Name: Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mRNA-Nuklearexportkinetiken in Säugerzellen durch Mikroinjektion und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung quantitativ messen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen der posttranskriptionellen Regulation.

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Wir möchten E. Gomes für nützliche Ratschläge und A. Wilde danken für die Erlaubnis, verschiedene Geräte zu verwenden. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss zu AFP vom Canadian Institute for Health Research (FRN 102725) unterstützt.

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
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Mikroinjektion ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem eine Reihe von verschiedenen zellulären Prozessen untersucht werden können. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zelltransfektion erlaubt Mikroinjektion der Wissenschaftler effektiv einzuführen Nukleinsäuren in die Zellkerne in einem sehr engen Zeitrahmen. Als Ergebnis kann man kinetische Analysen wie die Bestimmung der Preise von mRNA export, mRNA-Lokalisierung, und die Proteinsynthese führen. Darüber hinaus, da der Zeitrahmen des Experiments relativ kurz ist, kann man Zellen toxische Verbindungen innerhalb kurzer Zeitspannen ohne dass pleiotrope Effekte aufzudecken. Darüber hinaus können hemmende oder stimulierende Verbindungen wie dominant negative Proteine, mit der Nukleinsäuren co-injiziert werden. Schließlich vermeiden microinjections die Forderung nach der Transfektion Reagenzien, die oft toxisch für Zellen und können unterschiedliche zelluläre Funktionen stören. mRNA vs Plasmid-DNA-Injektionen Die Wahl der Nukleinsäure zu spritzen auf eine Reihe von Überlegungen abhängen wird. Nach Plasmid-DNA Injektion, RNA Polymerase II nicht nur synthetisiert mRNA, sondern auch Rekruten Protein Faktoren, die im Entstehen begriffenen Transkript 12,13. Da diese Faktoren Veranstaltungen wie mRNA-Prozessierung, nukleare Export und zytoplasmatische Lokalisation regieren, können Plasmid-DNA-Injektionen verwendet werden, um einzuschätzen, wie Transkription, um nachgelagerte Prozesse gekoppelt werden. Obwohl die Transkription zu Kernexport 14 gekoppelt werden kann, haben wir festgestellt, dass injizierte mRNA etwas schneller als in vivo transkribierten mRNA 6 exportiert. Die Gründe dafür sind im Moment nicht klar, aber dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass die neu synthetisierten mRNA von RNA-Polymerase II entsteht, kann es bis in Komplexen, die verzögern Kernexport gebunden werden. Es gibt einige Vorteile, die mit mRNA Injektionen. Zunächst muss der Forscher nicht zu RNA-Polymerase-Inhibitoren, die beeinflussen könnten, wie Zellen den gesamten Metabolismus von RNA zu regulieren. Zweitens kann die RNA in vitro modifiziert werden, bevor Injektion. Zum Beispiel können mRNAs mit verschiedenen 5&#39;-Cap-Analoga oder Poly (A)-Schwanz Länge synthetisiert werden, um zu beurteilen, wie diese Funktionen nuklearen Export 6 beeinflussen. Drittens kann die genaue Menge an RNA, die injiziert wird grob geschätzt werden. Nach dem Protokoll skizzierten schätzen wir, dass etwa 20.000 bis 50.000 Molekülen in jedem Kerne, die relativ klein ist injiziert werden, wenn die Gesamtzahl der Transkripte in einer typischen Säugerzelle (400.000 bis 850.000 Moleküle) 15 verglichen. Der größte Nachteil mit mRNA-Injektionen besteht darin, dass während der Mikroinjektion, eine Leckage von Injektionsflüssigkeit in das Zytoplasma unvermeidbar ist. Da mRNA direkt in das Zytoplasma injiziert wird über lange Zeiträume (A. Palazzo, unveröffentlichte Beobachtung) stabil ist, muss besonders sorgfältig auswählen, welche Zellen quantifiziert werden. Generell analysieren wir Zellen, die&gt; 90% der Injektionsflüssigkeit in den Zellkern, wie durch die Verteilung der OG-Dextran beurteilt wurde.

