Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kinetik des mRNA-Kernexports in Säugetierzellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst mRNA oder DNA in die Zellkerne von Säugetier-Gewebekulturzellen mikroinjiziert wird. Nach der Mikroinjektion werden die Proben nach verschiedenen Inkubationszeiten fixiert.

Die mRNA wird dann durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung oder Fisch gefärbt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen abzubilden und die Menge an Fluoreszenz im Zytoplasma und im Zellkern zu quantifizieren. Letztendlich kann die Rate des mRNA-Exports durch eine Kombination aus Mikroinjektion und Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden.

Hallo, ich bin SRG AV aus dem Labor von Alex Palazzo am Department of Biochemistry an der University of Toronto. Ich bin Stefan Toski, ebenfalls vom Palazzo Lab. Ich bin Amy aus dem Palazzo-Labor und ich bin Khi Maha David aus dem Palazzo-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Einbringen von mRNA in die Zellkerne von Säugetiergewebekulturzellen durch Mikroinjektion. Wir werden auch zeigen, wie die mRNA durch Fluoreszenz in der C-2-Hybridisierung gefärbt werden kann. Wir verwenden diese Verfahren in unserem Labor, um die Kinetik des mRNA-Kernexports in Säugetierzellen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Vor der Mikroinjektion wurde die zuvor vorbereitete Plasma-DNA auf 50 bis 200 Mikrogramm pro Milliliter in Injektionspuffer vorbereitet. Als nächstes bei Oregon Green 4 88 oder OG konjugiert zu 70 Kilodalton Dextran an das Gemisch, um die Identifizierung der injizierten Zellen zu ermöglichen.

Das OG-konjugierte Dextran hilft bei der Bestimmung, wie viel der Flüssigkeit in den Zellkern injiziert wurde und wie viel in die Zytoplasma-Zentrifuge austrat. Die Proben werden mindestens 20 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius untersucht, um Partikel zu granulieren, die die Nadelspitze möglicherweise verstopfen könnten. Wählen Sie die Säugetierzelllinie aus, die mikroinjiziert werden soll, basierend auf den Kriterien, die in den Kosten des schriftlichen Protokolls beschrieben sind.

Sieben Zellen werden für dieses Demonstrations-Seed verwendet. Die Zellen auf dem säuregewaschenen Deckmantel werden mindestens 24 Stunden vor der Mikroinjektion in 30-Millimeter-Petrischalen gelegt. Idealerweise sollte die Zellmonoschicht zum Zeitpunkt der Injektion etwa 70 bis 90 % konfluent sein, um eine einfache Identifizierung der injizierten Zellen zu ermöglichen. Die Zellmonoschicht wird vor der Injektion mit einer 200-Mikroliter-Kunststoffpipettenspitze verwundet.

Ätzen Sie eine Kreuzwunde auf dem Deckglas und lassen Sie die Zellen vor der Injektion mindestens 15 Minuten lang im Gewebekultur-Inkubator erholen. Verwenden Sie für die Mikroinjektion ein inverses Mikroskop, das auf einem Lufttisch isoliert ist, um Vibrationen zu minimieren, die den Mikroinjektionsprozess stören können. Entfernen Sie mit einer Einor-Gelladerspitze etwa einen Mikroliter von der Oberseite der Zentrifugenprobe, um eine Beschädigung des Pellets zu vermeiden.

Führen Sie die Spitze der Pipette in die Rückseite einer vorgefertigten Mikroinjektionsnadel ein und stoßen Sie die Flüssigkeit aus. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung in die Nadelspitze gezogen. Ein Meniskus in der Nähe der Spitze sollte innerhalb von fünf bis 30 Sekunden sichtbar sein.

Setzen Sie die flüssigkeitsgefüllte Nadel in den Stab ein und klemmen Sie sie an den Mikromanipulator. Visualisieren Sie die Nadel in einem Winkel von 45 Grad mit dem 10-fach-Objektiv und positionieren Sie sie in der Mitte des Betrachtungsfeldes in der Nähe der Fokusebene. Mit Hilfe der groben Mikromanipulatorknöpfe wird der Stab durch einen Schlauch mit einer Glasspritze verbunden, mit der der Druck erzeugt wird, der zum Ausstoßen der Flüssigkeit aus der Nadelspitze erforderlich ist.

