Name: Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Erfahren Sie die ortsspezifische Mutagenese in Anopheles-Mückenzellen mittels LNA-modifizierter Oligonukleotide. Diese Methode ermöglicht präzise Geneditierung durch Transfektion und Flusszytometrie zur Quantifizierung der Genkonversionsfrequenzen.

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Wir möchten Abbie Spinner an der California National Primate Research Center für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 und AI078183 unterstützt.

<ol><li> Vor dem Start des Protokolls ist es wichtig, festzustellen, dass die Mücke Zellen im Experiment verwendeten gesund sind und bei ~ 80% Konfluenz, wenn Anhänger (Abbildung 1). Overgrown oder kranken Zellen wird in geringer Transfektionseffizienz führen und inkonsistente Ergebnisse liefern. </li><li> Warm up alle Medien vor, in einem 28 ° C Wasserbad für 30 Minuten verwenden. <ol class="lalpha"><li> A. stephensi MSQ43 Zellen benötigen E5 Medium: MEM, Earle w / Glutamin, 5% hitzeinaktiviertem FCS, 0,2% D-Glucose, 1% Penicillin-Streptomycin Antibiotikum, und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren. </li><li> A. gambiae SUA5B Zellen benötigen S2 Medium: Schneiders Drosophila Medium, 5% hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin-Streptomycin Antibiotikum </li></ol></li><li> Tauwetter und speichern Sie alle Transfektionsreagenz Materialien, Plasmide und Oligonukleotide auf dem Eis. </li><li> Alle Verfahren sollten in einer Gewebekultur Kapuze mit sterilen Technik durchgeführt werden. </li><li> Für adhärente Zellen (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) absaugen alten Medien, ohne die Zellen, fügen Sie eine äquivalente Menge an frischem Medium, das zu 28 wurde ° C erwärmt und dann abspülen Zellen vom Boden der Kolben mit einer Pipette. </li><li> Die Konzentration der Zellen zu bestimmen und angepasst, um eine endgültige Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml. Die Zellen können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden während der Vorbereitung Transfektionsreagenz Materialien. </li><li> 1 ml der Moskito-Zellen (1x10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Richten Sie eine Platte für jede experimentelle Bedingung (siehe unten). Tabelle I ist ein Pipettierschema für eine allgemeine Transfektion. Tabelle II stellt fünf Bedingungen für eine erfolgreiche Mutagenese eines einzelnen Nukleotids mit BFP-spezifische LNA-ONs testen. Die ersten beiden, pGFP und pBFP, sind positive und negative Kontrollen. Die restlichen sind experimentelle Bedingungen pBFPs mit steigenden Konzentrationen von BFP-spezifische LNA-ons. In den Schritten 8 bis 12, fügen Sie entsprechende Volumina der Reagenzien entsprechend für jede Bedingung. </li><li> Transfer-Plasmid-DNA in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß und fügen entsprechende Volumen von EC-Puffer. <ol class="lalpha"><li> Für 1 ul Plasmid-DNA (1 pg / mL), fügen Sie 99 ul der EG-Puffer. </li><li> Für 1 ul pGFP (1 g / mL), fügen Sie 99 ul der EG-Puffer. </li><li> Für 1 ul pBFP (1 g / mL), fügen Sie 99 ul der EG-Puffer. </li><li> Für 1 ul pBFP (1 g / mL) und 1 ul ON (pg / mL), fügen Sie 98 ul der EG-Puffer. </li><li> Für 1 ul pBFP (1 g / mL) und 5 ul ON (1 g / mL), fügen Sie 94 ul der EG-Puffer. </li><li> Für 1 ul pBFP (1 g / mL) und 10 ul ON (1 g / mL), fügen Sie 89 ul der EG-Puffer. </li></ol></li><li> Dann langsam zugeben Enhancer pro 1 pg DNA verwendet. <ol class="lalpha"><li> Für 1 ul Plasmid-DNA, addieren Sie 8 ul Enhancer. </li><li> Für 1 ul pGFP, addieren Sie 8 ul Enhancer. </li><li> Für 1 ul pBFP, addieren Sie 8 ul Enhancer. </li><li> Für 1 ul pBFP und 1 ul ON, werden 16 ul Enhancer. </li><li> Für 1 ul pBFP und 5 ul ON, fügen Sie 48 ul Enhancer. </li><li> Für 1 ul pBFP und 10 ul ON, fügen Sie 88 ul Enhancer. </li></ol></li><li> Vortex DNA / Puffer / Enhancer Mischung für 1 sec und stellen Sie sicher, die gesamte Lösung ist an der Unterseite des Rohres. Dann bei Raumtemperatur Inkubation für 5 min. </li><li> Add Effectene Reagenz pro 1 pg Plasmid-DNA und Vortex für 10 Sekunden. Bestätigen Sie, dass die gesamte Lösung im unteren Bereich der Röhre und dann bei Raumtemperatur inkubieren für 10 min. <ol class="lalpha"><li> Für 1 ul Plasmid-DNA, mit 10 ul Effectene (Tabelle I). </li><li> Für 1 ul pGFP, mit 10 ul Effectene (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP, mit 10 ul Effectene (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP und 1 ul ON, mit 20 ul Effectene (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP und 5 ul ON, mit 60 ul Effectene (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP und 10 ul ON, fügen Sie 110 ul Effectene (Tabelle II). </li></ol></li><li> Bringen Sie jedes Röhrchen auf ein Endvolumen von 1000 ul, indem erwärmt Medien tropfenweise zu der DNA / Puffer / Enhancer / Effectene Mischung. DNA ausfallen kann an dieser Stelle, wenn die Medien zu schnell aufgenommen wird. Vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal zu mischen. <ol class="lalpha"><li> Für 1 ul Plasmid-DNA, fügen Sie 882 ul Medium (Tabelle I). </li><li> Für 1 ul pGFP, fügen Sie 882 ul Medium (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP, fügen Sie 882 ul Medium (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP und 1 ul ON, fügen Sie 864 ul Medium (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP und 5 ul ON, fügen Sie 792 ul Medium (Tabelle II). </li><li> Für 1 ul pBFP und 10 ul ON, fügen Sie 702 ul Medium (Tabelle II). </li></ol></li><li> Next langsam 1 mL der entsprechenden DNA / Enhancer / Effectene Mischung in jede Vertiefung ein Tropfen auf einmal. </li><li> Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und die Transfektion Mischung. INCUBATe-Zellen unter normalen Wachstumsbedingungen. </li><li> Einen Tag nach der Transfektion vorsichtig aspirieren aus Medien und langsam mit einem äquivalenten Volumen an frisch aufgewärmt Medien zu ersetzen. Es ist wichtig, nicht stören die Zellschichten an der Unterseite der Brunnen, wenn dies zu tun. </li><li> Zwei Tage nach der Transfektion untersucht positive Kontroll-Zellen mit pGFP unter Fluoreszenzmikroskop zu Transfektionseffizienz (Abbildung 2) zu bestimmen, transfiziert. </li><li> SUA5B Zellen wachsen sehr schnell und wird überwuchert. Vier Tage nach der Transfektion dünne dieser Zellen durch Absaugen aus den alten Medien und das Hinzufügen langsam ein äquivalentes Volumen an frisch aufgewärmt Medien. </li><li> Nach dem Hinzufügen neuer Medien in die Vertiefungen, trennen Sie alle Zellen aus dem Boden jeder Vertiefung durch Pipettieren auf und ab, werfen Sie die Hälfte des Volumens (1 ml) der Zelle Mischung geben und 1 ml frisches erwärmt Medien auf das Endvolumen auf 2 zu bringen mL. </li><li> Überprüfen Zellen täglich um sicherzustellen, dass sie gesund sind und nicht überwuchert, dünn wie nötig. </li><li> Lassen Sie die Zellen, die unter normalen Bedingungen für die fünf Minuten vor sieben Tagen nach der Transfektion wachsen, bevor sie zu sammeln für die Analyse. </li><li> In fünf Minuten vor sieben Tagen nach der Transfektion, sammeln die Zellen durch Absaugen der alten Medien in alle Brunnen und die Zugabe von 1 ml sterile Raumtemperatur PBS in jede Vertiefung. </li><li> Lösen Zellen vom Boden der gut-und Abpipettieren und Transfer Zellgemisch zu 5 ml Schnappdeckel Rohre und sofort analysieren Zellen über Durchflusszytometrie. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Transfizierte gesunde A. stephensi MSQ43 (A) und A. gambiae SUA5B (B)-Zellen bei etwa 80% Konfluenz. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. A. stephensi MSQ43 (A) und A. gambiae SUA5B (B) Zellen mit positiven Kontrolle GFP-exprimierenden Plasmid transfiziert. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Durchflusszytometrie Daten bestätigt Umwandlung von BFP mit GFP über Mutagenese eines einzelnen Nukleotids nach der Transfektion mit BFP-spezifische gesperrt Nukleinsäure-modifizierte Oligonukleotide (LNA-ons). SUA5B Zellen wurden mit einem GFP-exprimierenden Plasmid (pGFP) als positive Kontrolle transfiziert, mit BFP exprimierenden Plasmid (pBFP) als negative Kontrolle, oder mit pBFP und steigenden Konzentrationen von BFP-spezifische LNA-ons. (A) Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie Daten, die zeigen von links nach rechts: vorwärts im Vergleich side scatter von lebenden Zellen, Propidiumiodid (PI)-negativen Zellen und GFP-positiven Zellen 5 Tage nach der Transfektion. (B) Graph des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen in (A) nach der Transfektion mit pBFP und steigenden Konzentrationen von LNA-ONs gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle I. Die Transfektion Bedingungen. <img src="/files/ftp_upload/2355/2355table2.jpg" alt="Tabelle 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 2"> Tabelle II. Transfektion Bedingungen in Abbildung 1 verwendet.