<table><tbody><tr><td>Injektionspuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl und 10 mM HEPES, pH 7,4</td></tr><tr><td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>Ein Bestand von 10 mg/ml im Injektionspuffer kann über lange Zeiträume bei -80&amp;#x00B0;C gelagert werden</td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillarrohre</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen für Gel-Loading zum Befüllen von Injektionsnadeln</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>Spritze für die Injektion</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>PBS-Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7,4</td></tr><tr><td>SSC-Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,4</td></tr><tr><td>4 % Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>Ein Bestand von 37 % Paraformaldehyd wird in PBS verdünnt</td></tr><tr><td>0,1 % Triton X-100 (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>Ein Bestand von 10 % Triton X-100 wird in PBS verdünnt</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;-tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl-Ribosid-Komplex (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>Whatman-Filterpapier</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>Vibrationsgedämpfter Tisch</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amanitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown-Mikropipettenzug</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>T7-RNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)-Polymerase</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100 mg/ml Dextransulfat, 5 mM VRC, 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, 0,5 mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;-tRNA, 60 % Formamid</td></tr></tbody></table>

die analyse der mrna nuclear export kinetics in säugerzellen durch mikroinjektion

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In Eukaryoten ist messenger RNA (mRNA) in den Zellkern transkribiert und muss in das Zytoplasma der Übersetzung Maschinen Zugriff exportiert werden. Obwohl die nuklearen Export von mRNA wurde ausgiebig in Xenopus Oozyten 1 und genetisch manipulierbaren Organismen wie Hefe-2 und der Drosophila abgeleitet S2 Zelle Linie 3 studierte, hatten nur wenige Studien in Säugerzellen durchgeführt. Darüber hinaus die Kinetik der mRNA export in somatischen Zellen von Säugetieren können nur geschlossen indirekt 4,5 sein. Um die Kernexport Kinetik der mRNA in Säugetierzellen Gewebekulturzellen zu messen, haben wir einen Test, der die Macht der Mikroinjektion mit Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) gekoppelt beschäftigt entwickelt. Diese Assays wurden verwendet, um nachzuweisen, dass in Säugerzellen, die Mehrheit der mRNAs in einem Spleißen abhängigen Weise 6,7 exportiert werden, oder in Art und Weise, dass spezifische RNA-Sequenzen, wie die Signalsequenz kodierende Region (SSCR) 6 erfordert. In diesem Test werden die Zellen entweder mit in vitro synthetisierten mRNA-oder Plasmid-DNA mit dem Gen von Interesse mikroinjiziert. Die mikroinjiziert Zellen sind für verschiedene Zeitpunkte dann fixiert und die sub-zelluläre Lokalisation von RNA wird anhand FISH inkubiert. Im Gegensatz zu Transfektion, wo die Transkription erfolgt einige Stunden nach der Zugabe von Nukleinsäuren, ermöglicht die Mikroinjektion von DNA oder mRNA für eine schnelle Ausdruck und erlaubt die Erzeugung von präzise kinetische Daten.

Hier beschreiben wir einen Test, dass die Macht der Mikroinjektion mit fluoreszierenden gekoppelt beschäftigt<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung, um die genaue Messung der Kernexport Kinetik der mRNA in somatischen Zellen von Säugetieren.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

