Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

Hallo, mein Name ist Alan und ich bin ein Labor von Dr. Horney Lu an der University of California Irvine in der Abteilung für Neurobiologie und Verhalten. Und ich bin Bob. Heute zeigt Ihnen Dr. Haro ein schnelles, effizientes und zuverlässiges Protokoll für die routinemäßige Kryokonservierung von kortikalen Gewebeblöcken für die anschließende Degeneration hochwertiger primärer neuronaler Kulturen.

Also lasst uns loslegen. Gereinigtes und zerkleinertes Gewebe wird in Kryo-Fläschchen mit einem TMSO-Gehalt von 10 % geladen. Gefriermedium.

Kryo-Fläschchen werden in einen Gefrierbehälter geladen und für mindestens vier Stunden bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Gefrorene Kryo-Fläschchen werden dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff gelegt. Für die Kultivierung von AC wird das Kryo-Fläschchen in einem warmen Wasserbad geschmolzen und mit warmem HBSS gespült, um das restliche DMSO zu entfernen.

Frisches HBSS wird zusammen mit tryin d ns zur Dissoziation hinzugefügt, wonach DMM mit 10% EBS hinzugefügt wird. Um die dissoziative enzymatische Aktivität zu stoppen, werden die Zellen heruntergeschleudert und das Pellet in frischem DMM plus 10 % EBS resuspendiert und auf vorbeschichtete Polylysinschalen aufgebracht. Nach 24 Stunden hat sich DMM in ein supplementiertes neuronales Basalmedium umgewandelt und ist 10 Tage lang gewachsen.

Bei diesem Protokoll wird eine Rasierklinge aus Stahl verwendet, um kortikales Gewebe vor der Anwendung zu hacken. Der Rasierer muss mindestens zwei Stunden lang in 70%igem Ethanol sterilisiert werden. Eine x Hank's gepufferte Salzlösung HBSS wird hergestellt, indem eine 10 x Stammlösung in sterilisiertem Wasser verdünnt wird, die eine X-H-B-S-S wird dann entweder auf Eis oder bei vier Grad Celsius bis zur Gewebeverarbeitung aufbewahrt.

Dimethylsulfoxid oder DMSO wird als Kryoschutz in den Gefriermedien verwendet. Dieses Protokoll verwendet ein Volumen von 10 % und eine Volumenverdünnung von DMSO in einem X-H-B-S-S-D-M-S-O sollte vollständig gemischt werden, bevor es bei vier Grad Celsius gelagert wird. Nalgene und Gefrierbehälter werden verwendet, um die Gefrierrate für die Proben zu kontrollieren.

Der Gefrierbehälter ist mit 2,5 Milliliter Kryo-Fläschchen beladen, die zuvor etikettiert wurden. Es ist auch eine gute Idee, die Gefrierbehälter selbst zu beschriften, wenn du mehr als einen hast und den entsprechenden Behälter auf der Galle zu notieren. Das zuvor gekühlte 10%DMSO, Gefriermedium, sowie der Gefrierbehälter werden in eine sterile biologische Sicherheitswerkbank gebracht.

Hier wird langsam ein Milliliter Gefriermedium in jedes der Kryo-Fläschchen gegeben. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Verschlüsse fest sitzen, stellen Sie den Gefrierbehälter mit den Fläschchen kurz vor der Gewebeverarbeitung mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius auf. Die zuvor sterilisierte Rasierklinge muss gründlich gespült werden. Drei, drei Minuten Wäschen.

Die Verwendung von sterilisiertem Wasser sollte ausreichen, um das restliche Ethanol zu entfernen. Dieser Waschvorgang sollte schnell sein, da der Rasierer anfällig für Oxidation durch längeres Untertauchen und steriles Wasser ist. Vor der Reinigung sollte das Taschentuch auf einen Eisbeutel gelegt werden.

Spülen Sie es leicht mit kaltem X-H-B-S-S ab, um frei schwimmende Rückstände zu entfernen. Sterilisierte Nadeln werden verwendet, um die Gewebestücke von verbleibenden Membranen und Blutgefäßen zu reinigen. Es muss darauf geachtet werden, dass die strukturelle Integrität des Gewebes während der Reinigung erhalten bleibt.

Wenn dies zunimmt, unterscheidet sich die Effizienz des Zerkleinerns von sauberem Gewebe sichtbar von der von rohem Gewebe und es sollten die meisten Membranen oder Blutgefäße entfernt werden. Sobald ein Taschentuch gereinigt und gespült wurde, kann mit dem Zerkleinern begonnen werden. Es ist wichtig, saubere Schnitte vom Gewebe zu machen, wodurch Blöcke von etwa einem Millimeter Größe entstehen.