Um einen gleichmäßigen Druck aufrechtzuerhalten, wird die Spritze auf eine Rohrschelle montiert. Heben Sie die Nadel mit zwei Gummistopfen und zwei Metallklammern einige Millimeter an, damit sie in späteren Schritten nicht beschädigt wird, und schieben Sie das Mikroskop dann zurück. Säule, erhöhen Sie den Druck, indem Sie den Spritzenkolben drücken.

0,5 bis zwei Kubikzentimeter. Legen Sie eine Petrischale mit einem Deckglas mit einer verwundeten Monoschicht auf. Ziehen Sie das Mikroskop auf dem Betrachtungstisch zurück.

Säule nach vorne in eine aufrechte Position, wodurch der Kondensator in der Nadel ausgerichtet ist, um in die Flüssigkeit einzudringen. Dies sollte vorsichtig erfolgen, um zu verhindern, dass die Nadel auf dem Deckglas bricht. Identifizieren Sie mit dem 10-fach-Objektiv die Mitte der Kreuzwunde und positionieren Sie die Nadel über den zu injizierenden Zellen.

Erhöhen Sie die Vergrößerung, indem Sie auf das 40-fache Objektiv umschalten. Senken und zentrieren Sie dann die Nadel mit den Feineinstellknöpfen im Joystick. Beginnen Sie die Injektion an einer Ecke des Wundkreuzes, indem Sie die Nadel absenken, um Kontakt mit dem Kern aufzunehmen.

Nach der Injektion ändert sich die Phasenhelligkeit einer Zelle deutlich. Fahre an einer Kante des Wundkreuzes weiter. Für eine einfache Identifizierung der injizierten Zellen während der Visualisierung ist es entscheidend, dass der Injektionsdruck für jede Nadel richtig eingestellt wird.

Der Druck muss hoch genug sein, um das Plasma und die Kernmembranen zu durchdringen, aber nicht so hoch, dass die Zellen abgetötet werden. Mikroinjizieren Sie Zellen entlang des Wundrandes für einen festgelegten Zeitraum. Mit etwas Übung können in diesem Intervall mehrere hundert Zellen injiziert werden.

Wenn Plasma-DNA injiziert wird, inkubieren Sie die mikroinjizierten Zellen vor der Fixierung 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator und beenden Sie dann die Transkription. Durch die Behandlung der Zellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter Alpha, einem in Wachstumsmedien gelösten Mantin. Diese Konzentration hemmt effektiv die Transkription von mikroinjizierten Plasmiden.

Legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator und lassen Sie die Zellen die neu synthetisierte mRNA exportieren. Eine einzige Nadel kann wiederverwendet werden, um mehrere Deckgläser zu injizieren. Die Nadel muss jedoch ausgetauscht werden, wenn sich die Art der DNA oder RNA, die mikroinjiziert wird, geändert hat.

Darüber hinaus sollte die Nadel, sobald sie aus dem Stab entfernt wurde, entsorgt werden, um eine genaue Messung der mRNA-Kernexportkinetik zu erhalten. Getrennte Proben sollten auf null Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten festgelegt werden. Nach der Alpha-Manin-Behandlung zum richtigen Zeitpunkt, aspirieren Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal in zwei Millilitern PBS-Lösung.

Es ist wichtig, die Deckgläser feucht zu halten, indem Sie die Zeit, in der sie nicht in Flüssigkeit getaucht sind, minimieren. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter 4%Aldehyd in PBS hinzufügen und die Zellen mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie die fixierten Proben zwei weitere Male gewaschen haben, durchlässig für die Zellen mit zwei Millilitern 0,1 %Triton X 100 in PBS, inkubieren Sie die Zellen erneut mindestens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Proben schließlich zwei weitere Male, um die Proben für die Hybridisierung vorzubereiten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Waschpuffer aus einer XSSC-Lösung, die 25 bis 60 % einer Mitte enthält. Bereiten Sie dann die Färbekammer für die Hybridisierung vor, indem Sie den Boden einer 150-Millimeter-Petrischale mit Wasser bedecken und ein Stück Paraform darauf schwimmen lassen.

Entfernen Sie das Wasser, indem Sie die Schale umdrehen, damit das Paraform am Boden der Schale haften bleibt. Entfernen Sie manuell alle Luftblasen für jedes Deckglas, das fleckig werden soll. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Hybridisierungslösung auf das Paraform.

Beachten Sie, dass die Menge der Form mit Hilfe einer Pinzette für den jeweiligen Fischprofi optimiert werden sollte, der verwendet wird. Entfernen Sie ein Deckglas mit den fixierten Zellen aus der 30-Millimeter-Petrischale. Trocknen Sie die Rückseite des Deckglases mit Watman-Filterpapier und saugen Sie überschüssigen Puffer von der Vorderseite auf, ohne die Zellen zu trocknen.