In Eukaryoten wird die Boten-RNA (mRNA) im Zellkern transkribiert und muss in das Cytoplasma exportiert werden, um Zugang zum Translationsapparat zu erhalten. Obwohl ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Kinetik des mRNA-Exportes aus dem Zellkern in Säugetierzellen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst mRNA oder DNA in die Kerne von Säugetier-Zellkulturen mikroinjiziert wird. Nach der Mikroinjektion werden die Proben nach verschiedenen Inkubationszeiträumen fixiert.Die mRNA wird anschließend mittels fluoreszenzmarkierter in-situ-Hybridisierung oder FISH gefärbt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen abzubilden und die Menge der Fluoreszenz im Zytoplasma und im Zellkern zu quantifizieren. Letztendlich kann die Rate des mRNA-Exports durch eine Kombination aus Mikroinjektion und fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung gemessen werden.Hallo, ich bin SRG AV aus dem Labor von Alex Palazzo am Department für Biochemie der University of Toronto. Ich bin Stefan Toski, ebenfalls aus dem Palazzo-Labor. Ich bin Amy aus dem Palazzo-Labor und ich bin Khi Maha David aus dem Palazzo-Labor.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um mRNA mittels Mikroinjektion in die Kerne von Säugetierzellkulturen einzubringen. Außerdem demonstrieren wir, wie man die mRNA durch fluoreszente In-situ-Hybridisierung anfärben kann. In unserem Labor verwenden wir diese Verfahren, um die Kinetik des mRNA-Exportes aus dem Zellkern in Säugetierzellen zu untersuchen.Beginnen wir nun. Vor der Mikroinjektion verdünnen Sie zuvor vorbereitete Plasmid-DNA auf eine Konzentration zwischen 50 und 200 Mikrogramm pro Milliliter in Injektionspuffer. Geben Sie anschließend Oregon Green 488 oder OG, konjugiert an 70 Kilodalton Dextran, zur Mischung hinzu, um die Identifizierung injizierter Zellen zu ermöglichen.Das OG-konjugierte Dextran hilft dabei zu bestimmen, wie viel Flüssigkeit in den Zellkern injiziert wurde und wie viel in das Cytoplasma ausgetreten ist. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 G und vier Grad Celsius für mindestens 20 Minuten, um partikuläre Bestandteile, die die Nadelöffnung möglicherweise verstopfen könnten, abzutrennen. Wählen Sie die zu mikroinjizierende Säugetierzelllinie anhand der in dem schriftlichen Protokoll beschriebenen Kriterien bezüglich der Kosten aus.Sieben Zellen werden für diesen Demonstrationskeim verwendet. Die Zellen auf sauresgewaschenen Deckgläsern in 30-Millimeter-Petri-Schalen werden mindestens 24 Stunden vor der Mikroinjektion vorbereitet. Ideal sollte die Zellmonoschicht zum Zeitpunkt der Injektion etwa 70 bis 90 % konfluent sein, um eine einfache Identifizierung der injizierten Zellen zu ermöglichen; die Zellmonoschicht wird vor der Injektion durch einen 200-Mikroliter-Kunststoffpipettenspitze verletzt.Gravieren Sie ein Kreuz auf den Deckgläser und lassen Sie die Zellen mindestens 15 Minuten lang im Zellkultur-Inkubator regenerieren, bevor die Injektion erfolgt. Verwenden Sie für die Mikroinjektion ein umgekehrtes Mikroskop, das auf einem Lufttisch isoliert ist, um Vibrationen zu minimieren, die den Mikroinjektionsprozess stören könnten. Entnehmen Sie mithilfe einer Einor-Gel-Loader-Spitze etwa ein Mikroliter von der Oberseite der Zentrifugenprobe, um zu vermeiden, dass das Pellet gestört wird.Führen Sie die Pipettenspitze in das hintere Ende einer vorgefertigten Mikroinjektionsnadel ein und pressen Sie die Flüssigkeit heraus. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung in die Nadelspitze aufgenommen. Innerhalb von fünf bis 30 Sekunden sollte ein Meniskus in der Nähe der Spitze sichtbar sein.Platzieren Sie die mit Flüssigkeit gefüllte Nadel in der Halterung und befestigen Sie sie am Mikromanipulator. Unter einem Winkel von 45 Grad visualisieren Sie die Nadel mithilfe des 10x-Objektivs und positionieren Sie sie mittig im Sichtfeld nahe der Fokusebene. Über die groben Einstellknöpfe des Mikromanipulators wird die Halterung über einen Schlauch mit einer Glasspritze verbunden, die verwendet wird, um den Druck zu erzeugen, der erforderlich ist, um die Flüssigkeit aus der Nadelspitze auszustoßen.Um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten, wird die Spritze an eine Rohrhalterung montiert. Mit zwei Gummistopfen und zwei Metallklemmen wird die Nadel einige Millimeter angehoben, um zu verhindern, dass sie in späteren Schritten beschädigt