Peptide aus Phage Display Bibliothek Genexpression modulieren in mesenchymalen Zellen und potenzieren Osteogenesis in unikortikale Knochendefekten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, Sequenzen zu identifizieren, die die Differenzierung mesenchymaler Zellen verstärken und die Knochenreparatur fördern. Der erste Schritt ist die Isolierung mittels Biop-Panning des Phagen, der an Knochen bindet. Anschließend werden die Peptidsequenzen identifiziert, die an mesenchymale Zellen binden, und es werden die darauffolgenden Veränderungen in der Genexpression bestimmt.

Führen Sie Experimente durch, um zu bestimmen, wie die Peptidsequenzen zu Knochen für regenerative Zwecke gebracht werden können. Als letzten Schritt untersuchen Sie die Knochenreparatur histologisch; zusammen genommen können die Ergebnisse wichtige Einblicke in die Mechanismen der Zelldifferenzierung in vitro und der Knochenreparatur in vivo liefern. Die Vorteile der Verwendung der Biop-Panning-Technik mit einer Phagen-Display-Bibliothek bestehen darin, dass wir Peptide identifizieren konnten, die gezielt Knochen ansprechen und zur Stimulation der Differenzierung mesenchymaler Zellen sowie zur Potenzierung der Knochenreparatur eingesetzt werden können.

Schließlich könnten diese Peptidsequenzen in therapeutischen Modalitäten zur Knochenreparatur und zur Behandlung von Knochenschwund wie Osteopenie und Osteoporose nützlich sein. Auf der Grundlage einer Studie, in der ULA und Pascal zeigten, dass mittels biop-Panning Peptidsequenzen isoliert werden können, die auf Blutgefäße abzielen, entschieden wir uns, diese Methode anzupassen, um Mechanismen im Knochen zu untersuchen. Für das in-vivo-Biop-Panning-Verfahren wurden 10-mal 10 hoch 10 Plaque-bildende Einheiten der N-E-B-P-H-D-12-Phagen-Display-Peptidbibliothek durch das Herz einer 10 Wochen alten BALB/c-Maus perfundiert.

Nach ungefähr fünf Minuten das Mäuschen euthanisieren, die Femora freilegen und dissezieren, die Enden abschneiden und das Knochenmark entfernen. Den linken Femur innen und außen zehnmal mit PBS spülen. Anschließend den Knochen zu den ER 2 5 3 7-Bakterien geben.

Um nicht gebundene Phagen zu entfernen, verwenden Sie 2 % fettfreie Milchpulver, die mit einer 21-Gauge-Nadel in einer Spritze enthalten ist, um das intermediäre Kanal des rechten Femurs 10-mal zu spülen. Eluieren Sie nun die gebundenen Phagen aus dem intermediären Kanal mit Glycin-Puffer, pH 2,2, der mit einer Mol Tris-Pufferlösung neutralisiert wurde.

Um den Phagen zu amplifizieren, geben Sie EIT zu ER 2 5 3 7-Bakterien hinzu und kultivieren Sie diese 4,5 Stunden lang. Überführen Sie das Überstandsmaterial vorsichtig in frische Röhrchen und fallen Sie den Phagen dreimal durch Zugabe von Polyethylenglykol aus. Fügen Sie Natriumchloridlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Schließlich das Pellet in TBS mit 0,02 % Natriumazid resuspendieren. Die Phagen auf Platten aufplattieren, um die Plaque-bildenden Einheiten der amplifizierten EITs zu bestimmen. Wiederholen Sie das In-vivo-Bio-Panning-Verfahren für die eluierten und nicht eluierten Phagen jeweils viermal.

Amplifizieren Sie gepoolten Phagen in bakteriellen Kulturen. Reinigen und quantifizieren Sie die DNA-Sequenz, die endgültige Phagen-DNA, unter Verwendung des mit dem Phagen-Display-Kit bereitgestellten Primers 98. Berechnen Sie wichtig die Häufigkeit der Repräsentation der Phagen-DNA-Sequenz.

Synthetisieren Sie nun Peptide, die eine Glycin-Glycin-Glycin-Serin-Lysin-Sequenz enthalten, und amplifizieren Sie D1-Zellen, eine in unserem Labor etablierte, geklonte, multipotente Zelllinie aus murinem Knochenmark-Stromal, die bei 90 % Konfluenz vorlag. Behandeln Sie die Zellen mit Trypsin, zentrifugieren Sie, um ein Zellpellet zu erhalten, und zählen Sie die Zellen, um sie für die Peptidfärbung auf mit Gelatine beschichteten Kammerobjektträgern zu plattieren und 24 Stunden lang zu kultivieren.

Waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie sie 30 Minuten lang mit 4 % Paraldehyd. Führen Sie nun Blockierungsinkubationen mit Glycin, gefolgt von BSA Aden und BBSA, sowie Biotin-Blockierungslösungen durch.

Fügen Sie 100 µM biotinylierte L7- und R1-Peptide hinzu. Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang. Geben Sie eine 1:1000-Verdünnung von LOR Stripping Cover zu und bedecken Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie. Inkubieren Sie es 30 Minuten lang in einer dunklen Schublade.

Waschen Sie die Zellen und montieren Sie die Deckgläser mit Vector Shield Montagemedium. Analysieren Sie die Präparate nun 24 Stunden vor der Operation unter einem Fluoreszenzmikroskop. Weichen Sie die Gelatineschwämme ein.

Überführen Sie die Gel-Schaum-Zylinder mit 20 Mikromolar Peptid, entweder L sieben oder R eins, oder PBS-Puffer ohne Peptid in sterile 12-Loch-Kulturschalen und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius bis zum Zeitpunkt der Operation. Bewahren Sie den Gel-Schaum-Verbund bis zur Verwendung auf Eis auf.

Erstellen Sie mithilfe eines pneumatischen Bohrers unter Spülung mit Kochsalzlösung einen großen, ovalen, unikortikalen Defekt mit einer Breite von drei Millimetern und einer Länge von acht Millimetern. Behandeln Sie den Knochendefekt mit vorbereiteten Gelatineschwämmen, indem Sie alle implantierten Scaffolds vorsichtig eintippen. Töten Sie die Ratten aus und sammeln Sie die Tibiae zu definierten Zeitpunkten, überprüfen Sie sorgfältig den Knochendefekt und fixieren Sie die gewonnenen Tibiae in 10 % neutral gepufferter Formalinlösung zur Paraffineinbettung.

Färben Sie abschließend alle Gewebeschnitte mit Hämatoxylin-Eosin, um die osteo-matrix zu markieren. Mit Fluorescein-isothiocyanat-markiertes Aden ermöglicht die mikroskopische Detektion der Bindung von Peptiden an in vitro kultivierte Zellen. Hier binden die Peptide an mesenchymale Zellen in Kultur, um die osteogene Wirkung der Peptide auf Zellen zu bestimmen.

Mesenchymale Zellen in Kultur können in vitro mit Testpeptiden behandelt werden, um Veränderungen in der Zellmorphologie zu untersuchen. Beispielsweise beginnen die Zellen am vierten Tag zu aggregieren, und die Aggregate vergrößern sich im Laufe der Zeit, um Knötchen zu bilden. Interessanterweise zeigt ein mit H und E gefärbter Knochenabschnitt Autofluoreszenz unter UV-Licht.

Dieser größere Kontrast zwischen Knochen- und Nicht-Knochengewebe erleichtert Analysen, die den Knochenanteil in den Schnitten quantifizieren, um die Knochenreparatur in den mit Gelfoam plus Peptid behandelten Defekten zu bestimmen. Im Vergleich zu Gelfoam allein zeigten hier Defekte, die mit Peptid gefüllt wurden, im Zeitverlauf die stärkste kortikale Reparatur. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, bei der Dateneingabe äußerst methodisch vorzugehen, da im Laufe der Zeit zwangsläufig eine große Anzahl von Proben anfällt, bis die endgültige Gruppe der Peptide ausgewählt ist.

Die Entwicklung des in-vivo-Biop-Pannings als Methode zur Identifizierung von Peptiden, die gezielt Knochen ansteuern, bedeutet, dass wir nun potenzielle Wirkstoffe haben, die als Therapie zur Knochenreparatur und bei Knochenschwund eingesetzt werden könnten. Einer der Mechanismen, die der Knochenreparatur zugrunde liegen, ist ebenfalls an Knochenschwund beteiligt. Ein detaillierteres Verständnis dieser Mechanismen sowie die Verfügbarkeit von Werkzeugen, die zur Behandlung von Erkrankungen wie verzögerten Frakturen und Osteoporose eingesetzt werden könnten, wird dazu beitragen, die Therapien zu verbessern, die für die Gesundheitsversorgung entwickelt werden können.