Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine genetische Kreuzung des Nagetier-Malariaerregers Plasmodium yoelii durchzuführen, um rekombinante Nachkommen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Gruppe von Mäusen mit einem gemischten Inokulum, das die beiden elterlichen Parasitenklone enthält, injiziert wird. Die infizierten Mäuse dienen anschließend als Blutmahlzeit für Mücken, in denen die Gameten der jeweiligen elterlichen Stämme zu einem diploiden Zygote verschmelzen. Meiotische Teilungen in diesem Stadium können zu genetischer Rekombination führen und somit rekombinante Nachkommen hervorbringen.

Die resultierenden Sporozoiten werden anschließend aus den Speicheldrüsen der Mücken gewonnen und erneut in naiven Empfängermäusen injiziert, um Blutstadium-Parasiten zu erhalten, unter denen sich einzelne rekombinante Klone befinden, die durch limitierende Verdünnung isoliert werden können. Bei einem erfolgreichen Experiment werden fünf bis 10 % der geklonten Linien Rekombinanten sein, die durch Genotypisierung für geeignete genetische Marker charakterisiert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Malariaforschung zu beantworten, beispielsweise welche genetischen Determinanten für Arzneimittelresistenz und Übertragbarkeit bei Malaria verantwortlich sind.

Parasiten bei Raumtemperatur für zwei Vials mit gefrorenen Blutstadien, Malariaerregern, die gekreuzt werden sollen. In diesem Beispiel handelt es sich bei den beiden verwendeten Stämmen von Nagetier-Malariaerregern um Plasmodium yoelii und Plasmodium yoelii Nigerian. Befestigen Sie an einer Spritze eine Nadel mit einer Stärke von 22 bis 30 Gauge und ziehen Sie mit derselben Spritze 400 Mikroliter PBS mit pH 7,4 auf.

Ziehen Sie 100 Mikroliter des mit Thor infizierten Blutes auf, und drehen Sie die Spritze mehrmals um, bis der Inhalt homogen gemischt ist. Während dieser Demonstration werden anästhetisierte Tiere verwendet, um Schmerzen und Stress zu minimieren. Die Anästhesie erfolgt durch Injektion von 50 Mikrolitern eines anästhetischen Wirkstoffcocktails, der 82,5 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 7,5 Milligramm pro Kilogramm Xylazin enthält, in das Peritoneum einer Maus.

Überwachen Sie die Mäuse auf die Tiefe der Anästhesie und verhindern Sie so die Mortalität. Mit diesem Verfahren verbleiben die Mäuse 20 bis 30 Minuten in Narkose. Vor der Erholungsphase injizieren Sie 200 Mikroliter einer Parasiten enthaltenden Lösung direkt in das Peritoneum einer Maus.

Wenn fertig, entsorgen Sie die Spritze in einem scharfen Abfallbehälter. Mit dieser Methode infizieren Sie zwei Mäuse mit jeweils einem der beiden Parasiten, die drei bis fünf Tage nach den Injektionen gekreuzt werden sollen. Blutstadien-Parasiten entwickeln sich in den infizierten Mäusen.

Schneiden Sie mit einer sterilen Schere die Schwanzspitze der Spendermäuse, die mit den verschiedenen Parasitenstämmen infiziert sind. Sammeln Sie einen Tropfen Schwanzblut der Maus auf einem Objektträger und stellen Sie dünne Ausstriche her. Färben Sie den dünnen Blutausstrich mit Guillem-Färbung.

Guillem-SA-Farbstoff färbt aufgrund der fehlenden Zellkerne bei nicht infizierten Zellen keine nicht infizierten roten Blutkörperchen an. SAI färbt den Parasitenkern in den infizierten roten Blutkörperchen an; die Parasiten in den roten Blutkörperchen erscheinen als Ringformen, Trophozoiten und rupturierende Schizonten. Sobald die parasitäre Anämie in beiden Mäusen ein bis fünf Prozent erreicht hat, können Blutstadien-Parasiten für die Infektion mit gemischten Klonen gewonnen werden.

Schneiden Sie die Schwanzspitze der Spendermäuse, die mit den verschiedenen Parasiten infiziert sind, ab. Übertragen Sie die Stämme mit sterilen Scheren, wie zuvor beschrieben. Sammeln Sie ein Mikroliter Blut aus der Schwanzspitze der Maus mittels einer Glaskapillare in einem Milliliter steriler PBS und verwenden Sie 20 Mikroliter der Blutsuspension, um die Dichte der roten Blutkörperchen mit Cell Ome zu analysieren.

