In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction

Bei der Clathrin-vermittelten Endozytose wird ein polyedrisches Gitter aus Clathrin über Clathrin-bindende Adapta-Proteine wie SL one an Membranproteine oder Lipide gebunden, SL one bindet Clathrin über seine Variante Clathrinbox oder VCB. In diesem Video werden drei Methoden zur Analyse der Wechselwirkungen zwischen Clathrin, SLA und 1 verwendet. Erste Hefezellen, die GFP-markierte native und VCB-mutierte Mutanten SLA one exprimieren, werden mittels konfokaler Spinning-Disc-Mikroskopie abgebildet.

Zeitrafferfilme werden dann analysiert, um den Effekt der Mutation auf die Kinetik der Endozytose zu bestimmen. Zweitens werden zytosolische Hefeextrakte aus Wildtyp-Zellen als Quelle für Clathrin- und G-S-T-V-C-B-Fusionsprotein-Pull-Down-Assays hergestellt, um die Clathrin-VCB-Interaktion in vitro zu untersuchen. Ein dritter Gesamtextrakt wird aus Hefezellen hergestellt, die native und VCB-Mutanten exprimieren.

SLA one und Coun präzipitationen werden durchgeführt, um die effektive Mutation auf die Affinität der SLA one Clathrin-Bindung in vivo zu untersuchen. Letztendlich zeigen die gewonnenen Daten, dass die Mutation des VCB die Endozytose verzögert und dass die Bindung von SLA one an Clathrin verloren geht. In diesen Mutanten kann diese Methode jedoch Einblicke in die klappernde Adapterdynamik bei der Endozytose geben.

Es kann auch auf andere Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb von Vesikeln im sekretorischen Weg angewendet werden. Im Allgemeinen wussten die Individuen, dass diese Methode Schwierigkeiten haben würde, da Photobleaching das Fluoreszenzsignal von der geringeren Expression von markierten Proteinen aus einem endogenen Locus beeinträchtigen kann. Da dieses Protokoll die Bildanalyse mit biochemischen Studien physikalischer Wechselwirkungen kombiniert, ist es ein sehr leistungsfähiger Ansatz, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Endozytose steuern. Um Clathrin-Adapter-Wechselwirkungen während der Endozytose zu untersuchen, werden Hefestämme erzeugt, die GFP-Tag-native und mutierte Versionen des Clathrin-Adapto-Proteins SL exprimieren, wobei ein erstes A-GFP-Tag durch homologe Rekombination an den SL-eins-C-Terminus angehängt wird.

Als nächstes wird ein intermediärer Hefestamm erzeugt, indem das SLA-Eins-Gen selektiv gestört wird, wobei ein Fragment, das das RA-3-Gen mit spezifischen SL-Eins-flankierenden Sequenzen enthält, verwendet wird, um ein funktionelles Gen für die Expression der Mutante SL Eins aus dem Chromosomenlocus zu regenerieren. URA drei wird durch ein SL-Fragment ersetzt, das das Clathrin-Bindungsmotiv oder VCB enthält, in das Punktmutationen in VCB eingebaut wurden. Die resultierenden Hefestämme werden dann für die mikroskopische Analyse der Dynamik von SLA one verwendet.

An endozytären Stellen wird ein ähnlicher Ansatz für die Einführung der VCB-Mutation in nicht markierte SLA-One-Stämme wie TVY 6 1 14 verwendet, die für biochemische Experimente geeignet sind: Beginnen Sie mit der Züchtung des Hefestamms SLA one GFP und des SLA one mutierten Stammes SLA one A-A-A-G-F-P in vier Millilitern supplementierter SD-Medien bei 30 Grad Celsius in einem Rotator im Dunkeln. Sobald die Hefe einen OD 600 von 0,1 bis 0,4 erreicht hat, wird ein Milliliter jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und nach dem Schleudern eine Minute lang bei 4.000 g bei Raumtemperatur geschleudert, nach dem Schleudern etwa 950 Mikroliter der SUP-natanten resuspendierten Zellen in der verbleibenden Flüssigkeit verworfen, die etwa 50 Mikroliter betragen sollte. Geben Sie drei Mikroliter der Zellsuspension auf einen Objektträger und decken Sie ihn mit einem Glasdeckglas ab.