wird, und anschließend wird das Mikroskop zurückgeschoben. Säule, erhöhen Sie den Druck, indem Sie den Spritzenkolben niedrücken.0,5 bis zwei Kubikzentimeter. Stellen Sie eine Petrischale mit einem Deckglas, das eine verletzte Zellschicht enth&auml;lt, auf den Beobachtungsplatz und ziehen Sie das Mikroskop zur&uuml;ck.Bewegen Sie den Hebel nach vorne in eine aufrechte Position, wodurch der Kondensor ausgerichtet wird, damit die Nadel in die Flüssigkeit eindringen kann. Dies sollte vorsichtig erfolgen, um zu verhindern, dass die Nadel am Deckglas bricht. Nutzen Sie das 10×-Objektiv, um die Mitte der gekreuzten Windung zu identifizieren, und positionieren Sie die Nadel über den Zellen, die injiziert werden sollen.Erhöhen Sie die Vergrößerung, indem Sie zum 40x-Objektiv wechseln. Senken und zentrieren Sie dann die Nadel mit den Feinjustierschrauben am Joystick. Beginnen Sie die Injektion an einer Ecke des Wundkreuzes, indem Sie die Nadel absenken, bis sie mit dem Zellkern in Kontakt kommt.Nach der Injektion weist eine Zelle eine deutliche Änderung der Phasenhelligkeit auf. Setzen Sie entlang einer Wundkante den Querschnitt fort. Um injizierte Zellen während der Visualisierung leicht identifizieren zu können, ist es entscheidend, dass der Injektionsdruck für jede Nadel korrekt eingestellt wird.Der Druck muss hoch genug sein, um die Plasmamembran und die Kernmembran zu durchdringen, aber nicht so hoch, dass die Zellen abgetötet werden. Mikroinjizieren Sie Zellen entlang des Wundrands für einen festgelegten Zeitraum. Mit etwas Übung können innerhalb dieses Zeitintervalls mehrere hundert Zellen injiziert werden.Wenn PlasmadNA injiziert wird, inkubieren Sie die mikroinjizierten Zellen vor der Fixierung 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Zellkulturinkubator und beenden Sie anschließend die Transkription. Behandeln Sie die Zellen hierzu mit einem Mikrogramm pro Milliliter Alpha-Amanitin, das in Wachstumsmedium gelöst ist. Diese Konzentration hemmt effektiv die Transkription von mikroinjizierten Plasmiden.Stellen Sie die Zellen zurück in den Inkubator und lassen Sie die Zellen die neu synthetisierte mRNA exportieren. Eine einzelne Nadel kann mehrfach zum Injizieren verschiedener Deckgläser verwendet werden. Die Nadel muss jedoch ausgetauscht werden, wenn sich die Art der mikroinjizierten DNA oder RNA geändert hat.Außerdem sollte die Nadel nach dem Entfernen vom Stab entsorgt werden, um eine genaue Messung der mRNA-Nuklearexportkinetik zu erhalten. Separate Proben sollten nach null Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten fixiert werden. Nach der Behandlung mit Alpha-Manin zur entsprechenden Zeit das Wachstumsmedium absaugen und die Zellen zweimal mit jeweils zwei Millilitern PBS-Lösung waschen.Es ist wichtig, die Deckgläser feucht zu halten, indem die Zeit, in der sie nicht in Flüssigkeit getaucht sind, minimiert wird. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter 4 % Aldehyd in PBS hinzufügen, und inkubieren Sie die Zellen mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem die fixierten Proben zwei weitere Male gewaschen wurden, permeabilisieren Sie die Zellen mit zwei Milliliter 0,1 % Triton X-100 in PBS und inkubieren Sie die Zellen erneut mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur.Spülen Sie die Proben abschließend noch zweimal, um sie für die Hybridisierung vorzubereiten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Waschpuffer aus einer XSSC-Lösung, die 25 bis 60 % Formamid enthält. Bereiten Sie dann die Färbevorrichtung für die Hybridisierung vor, indem Sie den Boden einer 150 Millimeter Petrischale mit Wasser bedecken und ein Stück Paraform darauf schwimmen lassen.Entfernen Sie das Wasser, indem Sie die Schale umdrehen, sodass das Paraform auf der Unterseite der Schale haften bleibt. Entfernen Sie manuell alle Luftblasen für jeden Deckglaser, der angefärbt werden soll. Geben Sie 100-Mikroliter-Tropfen der Hybridisierungslösung auf das Paraform. Beachten Sie, dass die Menge an Formage für das jeweils verwendete Fisch-Protokoll mithilfe einer Pinzette optimiert werden sollte. Entfernen Sie eine Deckglas mit fixierten Zellen aus der 30-Millimeter-Petri-Schale. Trocknen Sie mit Watman-Filterpapier die Rückseite des Deckglases und saugen Sie überschüssiges Puffermedium von der Vorderseite ab, ohne die Zellen dabei zu trocknen.Danach das Deckglas mit der Oberseite nach unten in die