Zu große Blöcke gleichen eine geringere Zellausbeute beim Auftauen aus. Bei den kleineren Blöcken sollte jedoch auch eine Überbearbeitung vermieden werden. Gehacktes Gewebe kann mit einer Autopipette und etwas kühler X-H-B-S-S entnommen werden.

Stellen Sie sicher, dass Sie das Gericht mit HBSS ausspülen, um das gesamte angesammelte Gewebe wiederherzustellen. Dann wird das Gewebe zu einem großen Volumen eines X-H-B-S-S hinzugefügt und auf den Boden fallen gelassen, wodurch ein locker gepacktes Pellet entsteht. Dadurch werden alle verbleibenden Rückstände entfernt, die möglicherweise vorhanden sind, wenn sich das Gewebe im HBSS absetzt, und es werden der zuvor gekühlte Gefrierbehälter und die Kryofläschchen entnommen, bevor das Gewebe zugewiesen wird.

Stellen Sie sicher, dass Sie alle Fläschchen öffnen, um das Befüllen des Gewebes zu beschleunigen. Die Exposition gegenüber DMSO bei Raumtemperatur sollte auf nicht mehr als 10 Minuten begrenzt werden. Es ist eine gute Idee, mit jeweils einem Gefrierbehälter zu arbeiten, bis das gesamte Gewebe verwendet ist.

Beginnen Sie, das Überkorn eines losen Gewebes abzusaugen, und pelletieren Sie das Getreide so nah wie möglich an das Pellet, ohne es zu stören. Setzen Sie dann eine 200 Mikroliter breite Blendenspitze auf eine Pipette ein. Verwenden Sie keine kleinere Spitzenöffnung, da dies die Struktur der Blöcke beeinträchtigt, die zum Boden des Gewebeblock-Pellets gelangen.

Langsam 200 Mikroliter Gewebe sammeln. Geben Sie dieses Gewebe in ein Kryo-Fläschchen und fahren Sie mit dem nächsten fort, bis alle Fläschchen gefüllt sind. Möglicherweise ist eine 10-Minuten-Regel erforderlich.

Stellen Sie den Gefrierbehälter schnell für mindestens vier Stunden oder über Nacht in Kryo-Fläschchen in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius oder über Nacht, wenn die Zeit begrenzt ist. Nehmen Sie nach ausreichender Zeit den Gefrierbehälter aus dem Gefrierschrank und ordnen Sie die Kryofläschchen so schnell wie möglich einer Kryobox zu. Stellen Sie die Kryobox zur Langzeitlagerung in ein Gestell für die Flüssigstickstoffbox.

Entfernen Sie so schnell wie möglich einen Kryo-Schlamm aus flüssigem Stickstoff und begrenzen Sie die Kryoboxen. Bei Raumtemperatur schmilzt die Probe schnell, indem sie in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad getaucht wird. Halten Sie die Kappe immer über Wasser. Überprüfen Sie regelmäßig und tauen Sie so lange auf, bis ein kleines Eis P beobachtet wird.

Bevor Sie es in den Sicherheitsschrank bringen, sterilisieren Sie das Kryoglas mit 70%Ethanol. Fahren Sie fort, das aufgetaute Gewebe zu einem großen Volumen warmem X-H-B-S-S hinzuzufügen, wenn Gewebe an den Wänden des Kryogewebes verbleibt. Schonend gesammelt mit HBSS.

Einmal war alles Gewebe gesammelt. Drehen Sie den Schlauch drei- bis viermal um und lassen Sie das Gewebe am Boden absetzen. Dieser Schritt gewährleistet eine ausreichende Verdünnung von DMSO.

Sobald sich das Gewebe abgesetzt hat, aspirieren Sie so viel Super Natin wie möglich. Dann füge dazu 10 Milliliter warmes frisches X-H-B-S-S hinzu. Fügen Sie 300 Mikroliter 0,25% Trypsin und 50 Mikroliter DNA hinzu.

Fahren Sie fort, das Gewebe unter leichtem Rühren zu dissoziieren, wodurch eine trübe Zellsuspension entsteht, nachdem das Gewebe dissoziiert wurde. Stoppen Sie die enzymatische Aktivität durch Zugabe von warmem DM und plus 10 % angereicherten EPS-Zentrifusionszellsuspensionen im Rinderserum bei 1200 g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem DMEM plus 10 % EBS und Platte auf Polylysin-beschichtete Platten.

Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang an Schalen anheften. Ersetzen Sie dann das Medium durch frisches DM plus 10 % EBS. Nach 24 Stunden wird das DM-haltige Medium durch das neurobasale Medium ersetzt, das mit N zwei und B 27 ergänzt wird, und es wird 10 Tage lang gezüchtet.

Wir haben gerade ein umfangreiches, effizientes und zuverlässiges Protokoll mit einer routinemäßigen Schreikonservierung von kortikalen Gewebeblöcken detailliert beschrieben. Also viel Glück.