Schützen Sie die Probe vor Licht auf einer rotierenden Scheibe am Fokalmikroskop. Montieren Sie den Objektträger auf einem 100-fach-Ölimmersionsobjektiv. Lokalisieren Sie die richtige Fokusebene mit Hilfe einer Hellfeldbeleuchtung oder eines 488-Nanometer-Lasers mit geeigneten Filtern, um GFP anzuregen und zu detektieren Nehmen Sie Zeitrafferbilder von SLA one GFP und SLA one A-A-A-G-F-P in Zellen mit einer Belichtungszeit von 500 Millisekunden im Abstand von einem Bild pro Sekunde für 150 Sekunden auf.

GFP markiertes Punte erscheint auf der Innenfläche der Plasmamembran. Bleiben Sie einige Sekunden lang bestehen und bewegen Sie sich in Richtung der Mitte der Zelle, während das Signal schnell verschwindet, was auf die Demontage des Fells hinweist. Wählen Sie mit der Software einen Teil eines Zeitrafferbildes eines Wildtyp-SLA mit einem GFP aus, in dem Flecken zu sehen sind.

Bleiben Sie einige Sekunden lang und verschwinden Sie. Schneiden Sie diesen Bildausschnitt für jedes Bild der Zeitrafferbilder zu. Verwenden Sie als Nächstes die Software, um ein Glockenspieldiagramm zu generieren, das diesen Abschnitt in jedem Bild des 152. Zeitrafferbildes darstellt, indem Sie die Bilder entlang einer Achse ausrichten, die der hier verstrichenen Zeit entspricht, dies wird mit Adobe Photoshop demonstriert.

Berechnen Sie die Verweildauer jedes Flecks, indem Sie die Anzahl der Zeitrafferbilder, in denen er vorhanden ist, manuell zählen. Halten Sie die Ergebnisse im Glockendiagramm in einer Tabelle fest. Beachten Sie, dass sich jeder Punkt zum Inneren der Zelle hin krümmen sollte, wenn er verschwindet.

Reflektierende Endozytose und Zerlegung des Fells. Analysieren Sie fünf Spots pro Zelle für ca. 40 Zellen. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang mit SLA one A-A-A-G-F-P, um zytosolische Hefeextrakte für die Verwendung in GST-Proteinaffinitätsassays zu erhalten.

Bereiten Sie zunächst drei Liter des entsprechenden Hefestamms gemäß den Anweisungen im Begleittext vor. Suspendieren Sie das Pellet in drei bis fünf Millilitern sterilem Wasser und streicheln Sie es auf und ab, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Gießen Sie anschließend etwa 150 Milliliter flüssigen Stickstoff in ein 250 Milliliter Plastikbecherglas. Blitz.

Frieren Sie die Hefe ein, indem Sie sie tropfenweise in einem kreisförmigen Muster in den flüssigen Stickstoff geben. Um ein Verklumpen zu vermeiden, lassen Sie die Pellets nicht auftauen und fügen Sie mehr flüssigen Stickstoff hinzu. Gießen Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff in einen Mixerbehälter aus Edelstahl, um ihn zu kühlen. Lassen Sie den flüssigen Stickstoff fast vollständig verdampfen.

Dann die gefrorenen Hefepellets hinzufügen. Den Mixer mit einem kalten Gummistopfen verschließen und die Hefepellets 10 Sekunden lang mahlen. Drei- bis viermal umkehren, um den Inhalt zu vermischen, und den Mahlschritt zweimal mit dem Mahlen wiederholen.

Gefrorene Hefe hat einen pulverförmig aussehenden Kühltrichter mit einem konischen 50-Milliliter-Rohr mit flüssigem Stickstoff. Mit dem kalten Trichter die gemahlene Hefe in das Röhrchen umfüllen. Die gefrorene Mahlhefe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder sofort verwendet werden.