Fischlösung legen. Diesen Vorgang für jedes Deckglas wiederholen. Nachdem der Deckel der Färbekammer wieder aufgesetzt wurde, die Proben fünf bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Bereiten Sie mehrere Waschkammern auf die gleiche Weise vor wie die Färbe-Kammer; pipettieren Sie je einen Milliliter Waschpuffer auf die Paraform der Wasch-Kammer. Entfernen Sie nach der Inkubation die Deckgläser aus der Färbe-Kammer, indem Sie einen Milliliter Waschpuffer pipettieren. Neben dem Deckglas sollte die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung unter jede Probe gezogen werden.Entfernen Sie dann die Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie jedes auf einen Tropfen Waschpuffer, der fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Waschen Sie jedes Deckglas noch zweimal, sodass insgesamt drei Waschschritte pro Deckglas durchgeführt werden. Geben Sie 10 bis 30 Mikroliter Eindecklösung mit DAPI auf einen zuvor gewaschenen Objektträger. Jeder Objektträger kann zwei Deckgläser aufnehmen; verwenden Sie dazu eine Pinzette und Watman-Filterpapier.Trocknen Sie die Rückseite der Deckgläser ab und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit von der Vorderseite des Deckglases, ohne die Proben zu trocknen. Legen Sie jedes Deckglas mit der Probenfläche nach unten auf einen Tropfen Eindecklösung. Die eingebetteten Proben können bei vier Grad Celsius gelagert werden.Hier zeigten die Wirkungen von Alpha-Mantin auf die Transkription injizierter Plasmid-DNA in NIH-3T3-Fibroblasten, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Alpha-Mantin vorbehandelt wurden. Es wurden TFLs Delta I, Plasmid-DNA und OG-konjugiertes 70-Kilodalton-Dextran injiziert. Jede Zeile entspricht einem einzelnen Bildfeld, das für OG-70-Kilodalton-Dextran und T-uts-Delta-I-mRNA abgebildet wurde.Es ist ersichtlich, dass hohe Konzentrationen des Wirkstoffs die Produktion des T-UTS-delta-I-Transkripts vollständig inhibierten, während dies bei niedrigeren Konzentrationen nicht beobachtet wurde. Dargestellt ist hier ein Zeitverlauf der mRNA-Kernexportkosten. Sieben Zellen wurden mit T-UTS-delta-i-Plasmid-DNA und OG-konjugiertem 70-Kilodalton-Dextran injiziert.30 Minuten nach der Injektion wurden die Zellen mit Alpha-Mantin behandelt und bei 37 Grad Celsius für null Minuten, 60 Minuten und 120 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und mit einer Sonde gegen T UTS delta I mRNA sowie mit Antikörpern gegen das ER-Marker-Protein Trap Alpha gefärbt. Jede Zeile entspricht einem einzelnen Zellfeld.Informationen zur Quantifizierung des mRNA-Exports finden Sie im Online-Text hier. Der Zeitpunkt von 120 Minuten wurde vergrößert, um die Kolokalisation von TFS delta I mRNA im ER zu demonstrieren; eine Überlagerung der T UTS delta I mRNA in grün und des TRAP alpha in rot ist dargestellt. Informationen zur Kostainierung von mRNA mit Proteinen sind im Online-Text zu finden.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Exportkinetik von mRNA aus dem Zellkern durch Mikroinjektion misst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass eine erfolgreiche Mikroinjektion eine sorgfältige Vorbereitung erfordert. Wichtige Schritte wie die Herstellung von DNA und RNA, die Probenvorbereitung, das Ziehen von Injektionsnadeln, die Ausrichtung der optischen Geräte sowie die Fehlerbehebung bei der Mikroinjektion sind in unserem schriftlichen Protokoll beschrieben.Bei der Bildgebung und Analyse von mikroinjizierter mRNA ist es wichtig, dass die Quantifizierung auf Zellen beschr&auml;nkt bleibt, die mehr als 90&nbsp;% der injizierten Fl&uuml;ssigkeit in den Zellkern aufgenommen haben. Eine erfolgreiche nukle&auml;re Injektion kann beurteilt werden, indem die Verteilung von Organ Green-Dextran im Zellkern und im Zytoplasma visualisiert wird. Weitere Informationen zum Entwurf von FISH-Sonden sowie zur Verwendung von Bildanalyse-Software zur Untersuchung der Verteilung von mRNA im Zytoplasma und im Zellkern finden Sie in unserem Online-Protokoll.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Direkte intranukleären Injektion von cDNA ist eine effektive Transfektion Technik zur post-mitotischen Zellen. Diese Methode bietet ein hohes Maß an heterologen Proteinexpression von einzelnen oder mehreren cDNA-Konstrukte und ermöglicht Protein-Funktion, um in einem physiologisch relevanten Umfeld mit einer Vielzahl von Einzel-Zell-Assays untersucht werden.

