Peptide aus Phage Display Bibliothek Genexpression modulieren in mesenchymalen Zellen und potenzieren Osteogenesis in unikortikale Knochendefekten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Sequenzen zu identifizieren, die die Differenzierung mesenchymaler Zellen potenzieren und die Knochenreparatur fördern. Der erste Schritt besteht darin, den Phagen, der an den Knochen bindet, durch Biop-Panning zu isolieren. Fahren Sie fort, um die Peptidsequenzen zu identifizieren, die an mesenchymale Zellen binden, und bestimmen Sie auch die nachfolgenden Veränderungen der Genexpression.

Führen Sie Experimente durch, um zu bestimmen, wie die Peptidsequenzen zu regenerativen Zwecken an den Knochen abgegeben werden können. Als letzten Schritt untersuchen Sie die Knochenreparatur histologisch zusammengenommen können die Ergebnisse wichtige Einblicke in die Mechanismen der Zelldifferenzierung in vitro und der Knochenreparatur in vivo liefern. Die Vorteile der Verwendung der Biop-Panning-Technik mit einer Phagen-Display-Bibliothek bestehen darin, dass wir Peptide identifizieren konnten, die auf Knochen abzielen und zur Stimulierung der Differenzierung von mesenchymalen Zellen und zur Potenzierung der Knochenreparatur verwendet werden können.

Letztendlich können diese Peptidsequenzen in therapeutischen Modalitäten für die Knochenreparatur und für die Behandlung von Knochenschwund wie Osteopenie und Osteoporose nützlich sein. Basierend auf einer Studie, in der ULA und Pascal zeigten, dass Biop-Panning zur Isolierung von Peptidsequenzen verwendet werden kann, die auf Blutgefäße abzielen, haben wir uns entschieden, diese Methode an die Abfrage von Mechanismen im Knochen anzupassen. Für das in vivo Biop-Panning-Verfahren wurden 10 mal 10 bis zur 10. Plaque-Leistungseinheit der N-E-B-P-H-D 12 Phagen-Display-Peptidbibliothek durch das Herz einer 10 Wochen alten Klappe C Maus perfundiert.

Nach etwa fünf Minuten euthanasieren Sie die Maus, legen Sie die Oberschenkelknochen frei und präparieren Sie sie, schneiden Sie die Enden ab und entfernen Sie das Knochenmark. Spülen Sie den linken Oberschenkelknochen sowohl innen als auch außen 10 Mal mit PBS. Geben Sie dann den Knochen zu ER 2, 5, 3, 7 Bakterien.

Um nicht gebundene Phagen zu entfernen, verwenden Sie 2% getrocknete Magermilch in einer Spritze mit einer 21-Gauge-Nadel, um den Zwischenkanal des rechten Oberschenkelknochens 10 Mal zu spülen. Nun eluieren Sie den gebundenen Phagen aus dem Zwischenkanal mit Salzsäure-Glycin-Puffer. pH 2,2 neutralisiert mit einem Monat la Triss.

Um den Phagen zu amplifizieren, fügen Sie EIT zu ER 2 5 3 7 Bakterien hinzu und kultivieren Sie es 4,5 Stunden lang. Die Überstände vorsichtig in frische Röhrchen überführen und den Phagen durch Zugabe von Polyethylenglykol dreimal ausfällen. Natriumchloridlösung, inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in TBS mit 0,02% Natriumazid. Plaque den Phagen auf Platten, um die plaquebildenden Einheiten der amplifizierten EIT zu bestimmen. Wiederholen Sie das In-vivo-Bio-Panning-Verfahren sowohl für den eluierten als auch für den nicht eluierten Phagen viermal.

Amplifizieren Sie gepoolte Phagen in Bakterienkulturen. Reinigen und quantifizieren Sie die DNA-Sequenz, die endgültige Phagen-DNA, mit einem 98-Primer, der mit dem Phagen-Display-Kit geliefert wird. Wichtig ist, dass die Häufigkeit der Darstellung der Phagen-DNA-Sequenz berechnet wird.

Synthetisieren Sie nun Peptide, die ein Glycin, Glycin, Glycin, Glycin, Lysin, Sequenz enthalten, säen und amplifizieren D-on-Zellen. Eine geklonte Maus-Multipotential-Knochenmark-Stromazelllinie, die in unserem Labor bei 90%-Konfluenz entwickelt wurde. Trypsin ist die Zelle und die Zentrifuge zum Pelletieren und Zählen für Peptidfärbeplattenzellen auf gelatinebeschichteten Kammern, Well-Objektträgern und Kulturzellen für 24 Stunden.

Waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie sie 30 Minuten lang mit 4%Paraldehyd. Führen Sie nun Blockinkubationen mit Glycin durch, gefolgt von BSA, Aden und BBSA. Biotin-Blockierungslösungen.

100 Mikromolar biotinylierter L-, Sieben- und R-Eins-Peptide zugeben. Waschen Sie die Zellen dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS. Fügen Sie eine Verdünnung von 1 bis 1000 LOR-Strippin-Abdeckung und -Folie hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang in einer dunklen Schublade.

Waschen Sie die Zellen und montieren Sie die Deckgläser mit vector shield Eindeckmedien. Analysieren Sie nun die Objektträger 24 Stunden vor der Operation unter einem Fluoreszenzmikroskop. Tränken Sie die Gelschaumzylinder.

Die Gelschaumzylinder mit 20 mikromolaren Peptiden, entweder L sieben oder R eins oder PBS-Puffer ohne Peptid auf steril 12 übertragen. Schalen gut anpflanzen und über Nacht bei vier Grad Celsius zum Zeitpunkt der Operation kühl stellen. Legen Sie das Gel-Handy-Komposit bis zur Verwendung auf Eis.

Erzeugen Sie mit einem pneumatischen Fräser unter Salzlösung einen großen länglichen unikortikalen Defekt von drei Millimetern Breite und acht Millimetern Länge. Behandeln Sie den Knochendefekt mit vorbereiteten Gelschäumen, indem Sie alle implantierten Gerüste durch sanftes Klopfen einsetzen. Euthanasieren Sie die Ratten und sammeln Sie Tibia zu definierten Zeitpunkten, prüfen Sie sorgfältig auf den Knochendefekt und fixieren Sie die entnommene Tibia in 10% neutralem gepuffertem Formalin für die Paraffinschnitte.

Zum Schluss färben Sie alle Gewebeabschnitte mit Hämatin-Eosin, um die Osteo-Matrix zu markieren. Das mit Aden markierte Fluorescein-Isothiocyanat ermöglicht den mikroskopischen Nachweis der Bindung von Peptiden an in vitro gezüchtete Zellen. Hier binden die Peptide in Kultur an mesenchymale Zellen, um die osteogene Wirkung von Peptiden auf Zellen zu bestimmen.

In vitro können mesenchymale Zellen in Kultur mit Testpeptiden behandelt werden, um Veränderungen in der Zellmorphologie zu bestimmen. Am vierten Tag beginnen sich die Zellen beispielsweise zu vermehren und die Aggregate vergrößern sich mit der Zeit, um Knötchen zu bilden. Interessanterweise wurde der Knochenschnitt mit h- und e-Autofluoreszenz unter UV-Licht gefärbt.

Dieser größere Kontrast zwischen Knochen- und Nicht-Knochengewebe erleichtert die Analyse, das Vorhandensein von Knochen in den Schnitten zu quantifizieren, um die Knochenreparatur bei den mit Gelfoam plus Peptid behandelten Defekten zu bestimmen. Im Vergleich zu Gelfoam allein zeigten Defekte, die mit Plus-Peptid gefüllt waren, mit der Zeit die größte Menge an kortikaler Reparatur Beim Versuch dieses Verfahrens. Es ist wichtig, bei der Dateneingabe äußerst methodisch vorzugehen, da sich im Laufe der Zeit eine große Anzahl von Proben ansammelt, bis Sie die endgültige Gruppe von Peptiden ausgewählt haben.

Die Entwicklung des In-vivo-Biop-Panning als Technik zur Identifizierung von Peptiden, die auf Knochen abzielen, bedeutet, dass wir jetzt über potenzielle Medikamente verfügen, die als Therapie für die Knochenreparatur und für den Knochenabbau eingesetzt werden könnten. Einer der Mechanismen, der der Knochenreparatur zugrunde liegt, ist auch am Knochenschwund beteiligt. Ein genaueres Verständnis dieser Mechanismen und Instrumente zur Behandlung von Erkrankungen wie verzögerten Frakturen und Osteoporose werden dazu beitragen, die Therapien zu verbessern, die für das Gesundheitswesen entwickelt werden können.