Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

Hallo, mein Name ist Alan und ich arbeite im Labor von Dr. Horney Lu am Department für Neurobiologie und Verhalten der University of California Irvine. Und ich bin Bob. Heute wird Ihnen Dr. Haro eine schnelle, effiziente und zuverlässige Anleitung zur routinemäßigen kryogenen Konservierung von kortikalen Gewebestücken für die anschließende Herstellung hochwertiger primärer neuronaler Kulturen demonstrieren.

Beginnen wir also. Das gereinigte und zerkleinerte Gewebe wird in Kryoröhrchen mit einem 10 %igen TMSO-Frischhaltemedium gegeben.

Cryoröhrchen werden in einen Gefriergutbehälter geladen und mindestens vier Stunden bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt. Anschließend werden die gefrorenen Cryoröhrchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt. Zum Kultivieren wird das AC-Cryoröhrchen in einem warmen Wasserbad aufgetaut und mit warmem HBSS gespült, um verbleibendes DMSO zu entfernen.

Frisches HBSS wird zusammen mit Trypan zur Dissoziation hinzugefügt, woraufhin DMM mit 10 % EBS zugegeben wird. Um die dissoziierende enzymatische Aktivität zu stoppen, werden die Zellen centrifugiert und das Pellet in frischem DMM plus 10 % EBS resuspendiert und auf vorbeschichteten Polylysin-Schalen ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde das DMM durch ein supplementiertes Neurobasal-Medium ersetzt, und die Zellen wurden 10 Tage lang kultiviert.

Dieses Protokoll verwendet eine Stahlrasierklinge zum Zerkleinern von kortikalem Gewebe vor der Verwendung. Die Klinge muss mindestens zwei Stunden lang in 70 %igem Ethanol sterilisiert werden. Eine x Hank’sche gepufferte Salzlösung (HBSS) wird durch Verdünnung einer 10 x Stammlösung in sterilisiertem Wasser hergestellt; die 1 x HBSS wird anschließend entweder auf Eis oder bei vier Grad Celsius bis zur Gewebeverarbeitung aufbewahrt.

Dimethylsulfoxid oder DMSO wird als Kryoschutzmittel im Einfriermedium verwendet. Dieses Protokoll verwendet eine 10 %ige (Volumen/Volumen) Verdünnung von DMSO in einem X-H-B-S-S-D-M-S-O, das vor der Lagerung bei vier Grad Celsius vollständig gemischt werden sollte. Ein Nalgene- und Einfrierbehälter wird verwendet, um die Einfriergeschwindigkeit der Proben zu kontrollieren.

Der Gefriertopf wird mit 2,5-Milliliter-Kryoröhrchen beladen, die zuvor beschriftet wurden. Es ist außerdem ratsam, die Gefriertöpfe selbst zu beschriften, falls mehrere vorhanden sind, und den entsprechenden Behälter auf der Galle zu notieren. Das zuvor gekühlte 10 % DMSO-Gefriermittel sowie der Gefriertopf werden in einen sterilen biologischen Sicherheitswerkbank gebracht.

Hier wird ein Milliliter Gefriermittel langsam zu jedem der Kryoröhrchen hinzugefügt. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Verschlüsse fest sitzen, wird der Gefriergefäßbehälter mit den Röhrchen vor der Gewebeverarbeitung mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius aufbewahrt. Die zuvor sterilisierte Rasierklinge muss gründlich gespült werden. Drei Spülgänge zu je drei Minuten.

Die Verwendung von sterilisiertem Wasser sollte ausreichen, um verbleibenden Ethanol zu entfernen. Dieser Waschvorgang sollte schnell durchgeführt werden, da das Rasiermesser durch längeres Eintauchen in sterilem Wasser anfällig für Oxidation ist. Vor der Reinigung sollte das Gewebe auf einen Kühlpack gelegt werden.

Spülen Sie leicht mit kaltem 1× H-BSS, um lose Partikel zu entfernen. Sterile Nadeln werden verwendet, um die Gewebestücke von verbliebenen Membranen und Blutgefäßen zu reinigen. Dabei ist darauf zu achten, die strukturelle Integrität des Gewebes während der Reinigung zu bewahren.

Da sich dies erhöhen wird, unterscheidet sich die Effizienz des Zerkleinsens von gereinigtem Gewebe sichtbar von der von rohem Gewebe und sollte die meisten Membranen oder Blutgefäße entfernt haben. Sobald ein Gewebe gereinigt und gespült wurde, kann das Zerkleinern beginnen. Es ist wichtig, saubere Schnitte im Gewebe vorzunehmen, um Blöcke von etwa einem Kubikmillimeter Größe zu erzeugen.