Unter Verwendung der Erythrozytendichte und der Para-Messwerte verdünnen Sie die Blutproben in einer physiologischen Citrat-Salzlösung, um eine Konzentration von infizierten Erythrozyten von einer Million pro 100 Mikroliter zu erhalten. Kombinieren Sie eine Probe infizierten Blutes von den beiden Spendern im Verhältnis 1:1, um ein Inokulum mit gemischten Klonen zu erhalten. Injizieren Sie anschließend 100 Mikroliter der gemischten Probe in das Peritoneum jedes zu infizierenden Mäuses.

Verwenden Sie zwei Mäuse für Einzelklon-Infektionen, um die erfolgreiche Übertragung jedes elterlichen Stammes bestätigen zu können. Die sexuellen Stadien des Parasiten, männliche und weibliche Gametozyten genannt, sollten etwa vier Tage nach der Infektion im Blut der Mäuse erscheinen. Beginnen Sie ab diesem Zeitpunkt täglich mit der Überwachung der Mäuse auf das Auftreten von Gametozyten, indem Sie wie zuvor beschrieben Schwanzblut entnehmen und dünne Blutausstriche vom Schwanz anfertigen.

Männliche und weibliche Zellen sind anhand der Anwesenheit großer Granula oder Pigmente erkennbar. Das Zytoplasma männlicher Gato-Zellen ist rosa, während das Zytoplasma weiblicher TER-Zellen blau ist. Nur reife Gato-Zellen weisen eine große Vakuole auf.

Sobald reife Zellen beider Geschlechter nachgewiesen sind, können die Mäuse zur Fütterung von Mücken verwendet werden. Injizieren Sie 50 Mikroliter einer Anästhetikalösung aus Ketamin und Xylazin in das Peritoneum jedes infizierten Mäuschen. Sobald die Mäuse narkotisiert sind, legen Sie ein Mäuschen mit dem Bauch nach unten auf den Deckel eines Käfigs, der 50 bis 100 weibliche Anis-Verteidigungsenzym-Mücken enthält, die 24 Stunden lang keinen Zuckervorrat erhalten haben, und lassen Sie die Mücken 30 Minuten lang ungestört füttern.

Die Mäuse nach der Fütterungsphase unverzüglich human euthanisieren. Falls die Übertragung erfolgreich war, haben sich neun Tage nach der Fütterung die von den Mücken aufgenommenen Gametozyten zu diploiden Zygoten verschmolzen, die sich zu Oocysten entwickeln und im Mitteldarm der Insekten sichtbar sind. Je mehr Oocysten nachgewiesen werden, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass die rekombinanten Parasiten erzeugt wurden.

Sammlen Sie mit einem Aspirator fünf bis 10 infizierte Mücken aus dem Käfig und überführen Sie die Mücken in einen kleinen Behälter. Betäuben Sie die Mücken mit Kohlendioxidgas und bringen Sie sie in eine auf Eis liegende Glas-Petri-Schale. Die männlichen Mücken, deren Antennen deutlich buschiger sind als die der Weibchen, sind zu verwerfen.

Befüllen Sie zwei Spritzen mit PBS und setzen Sie jeweils eine 26-Gauge-Halbzoll-Nadel auf. Geben Sie etwa 100 Mikroliter PBS aus einer Spritze auf einen Objektträger. Übertragen Sie fünf bis zehn anästhesierte weibliche Mücken auf den PBS-Tropfen und platzieren Sie den Objektträger unter einem Stereomikroskop mithilfe der Nadeln.

Entfernen Sie die Flügel und Beine jedes Moskitos und halten Sie das Insekt dann am Thorax und am hinteren Abdomen fest. Ziehen Sie den Körper auseinander, bis der Mitteldarm, ein sackartiger weißer Körper, freigegeben wird. Lösen Sie den Mitteldarm ab und entsorgen Sie den Rest des Körpers während der Präparation.

Stellen Sie sicher, dass die Mitteldärme mit dem PBS von den Dissektionsnadeln feucht gehalten werden. Legen Sie nach Abschluss der Dissektion einen Deckglaser über die Mitteldärme. Untersuchen Sie die Mitteldärme unter einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung.