Legen Sie dann den Deckglas mit der bedruckten Seite nach unten auf die Fischlösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Deckglas. Nachdem Sie den Deckel der Färbekammern wieder aufgesetzt haben, inkubieren Sie die Proben fünf bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie mehrere Waschkammern auf die gleiche Weise vor, wie die Färbekammer für jeden Deckglas vorbereitet wurde: Pipette einen Milliliter Waschpuffer auf die Paraform der Waschkammer. Entfernen Sie nach der Inkubation die Deckgläser aus der Färbekammer, indem Sie einen Milliliter Waschpuffer pipettieren. Neben dem Deckglas sollte die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung unter jede Probe gezogen werden.

Entfernen Sie dann die Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie sie fünf Minuten lang auf einen Tropfen Waschpuffer bei inkubiertem Raum. Waschen Sie jeden Deckglas noch zweimal, also insgesamt drei Wäschen pro Deckglas, pipettieren Sie 10 bis 30 Mikroliter Eindecklösung mit Tupfer auf einen zuvor gewaschenen Objektträger. Jede Folie kann zwei Deckgläser mit einer Pinzette und Watman-Filterpapier aufnehmen.

Trocknen Sie die Rückseite der Deckgläser und leiten Sie überschüssige Flüssigkeit von der Vorderseite des Deckglases ab, ohne die Proben zu trocknen. Legen Sie jeden Abdeckzettel mit der bedruckten Seite nach unten auf einen Tropfen Montagelösung. Montierte Proben können bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Hier wurden bei der Wirkung von Alpha-Mantin auf die Transkription von injizierter Plasma-DNA drei T-3-Fibroblastenzellen des NIH gezeigt, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Alpha-Mantin vorbehandelt wurden. Es wurden TFL s delta i, Plasmid-DNA und OG konjugiert 70 Kilo und Dextran injiziert. Jede Zeile entspricht einem einzigen Sichtfeld, das für OG 70 Kilodalton Dextran und T uts delta I mRNA abgebildet wurde.

Es ist offensichtlich, dass hohe Konzentrationen des Arzneimittels die Produktion des T-UTS-Delta-I-Transkripts vollständig hemmten, während dies bei niedrigeren Konzentrationen nicht beobachtet wurde. Gezeigt. Hier ist ein Zeitverlauf der Exportkosten für mRNA-Kerne. Sieben Zellen wurden mit T, UTS, Delta-I-Plasma-DNA und OG-konjugiertem 70-Kilodalton-Dextran injiziert.

30 Minuten nach der Injektion wurden die Zellen mit Alpha-Mantin behandelt und bei 37 Grad Celsius für null Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann fixiert und mit einer Sonde gegen T UTS delta I mRNA gefärbt. Und mit Antikörpern gegen die ER-Markerfalle alpha entspricht jede Reihe einem einzelnen Zellfeld.

Informationen zur Quantifizierung des mRNA-Exports finden Sie im Online-Text hier. Der 120-Minuten-Zeitpunkt wurde vergrößert Um die Kolokalisation von TFS delta I mRNA im er zu demonstrieren, ist ein Overlay der T UTS delta I mRNA in grün und der Trap alpha in rot dargestellt. Informationen zur Gleitfärbung von mRNA mit Proteinen finden Sie im Online-Text.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die nukleare Exportkinetik von mRNA durch Mikroinjektion messen können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine erfolgreiche Mikroinjektion eine angemessene Vorbereitung erfordert. Wichtige Schritte wie DNA und RNA, Probenvorbereitung, Ziehen von Nadeln, Ausrichten optischer Geräte und Fehlerbehebung bei der Mikroinjektion sind in unserem schriftlichen Protokoll beschrieben.

Bei der Bildgebung und Analyse von mikroinjizierter mRNA ist es wichtig, dass die Quantifizierung auf Zellen beschränkt ist, die mehr als 90 % der injizierten Flüssigkeit in den Zellkern erhalten haben. Eine erfolgreiche Kerninjektion kann durch Visualisierung der Verteilung des grünen Dextrans im Organ im Zellkern und im Zytoplasma beurteilt werden. Weitere Informationen zum Design von Fischsonden und zur Verwendung von Bildanalysesoftware zur Analyse der Verteilung von mRNA im Zytoplasma im Zellkern finden Sie in unserem Online-Protokoll.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.