Blöcke, die zu groß sind, führen bei der Auftauphase zu einer geringeren Zellausbeute. Bei kleineren Blöcken sollte jedoch eine Überbearbeitung ebenfalls vermieden werden. Das zerkleinerte Gewebe kann mithilfe einer Pipette und etwas gekühltem 1×-HBSS gesammelt werden.

Spülen Sie die Schale mit HBSS, um das gesamte gesammelte Gewebe zu gewinnen. Das Gewebe wird dann zu einem großen Volumen an 1×-H-B-S-S gegeben und darf sich am Boden absetzen, wodurch ein locker gepacktes Pellet entsteht. Dadurch werden alle verbleibenden Rückstände entfernt, während sich das Gewebe im HBSS absetzt. Entnehmen Sie vor der Gewebeaufteilung den zuvor gekühlten Einfrierbehälter und die Kryoröhrchen.

Entfernen Sie die Verschlüsse aller Vials, um den Vorgang der Gewebefüllung zu beschleunigen. Die Exposition gegenüber DMSO bei Raumtemperatur sollte auf nicht mehr als 10 Minuten begrenzt werden. Es ist ratsam, jeweils nur einen Gefriermittelbehälter zu verwenden, bis das gesamte Gewebe verarbeitet ist.

Beginnen Sie damit, den Überstand eines lockeren Gewebes abzusaugen, und pipettieren Sie so nahe wie möglich am Pellet, ohne dieses zu stören. Befestigen Sie dann eine Pipettenspitze mit einem 200-Mikroliter-Öffnungsdurchmesser an einer Pipette. Verwenden Sie keine Spitze mit kleinerer Öffnung, da dies die Struktur der Gewebeproben beeinträchtigen könnte, die sich am Boden des Gewebepellets befinden.

Sammeln Sie 200 Mikroliter Gewebe langsam. Geben Sie dieses Gewebe in ein Kryoröhrchen und fahren Sie mit dem nächsten fort, bis alle Röhrchen gefüllt sind. Möglicherweise ist eine 10-Minuten-Regel erforderlich.

Stellen Sie den Gefriertopf schnellstmöglich in eine Gefrierschublade bei minus 80 Grad Celsius für mindestens vier Stunden oder über Nacht, falls die Zeit begrenzt ist. Nach ausreichender Zeit nehmen Sie den Gefriertopf aus dem Gefrierschrank und verteilen die Kryoröhrchen so schnell wie möglich auf eine Kryobox. Stellen Sie die Kryobox in ein Rack innerhalb eines flüssigen Stickstoffspeichers für die Langzeitlagerung.

Entnehmen Sie eine Kryoröhre so schnell wie möglich aus flüssigem Stickstoff und begrenzen Sie die Exposition der Kryoboxen gegenüber Raumtemperatur, indem Sie die Probe unter ständigem Halten des Verschlusses über der Wasseroberfläche in ein Wasserbad von 37 Grad Celsius eintauchen. Überprüfen Sie den Vorgang häufig und lassen Sie das Auftauen so lange andauern, bis ein kleines Eispartikel sichtbar ist.

Bevor Sie die Kryoröhre in den Sicherheitswerkbank bringen, sterilisieren Sie sie mit 70 % Ethanol. Fahren Sie fort, indem Sie das aufgetaute Gewebe einem großen Volumen an warmem 1×-HBSS hinzufügen, falls Gewebe an den Wänden der Kryoröhre verbleibt. Sammeln Sie es vorsichtig mit HBSS ein.

Nachdem das gesamte Gewebe gesammelt wurde, das Gefäß drei- bis viermal umdrehen und das Gewebe am Boden absetzen lassen. Dieser Schritt gewährleistet eine ausreichende Verdünnung von DMSO.

Wenn das Gewebe abgesetzt ist, aspirations so viel wie möglich der Überstand. Anschließend 10 Milliliter warme, frische 1 X-H-B-S-S hinzufügen. Dann 300 Mikroliter 0,25 %iger Trypsin und 50 Mikroliter DNasen hinzufügen.

Fahren Sie mit der Dissoziation des Gewebes unter leichtem Schütteln fort, wodurch nach der Gewebeauflösung eine trübe Zellsuspension entsteht. Beenden Sie die enzymatische Aktivität durch Zugabe von warmem DMEM plus 10 % angereichertem bovinem Serum. Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 1200 ×g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem DMEM plus 10 % EBS und geben Sie es auf mit Polylysin beschichtete Platten.

Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang an die Schalen anheften. Ersetzen Sie dann das Medium durch frisches DM plus 10 % EBS. Nach 24 Stunden wechseln Sie das DM-haltige Medium durch Neurobasal-Medium, das mit N2 und B27 ergänzt wurde, und kultivieren Sie die Zellen für 10 Tage.

Wir haben soeben ein umfangreiches, effizientes und zuverlässiges Protokoll mit einer routinemäßigen Kryokonservierung von kortikalen Gewebeproben beschrieben. Also viel Glück.