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Ein Protokoll für die Vorbereitung der robuste, kleine HeLa Kernextrakten beschrieben wird. Dieses Protokoll ist wertvoll für Tests, die Verwendung von kleinen Populationen von Zellen, wie Zellen mit Medikamenten oder RNAi behandelt erfordern. Verfahren sollte für eine Vielzahl von Genexpressions und anderen Zelltypen, einschließlich Zellen des Patienten.

Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

Aufgrund ihrer Größe und relativ einfachen Organisation sind Drosophila-Ammenzellen ideal für Lebendzell-Bildgebungsstudien geeignet. Dieses Video beschreibt eine Mikroinjektionsmethode für die Verabreichung exogener Verbindungen in die Zellen, und das vorgestellte Protokoll demonstriert das Verfahren mit fluoreszierenden Oligonukleotidsonden, den sogenannten Molecular Beacons (MBs), die zur Visualisierung endogener mRNA-Transkripte verwendet werden.

Mikroinjektion von Drosophila-Ammenzellen: Eine Methode der intrazellulären Verabreichung

Hier beschreiben wir ein Verfahren zum endoplasmatischen Retikulum-assoziierte Säugetier-mRNAs in Gewebekulturzellen zu visualisieren. Diese Technik umfasst die selektive Permeabilisierung der Plasmamembran mit Digitonin zur cytoplasmatischen Inhalt durch fluoreszierende entfernen,...

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Biogenese von spliceosomals snRNAs ist ein komplexer Prozess mit verschiedenen Zellkompartimenten. Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend gekennzeichneten snRNAs eingesetzt, um deren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen.

Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte...

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

Erfahren Sie, wie Sie mRNA-Nuklearexportkinetiken in Säugerzellen durch Mikroinjektion und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung quantitativ messen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen der posttranskriptionellen Regulation.

Die Analyse der mRNA Nuclear Export Kinetics in Säugerzellen durch Mikroinjektion

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