Um einen zytosolischen Extrakt zu erhalten, wiegen Sie drei Gramm gefrorene gemahlene Hefe TV Y 6 1 4 in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und reaktivieren Sie die Suspension bei drei Millilitern Raumtemperatur. Puffern Sie eine Cocktailkappe mit Proteasehemmer und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, bis der Inhalt vollständig aufgetaut ist. Lege es auf Eis.

Den Extrakt 20 Minuten lang bei 300.000 g bei vier Grad Celsius ultrazentrifugieren. Nach dem Schleudern den Supinat- oder zytosolischen Extrakt vorsichtig mit Perpet in ein konisches Röhrchen auf Eis überführen. Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Spitze ab und fügen Sie dann 100 Mikroliter einer 50%igen Glutathion-Sphero-Aufschlämmung in Puffer A zum zytosolischen Extrakt hinzu. Stellen Sie das Röhrchen bei einer Temperatur von vier Grad Celsius auf einen Rotator, nachdem sich die Probe 15 Minuten lang gedreht hat.

Schleudern Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius für zwei Minuten bei 1000 G. Übertragen Sie das Snat, bei dem es sich um den zytosolischen Extrakt handelt, in ein frisches Röhrchen, reservieren Sie 50 Mikroliter für die Eingangskontrollprobe. Das Einfrieren wird zu diesem Zeitpunkt nicht empfohlen. Halten Sie den Extrakt immer auf Eis und fahren Sie mit dem Experiment fort.

Um GST-Fusionsprotein-Affinitätsassays durchzuführen, fügen Sie einen Milliliter PBS, 30 Mikroliter einer 50%igen Glutathion-Sphero-Aufschlämmung in Puffer A und 50 Mikrogramm dialysiertes G-S-T-G-S-T-V-C-B oder mutiertes G-S-T-V-C-B in markierte Fuge-Röhrchen hinzu. Raumtemperatur 30 Minuten lang drehen, um das Binden zu ermöglichen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit PBS und einmal mit Puffer und Zentrifuge.

10 Sekunden bei 5.000 g nach jeder Wäsche, dann einen Milliliter Hefezytosolextrakt hinzufügen. Stellen Sie das Röhrchen bei einer Temperatur von vier Grad Celsius auf einen Rotator, nachdem sich die Probe eine Stunde lang gedreht hat. Schleudern Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius für 10 Sekunden bei 5.000 g herunter.Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Puffer A mit Puffer A mit 0,1 % Tritton X 101 Mal mit Puffer A nach jedem Waschgang zentrifugieren Sie bei vier Grad Celsius für 10 Sekunden.

Bei 5.000 G nach dem letzten Spin. Verwenden Sie die Gelladespitze, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Um zu einem späteren Zeitpunkt fortzufahren, geben Sie 15 Milliliter zweifachen Lammlee-Probenpuffer in jedes Röhrchen. Legen Sie die Proben auf einen Heizblock und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 96 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Proben dann 10 Sekunden lang bei 5.000 g, um die Probe auf den Boden des Röhrchens zu bringen.

Analysieren Sie die Proben durch Immunblotting mit einem Antikörper gegen die Clathrin-Schwerkette, um Gesamtzellextrakte für Co-Fällungsexperimente zu erhalten. Bereiten Sie gefrorene gemahlene Hefeproben wie zuvor vor diesem Mal vor, wobei der Stamm TVY sechs 14 den Wildtyp SL one exprimiert, der SL eins A A ein Stamm ist, der eine L-L-D-L-Q- bis A-A-A-L-Q-Mutation in TY 6 14 trägt. Hintergrund und ein SL ein Delta-Stamm, der eine Deletion des SL ein Gen trägt, wie z.B. GPY 3 1 3 0 Weg.

Zwei Gramm der gefrorenen gemahlenen Hefe in konische Röhren und Reus. Suspendieren Sie sie in zwei Millilitern Puffer bei Raumtemperatur, einem Proteasehemmer-Cocktail und einer 2%triton X 100-Kappe, drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, bis es vollständig aufgetaut ist, und inkubieren Sie es dann 10 Minuten lang auf Eis. Periodisches Mischen durch Inversion.