<ol><li>Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+controlling+malaria+transmission+in+the+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi.</a> PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Braasch, D. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid+%28LNA%29%3A+fine-tuning+the+recognition+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA.</a> Chem Biol. 8, 1-7 (2001).</li>
<li>Andrieu-Soler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transmission+of+targeted+gene+modification+using+single-stranded+oligonucleotides+with+flanking+LNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).</li>
<li>Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+nucleotide+exchange+in+Saccharomyces+cerevisiae+directed+by+short+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).</li>
<li>Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+accessibility+and+signal+specificity+in+live-cell+detection+of+BMP-4+mRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).</li>
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<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).</li>
<li>Blandin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+genetic+basis+of+resistance+to+malaria+parasites+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae.</a> Science. 326, 147-150 (2009).</li>
<li>Niare, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+loci+affecting+resistance+to+human+malaria+parasites+in+a+West+African+mosquito+vector+population%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population.</a> Science. 298, 213-216 (2002).</li>
<li>Riehle, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+malaria+infection+in+Anopheles+gambiae+is+regulated+by+a+single+genomic+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region.</a> Science. 312, 577-579 (2006).</li>
</ol>

Hier präsentieren wir ein in vitro Verfahren und Beweise für die gezielte Umwandlung von einem einzigen Nukleotid in einem episomalen Gen Ziel nach der Transfektion von LNA-ons in A. stephensi und A. gambiae Zellen. LNA-ON-vermittelte Gen-Konvertierung erfordert Induktion einer ortsspezifischen DNA-Reparatur-Reaktion, unsere Daten zeigen, dass Moskito-Zellen können diesen Mechanismus für die ortsspezifische Mutagenese zu unterstützen. Während die hier vorgestellte Methode auf Umwandlung einer ...

<table><tbody><tr><td>Effectene-Transfektionsreagenz</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Kontrollplasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg)</td><td>Invitrogen</td><td>K4935-00</td><td></td></tr><tr><td>BFP-Plasmid (pcDNA5/FRT/TO)</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>LNA-ONs</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Dr. Concordet&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>MEM, Earle&amp;rsquo;s mit Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>11095</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11730</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>10% D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>6-Loch-Kulturschalen</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr></tbody></table>

transfektion und mutagenese von zielgenen in mosquito-zellen durch locked nucleic acid-modifizierte oligonukleotide