OOS sind als dickwandige, kreisförmige Strukturen erkennbar, die auf der äußeren Oberfläche der Mitteldärme liegen. Zählen Sie die Anzahl der OOS in jedem Mitteldarm. 17 Tage nach der Fütterung sollten die aus den Sys freigesetzten Sporozoiten zu den Speicheldrüsen der Mücken, den Sporozoen von Malariaparasiten, gewandert sein.

Eine dünne, spindelförmige Zelle zur Gewinnung von Sporozoiten. Bereiten Sie zunächst ein Sammelröhrchen mit einer sauberen Schere vor. Schneiden Sie den Deckel eines kleinen 500-Mikroliter-Einor-Röhrchens ab.

Erhitzen Sie die Spitze einer sterilen 19-Gauge-Nadel und durchstechen Sie den Boden des Röhrchens. Füllen Sie ein Drittel des Röhrchens mit Glaswolle, um einen Filter zu erzeugen. Setzen Sie das Filterröhrchen in ein größeres 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen ein.

Wenn die Filtervorrichtung bereit ist, sammeln und betäuben Sie die Mücken wie zuvor beschrieben. Befestigen Sie die Insekten wie bisher zur Dissektion am Objektträger und entfernen Sie die Mücken, Köpfe, Flügel, Beine und Abdomen. Nur der Thorax enthält die infizierten Speicheldrüsen.

Überführen Sie mit feinen Pinzetten den Thorax in einen 1,5-Milliliter-Homogenisator, der 500 Mikroliter PBS enthält. Homogenisieren Sie den Thorax auf Eis, um die Sporozoiten aus den Speicheldrüsen freizusetzen, und überführen Sie die Homogenate mithilfe einer Glaspipette in die Filtrationsvorrichtung. Zentrifugieren Sie das Filtersystem 10 bis 20 Sekunden bei 1000 Umdrehungen pro Minute.

Nachdem die Homogenate zentrifugiert wurden, sammeln Sie den Durchlauf mit einer Spritze, die mit einer Nadel der Größe 22 bis 30 Gauge ausgestattet ist. Injizieren Sie 100 bis 500 Mikroliter der Sporozoitensuspension in das Peritoneum einer Maus. Beginnen Sie drei Tage nach der Infektion mit der Überwachung der Parasitämie und der Dichte der roten Blutkörperchen bei den Mäusen.

Wählen Sie eine Maus mit einer Parasitämie von 0,1 bis 1 % aus, deren infizierte rote Blutkörperchen hauptsächlich einzelne Parasiten enthalten, als Spender für den Klonierungsprozess. Entnehmen Sie eine geeignete Menge Blut aus dem Schwanz der Maus in PBS, verdünnen Sie das Blut in einer kalten 1:1-Lösung aus Kalbserum und Säugetier-Ringer-Lösung, um eine Konzentration von 0,6 bis einem infizierten roten Blutkörperchen pro 100 Mikroliter zu erreichen, und lagern Sie das Inokulum auf Eis. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle am Schwanz mit Ethanol und injizieren Sie intravenös.

Injizieren Sie 100 Mikroliter verdünntes infiziertes Blut in jeweils bis zu 100 Mäuse. Auf diese Weise sollte jede einzelne Maus entweder einen oder keinen Parasiten erhalten. Bei einem erfolgreichen Experiment weisen 20 bis 50 % der Mäuse am achten Tag eine Parasitämie von 0,1 bis 0,5 % auf.

Fünf bis sieben Tage später die Mäuse mittels Untersuchung von ausgedünnten Blutausstrichen auf das Vorhandensein von Blutstadium-Parasiten screenen. Die Nachkommen-Parasiten aus dem Kreuzungsansatz können anschließend durch PCR von DNA, die aus Schwanzblutproben extrahiert wurde, unter Verwendung genetischer Marker auf verschiedenen Chromosomen wie Mikrosatelliten und Einzelnukleotid-Polymorphismen genotypisiert werden. Parasiten, deren unabhängige genetische Loci von den beiden elterlichen Klonen stammen, sind rekombinante Klone.

Das Blut von Tieren, die mit rekombinanten Parasiten infiziert sind, kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Bei einem erfolgreichen Experiment weisen fünf bis 10 % der gesamten Mäuse unabhängige rekombinante Nachkommen auf. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genetische Vorgänge bei Malaria erzeugt.

Parasit zusammen mit Medium yoi. Diese Methode kann ebenso auf andere Parasitenarten angewendet werden.