Füllen Sie das Material in Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie es 15 Minuten lang bei 16.000 Grad Celsius. G vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Den Sup-, Naant- oder Gesamtzellextrakt in ein konisches Röhrchen auf Eis geben.

Mit einer Pipette 100 Mikroliter eines 50%igen Proteins, eine Sphärosuspension in Puffer, hinzufügen und 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius drehen. Dann werden die Kügelchen durch Zentrifugation bei vier Grad Celsius für zwei Minuten bei 1000 G heruntergeschleudert und der S-Überstand in ein frisches Röhrchen überführt. Reservieren Sie 50 Mikroliter Extrakt für die Eingangskontrolle Zur Durchführung von Co-Immunpräzipitationsassays.

Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu, 30 Mikroliter eines 50%igen Proteins. Eine Sphäro-Gülle in Puffer A und zwei Mikrogramm eines Kaninchen-Anti-Sla. Ein Antikörper auf markierte Mikrozentrifugenröhrchen.

30 Minuten bei Raumtemperatur drehen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit PBS und einmal mit Puffer. A mit 1%tritton x 100.

Füge einen Milliliter der gesamten Hefeextrakte hinzu. SLA eins, SLA eins A A A und SLA ein Delta. Eine Stunde lang bei vier Grad Celsius drehen.

10 Sekunden lang bei 5.000 g drehen, um die Perlen nach dem Schleudern zu pelletieren. Entsorgen Sie das SUP-Material und waschen Sie die Kügelchen schnell dreimal mit Puffer A mit 0,1 % Tritan x 101 Mal mit Puffer. Schleudern Sie die Kügelchen noch einmal herunter und entfernen Sie mit einer Gelladespitze so viel Flüssigkeit wie möglich.

Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Um zu einem späteren Zeitpunkt fortzufahren, geben Sie 15 Mikroliter zweifachen Probenpuffer in jedes Röhrchen. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 96 Grad Celsius und drehen Sie sich 10 Sekunden lang bei 5.000 g. Analysieren Sie die Proben durch Immunblotting mit einem Antikörper gegen die Clathrin-Schwerkette. Hier.

Links werden die Ergebnisse der Lebendzellbildgebung von Wildtyp und Mutante SL eins verglichen. Eine einzelne Hefezelle ist mit SLA eins-positiven endozytären Regionen an der Zellperipherie grün dargestellt. Der Bereich zwischen den weißen Linien entspricht dem Bereich, aus dem die auf der hellen Seite gezeigten Kräfte erzeugt wurden.

Es ist zu beachten, dass endozytäre Stellen in der Mutante signifikant länger persistieren, etwa 80 Sekunden als beim Wildtyp, etwa 30 Sekunden, was auf einen Defekt in der Fellbildung hinweist. Die physikalische Wechselwirkung zwischen Clathrin und der Clathrin-Box der SLA-One-Variante wurde mit GST Fusion Protein bewertet. Affinitätsassays, GST fusioniert mit SLA ein Fragment AA 7 98 bis 8 1 3, das die Sequenz L-L-D-L-Q enthält.

Die entsprechende A-A-A-L-Q-Mutante oder GST allein wurde an Glutathion und Sero-Kügelchen gebunden und mit einem zytosolischen Extrakt aus Wildtyp-Hefezellen inkubiert. Die assoziierten Proteine wurden angedeutet und mittels Immunoblotting auf Clathrin-Schwerkette analysiert, wie hier zu sehen. Clathrin bindet die G-S-T-V-C-B-B-für nicht an GST oder G-S-T-V-C-B-Mutante, was darauf hindeutet, dass eine intakte Variante der Clathrin-Box für die SLA-1-Bindung an Clathrin erforderlich ist.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, immer in der Nähe der Flamme zu arbeiten, um eine Kontamination Ihrer GS-Kulturen zu vermeiden. Die Markierung anderer fluoreszierender Proteine wie RFP kann durchgeführt werden, um die Kolokalisation verschiedener Proteine zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Protein-Protein-Wechselwirkungen mit biochemischen und fluoreszierenden Zellbildgebungstechniken untersuchen können.