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium Parasiten, der Erreger der Malaria, durch den Stich infizierter Anopheles-Mücken sich in mehr als 250 Millionen Neuinfektionen pro Jahr übertragen. Trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es noch keinen Impfstoff gegen Malaria, die die Notwendigkeit für neue Bekämpfungsstrategien. Ein innovativer Ansatz ist die Verwendung von gentechnisch veränderten Mücken wirksam zu kontrollieren Malaria-Parasiten-Übertragung. Absichtliche Veränderungen der Zell-Signalwege in der Mücke, durch gezielte Mutagenese, haben sich Parasiten Entwicklung 1 zu regeln. Aus diesen Studien, können wir beginnen, um potenzielle Gen-Targets für die Transformation zu identifizieren. Durch gezielte Mutagenese wurde traditionell auf die homologe Rekombination zwischen einem Zielgen und ein großer DNA-Molekül verlassen. Allerdings ist der Aufbau und die Verwendung solcher komplexer DNA-Moleküle für die Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien kostspielig, zeitaufwändig und oft ineffizient. Daher stellt eine Strategie mit gesperrten Nukleinsäure-modifizierte Oligonukleotide (LNA-ons) eine sinnvolle Alternative für die Einführung von künstlichen single nucleotide Substitutionen in episomalen und chromosomale DNA Gen-Targets (reviewed in 2). LNA-ON-vermittelte gezielte Mutagenese wurde verwendet, um Punktmutationen in Genen von Interesse in kultivierten Zellen von Hefe-und Mäuse 3,4 einzuführen. Wir zeigen hier, dass LNA-ONs verwendet werden, um ein einzelnes Nukleotid Änderung in einer transfizierten episomalen Ziel, das in einem Wechsel von blau fluoreszierenden Protein (BFP) zum Ausdruck grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression in beiden Anopheles gambiae und Anopheles stephensi Zellen führt einzuführen . Diese Umwandlung zeigt zum ersten Mal, dass eine wirksame Mutagenese von Zielgenen in Mücke-Zellen durch LNA-ons können vermittelt werden, und schlägt vor, dass diese Technik kann für Mutagenese von chromosomalen Ziele in vitro und in vivo.

Oligonukleotide können die Besucher genutzt werden speziell Ersatz eines einzelnen Nukleotids von transfizierten Zielgene in beiden<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Und<em&gt; Anopheles stephensi</em&gt; Zellen.

Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide

Plasmodium-Parasiten, die Erreger der Malaria, werden durch Stiche infizierter Anopheles-Mücken übertragen, was zu über 250 Millionen neuen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine neuartige Strategie für die gezielte Mutagenese in Anopheles-Mücken-Zellen zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst gesunde kultivierte Zellen für die Transfektion vorbereitet werden. Anschließend werden die Zellen durch Zugabe von Transfektionsreagenzien mit den entsprechenden Kontroll- und Test-DNAs transfiziert.Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Kontrollzellen auf Fluoreszenz zu überwachen und die Dichte der experimentellen Zellen zu verringern. Schließlich können die Genkonversionsfrequenzen in den experimentellen Zellen mittels Durchflusszytometrie fünf bis sieben Tage nach der Transfektion bestimmt werden. Letztendlich lassen sich Ergebnisse erzielen, die eine gezielte Mutagenese eines episomalen Genziels durch DNA-Reparatur zeigen, die durch gesperrte Nukleinsäure-Oligonukleotide induziert wurde.Hallo, ich bin Dr. Nazy Pacor aus dem Labor von Dr. Shirley Lockhart an der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der University of California Davis. Heute zeigen wir Ihnen ein neuartiges Verfahren zur gezielten Mutagenese von Anopheles-Mücken-Zellen. Wir verwenden dieses Verfahren, um die Funktion von Genen der angeborenen Immunantwort von Mücken durch gezielte Mutagenese zu untersuchen.Beginnen wir also. Vor Beginn des Protokolls sollten gesunde Mücken-Zellen in einer Konfluenz von etwa 80 % beschafft werden. Bei anhaftenden, überwachsenen oder geschädigten Zellen ergibt sich eine geringe Transfektionseffizienz, was zu inkonsistenten Ergebnissen führt.Dieses Protokoll wird an Ananais gambier SUA fünf B-Zellen demonstriert. Es können jedoch auch Ananais ensi MS Q4 drei Zellen verwendet werden. Beginnen Sie die Transfektionsvorbereitung, indem Sie S zwei Medium 30 Minuten lang in einem 28 Grad Celsius warmen Wasserbad erwärmen.Alle Transfektionsreagenzien, Plasmide und Oligonukleotide auf Eis legen. Unter sterilen Bedingungen im Zellkulturwerk alter Medium abpipettieren, ohne die Zellen zu stören, und mit einem äquivalenten Volumen an frischem, vorgewärmtem Medium ersetzen, um die Zellen vom Boden des Kolbens abzuspülen. Anschließend die Zellkonzentration mit einer Pipette bestimmen und auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter einstellen.Nach der Einstellung der Endkonzentration je ein Milliliter Mücken-Zellen in jede Vertiefung einer sechsbrüchigen Platte geben. Während die Zellen in der Platte bei Raumtemperatur aufbewahrt werden können, während die Reagenzien für die Transfektion vorbereitet werden, das Transfer-Plasmid-DNA in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Hier wird ein Plasmid, das das grün fluoreszierende Protein exprimiert, als positiver Kontrolle verwendet, und ein Plasmid, das das blau fluoreszierende Protein exprimiert, als negative Kontrolle.Die Test-DNA enth&auml;lt ebenfalls das BFP-exprimierende Plasmid, jedoch mit steigenden Konzentrationen an BFP-spezifischen, gesperrten Nukleins&auml;uren, modifizierten Oligonukleotiden oder LNA-os. Nachdem die DNA aliquotiert wurde, geben Sie pro Mikrogramm Plasmid-DNA und L-N-A-O-N jeweils 99 Mikroliter Kage- und EC-Puffer hinzu. Anschlie&szlig;end geben Sie langsam acht Mikroliter Enhancer pro Mikrogramm verwendeter DNA hinzu und wirbeln die DNA-Puffer-Enhancer-Mischung. Ein Sekunde lang die Lösung kurz zentrifugieren und die Proben fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Je Mikrogramm PlasmadNA 10 Mikroliter Wirkreagenz hinzufügen und 10 Sekunden lang verwirbeln. Die Lösung kurz auf den Boden der Röhrchen zentrifugieren und anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation das Endvolumen jedes Röhrchens durch langsames Hinzufügen von frischem, vorgewärmtem Medium auf 1000 Mikroliter bringen. An diesem Punkt kann die DNA ausfallen, wenn das Medium zu schnell zugegeben wird; vorsichtig durch dreimaliges oder viermaliges Auf- und Abpipettieren mischen.Schließlich langsam einen Milliliter der entsprechenden DNA-Verstärker enthaltenden Mischung je Zellprobe hinzufügen, und zwar tropfenweise. Die Platte vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und der Transfektionsmischung sicherzustellen.Inkubieren Sie die Zellen einen Tag nach der Transfektion unter normalen Wachstumsbedingungen, aspirieren Sie vorsichtig das Medium von den Zellen ab und ersetzen Sie es langsam durch ein äquivalentes Volumen frischen, vorgewärmten Mediums. Achten Sie darauf, die Zellschichten am Boden der Vertiefungen nicht zu stören. Zwei Tage nach