Fisch mit drei Millilitern Badelösung mit Form IDE für drei bis fünf Minuten, um Muskelkontraktionen zu blockieren, die die Aufnahmen stören könnten. Waschen Sie fünfmal mit normaler Badelösung.

Entfernen Sie einen Teil der oberflächlichen Muskelschicht über fünf bis sechs Segmente, indem Sie vorsichtig mit der Seite einer Wolframelektrode abkratzen. Überführen Sie den Fisch in ein aufrechtes Mikroskop, das sich in einer Faraday-Kabine befindet, um elektrische Störungen abzuschirmen. Das Mikroskop ist mit einem Objektiv mit festem Objekttisch und großer Arbeitsweite, 40x Vergrößerung und einem Zoombereich von 0,5 bis 4x ausgestattet.

Das Mikroskop ist auf einer motorisierten XY-Translationsstufe montiert. Um die Probe unter hoher Vergrößerung zwischen Nerv und Muskel zu bewegen, hilft der Einsatz von Differentialinterferenzkontrastoptik, die Neuronen bei 0,5-facher Zoomstufe zu visualisieren. Verwenden Sie eine Pipette mit großem Durchmesser und 15 μm Öffnung, um den darüberliegenden Muskel zu entfernen und das Rückenmark freizulegen.

Über eine Einwegspritze mit einem Volumen von drei Kubikzentimetern wird Unterdruck erzeugt, und die Muskelzellen werden einzeln entfernt. Dieses Verfahren wird für fünf bis sechs dorsale Abschnitte der Skelettmuskulatur wiederholt. Derselbe breite Pipettenspitze wird ebenfalls verwendet, um die oberen beiden Schichten der ventralen Muskulatur zu entfernen, um die Zielmuskulatur der schnellen Skelettmuskulatur zu gewinnen.

Hiermit ist die Vorbereitung für Doppelaufnahmen abgeschlossen, und die Mikroskopvergrößerung wird auf etwa 1,6 x erhöht. Die sauberen Segmente werden abgesucht, um die Kap-Neurone zu lokalisieren. Jedes HEMI-Segment des Rückenmarks enthält ein großes kap-Motoneuron mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern.

Dieses tränentropfenförmige Soma befindet sich oberflächlich unterhalb des spinalen Jira in der Nähe des kaudalen Endes der segmentalen Grenze. Ein Cap-Neuron wird zur Ableitung ausgewählt, und das zugehörige kaudale Segment sowie das ventrale Zielmuskelfeld werden auf ihre Integrität überprüft. Zwei Patch-Elektroden werden zur Ableitung positioniert, eine für das Neuron und eine zweite für den Muskel.

Die obere Elektrode weist eine flache Abschrägung zum Durchdringen der harten Rückenmarksdura auf und hat eine Öffnung an der Spitze von etwa zwei Mikrometern. Die untere Elektrode besitzt eine stärker ausgeprägte Abschrägung für die spannungsgesteuerte Ableitung mit geringem Widerstand an der Skelettmuskulatur. Positionieren Sie die Neuronenelektrode in einem Winkel von etwa 30 Grad, um die Rückenmarksdura zu durchdringen.

Etwa eine halbe Strecke rostral zum ausgewählten Kappen-Neuron bewegen Sie die Elektrode mithilfe eines axialen Manipulators vorwärts, während Sie einen sanften, kontinuierlichen positiven Druck von etwa 60 Millimeter Quecksilber anlegen. Wenn die Elektrode durch die Dura bricht, kann das Kappen-Neuron durch die Perfusionsflüssigkeit aus der Elektrode verschoben werden, was eine erneute Fokussierung erforderlich macht. Sobald die Elektrode das SOMA des Kappen-Neurons berührt, wird der positive Druck abgelassen, wodurch normalerweise unmittelbar eine Giga-Dichtung entsteht.

Jedoch ist es in einigen Fällen, in denen sich kein Dichtschluss bildet, notwendig, einen sanften negativen Druck anzuwenden. Nach der Bildung des Dichtschlusses wird das Elektrodenpotential auf minus 80 Millivolt eingestellt, und die Anwendung von negativem Druck führt zum Platzen der Zellmembran. Das Kap-Neuron zeichnet sich durch einen Eingangswiderstand von 140 bis 180 Megaohm und ein Aktionspotential aus, das plus 40 Millivolt überschreitet.

Dies wird getestet, indem unter Stromklemmung schrittweise zunehmende depolarisierende Impulse injiziert werden, bis das Aktionspotential ausgelöst wird. Anschließend wird das Mikroskop mithilfe des motorisierten XY-Verfahrgeräts auf den ventralen Muskel verschoben. Im Hochleistungsbereich wird aus dem Zielbereich eine schnelle Muskelzelle ausgewählt.

Die Musikelektrode wird unter positivem Druck in Richtung der Zielmuskelzelle vorgeschoben, wodurch beim Freisetzen des Drucks ein Giga-Seal entsteht. Das Elektrodenpotential wird auf minus 50 Millivolt eingestellt, um Natriumkanäle zu inaktivieren. Unter sanftem Sog wird die Zellmembran perforiert. Ein Abfall des Widerstands auf 100 bis 200 Megaohm und das plötzliche Auftreten großer kapazitiver Transientensignale signalisieren den Eintritt in die Testphase für das Paar.

Die Aufzeichnung des Motoneurons erfolgt durch schrittweise größere Strominjektionen, bis ein Aktionspotential ausgelöst wird. Zu diesem Zeitpunkt sollte ein Endplattenstrom im Muskel ausgelöst werden. Eine fortgesetzte Stimulation des Motoneurons mit einem Hertz führt zu Endplattenströmen ohne Ausfälle. Wenn die Reizfrequenz auf 100 Hertz erhöht wird, schwanken die Endplattenströme in ihrer Amplitude und zeigen innerhalb von 10 Sekunden Stimulation eine funktionelle Erschöpfung.

In der Regel ist die Neuronenablesung bis zu einer Stunde stabil, doch die Muskelzellen verschlechtern sich, was sich in einem Anstieg des Serienwiderstands widerspiegelt. In diesem Fall wird das Experiment entweder beendet oder eine andere Muskelzelle patchgeclampet. Alle Ableitungen sollten innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein.

Nachdem ein Paar beherrscht wurde, kann die Aufnahme innerhalb von einer bis anderthalb Stunden abgeschlossen werden. Es ist außerdem möglich, ein oder zwei zusätzliche Paare in den benachbarten Segmenten zu erhalten. Ein typischer Aufnahmetag liefert zwei bis drei Paare.

Gekoppelte Aufzeichnungen von motorischen Neuronen und Skelettmuskulatur bieten eine einzigartige Möglichkeit, die grundlegenden Abläufe der neuromuskulären Übertragung zu untersuchen. In Kombination mit Motilitäts-Mutanten-Fischnachkommen können sie die Ursache einer neuromuskulären Dysfunktion genau lokalisieren und neue Einblicke in die Mechanismen menschlicher Erkrankungen wie des metastatischen Syndroms liefern.