der Transfektion untersuchen Sie die positiven Kontrollzellen, die mit einem GFP-exprimierenden Plasmid transfiziert wurden, unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen.Vier Tage nach der Transfektion s uua müssen fünf B-Zellen verdünnt werden, da sie sehr schnell wachsen und übersiedeln würden. Dazu das alte Medium von den Zellen abpipettieren und langsam ein äquivalentes Volumen frischen, vorgewärmten Mediums hinzufügen. Nach dem Hinzufügen des neuen Mediums zu den Vertiefungen alle Zellen vom Boden jeder Vertiefung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren lösen, die Hälfte des Volumens der Zellsuspension verwerfen und ein Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium hinzufügen, um das Endvolumen auf zwei Milliliter aufzufüllen.Überprüfen Sie die Zellen täglich, um sicherzustellen, dass sie gesund sind und nicht überwachsen. Verdünnen Sie sie bei Bedarf. Lassen Sie die Zellen fünf bis sieben Tage nach der Transfektion unter normalen Bedingungen wachsen, bevor Sie sie zur Analyse sammeln.Fünf bis sieben Tage nach der Transfektion sammeln Sie die Zellen, indem Sie das alte Medium abpipettieren und je einen Milliliter sterilem PBS bei Raumtemperatur hinzufügen. Lösen Sie die Zellen vom Boden jedes Wells durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Überführen Sie schließlich das Zellgemisch in Fünf-Milliliter-Schnappdeckelröhrchen und analysieren Sie die Zellen unverzüglich per Durchflusszytometrie.Ein Abwehr-Auge. MS Q4 drei und eine Gambier UA fünf B-Zellen wurden mit einem positiven Kontroll-Plasmid, das GFP exprimiert, transfiziert. Die Zellen werden unter Licht- und Fluoreszenzmikroskopie sowie als Überlagerungsbild gezeigt; Durchflusszytometriedaten bestätigen die Umwandlung von BFP in GFP durch Mutagenese eines einzelnen Nukleotids nach Transfektion mit BFP-spezifischem LNAO Ns. UA fünf B-Zellen wurden entweder mit dem GFP-exprimierenden Plasmid als positive Kontrolle, mit einem BFP-exprimierenden Plasmid als negative Kontrolle oder mit dem BFP-exprimierenden Plasmid und steigenden Konzentrationen an BFP-spezifischem LNAO Ns transfiziert.Die Gating-Strategie für die Durchflusszytometriedaten zeigt die Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Seitwärtsstreuung von lebenden Zellen, propidiumiodid-negativen Zellen und GFP-positiven Zellen fünf Tage nach der Transfektion. Der Prozentsatz an GFP-positiven Zellen nach Transfektion mit einem BFP-exprimierenden Plasmid und steigenden Konzentrationen von LNAO NS ist hier in grafischer Form dargestellt und bestätigt die Umwandlung von BFP in GFP durch L aos. Soeben haben wir Ihnen ein neuartiges Verfahren zur standortgerichteten Mutagenese von Anomalien in Mücken-Zellen gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass Ihre Zellen gesund sind und vor der Transfektion die richtige Dichte aufweisen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Wir berichten mit einer künstlichen intronischen kleine RNA Ausdruck Strategie, um eine mangelfreie rekombinante Aedes Aegypti Densovirus (AaeDV) in Vivo -Delivery-System zu entwickeln. Eine detaillierte Anleitung für den Bau, die Verpackung und die Quantitative Analyse der rAaeDV Vektoren sowie für Larven Infektion wird beschrieben.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Das bipartite GAL4-UAS-System ist ein vielseitiges Werkzeug zur Modifikation der Genexpression in kontrolliert raumzeitlicher Weise, das eine funktionelle genetische Analyse in Anopheles gambiae ermöglicht. Die beschriebenen Verfahren für die Verwendung dieses Systems sind eine semi-standardisierte Klonierungsstrategie, Sexing und Screening von Puppen auf fluoreszierende Proteinmarker und Embryofixierung.

Einsatz des GAL4-UAS-Systems für die funktionelle Genetik bei Anopheles gambiae

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Die hier berichteten Protokolle veranschaulichen drei alternative Möglichkeiten, die Leistung von gentechnisch veränderten Moskitos zu bewerten, die für die Vektorkontrolle in laboreigenen Kleinkäfigversuchen bestimmt sind. Jedes Protokoll ist auf die spezifische Modifikation des Mückenstamms (Gene Drive oder Non-Gene Drive) und die Art der gemessenen Parameter zugeschnitten.

Kleinkäfig-Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anopheline-Mücken

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Erfahren Sie die ortsspezifische Mutagenese in Anopheles-Mückenzellen mittels LNA-modifizierter Oligonukleotide. Diese Methode ermöglicht präzise Geneditierung durch Transfektion und Flusszytometrie zur Quantifizierung der Genkonversionsfrequenzen.

Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide

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