Genexpression durch Einzelzell-Elektroporation in hippokampalen Schnittkulturen der Maus

Beginnen Sie mit einer Hippocampus-Scheibe aus einem Mäusegehirn, die auf einem Kultureinsatz in einer Schale kultiviert wurde.

Schneiden Sie den Einsatz mit der Scheibe ab und befestigen Sie ihn in einer Elektroporationskammer unter dem Mikroskop.

Perfundieren Sie die Kammer mit einem Puffer, der einen spannungsgesteuerten Natriumkanalblocker enthält, um die Übererregung zu hemmen und zelluläre Toxizität zu verhindern.

Positionieren Sie eine Pipette mit Plasmiden mit dem interessierenden Gen in der Nähe der Schnittscheibe.

Halten Sie den Überdruck aufrecht, um ein Verstopfen der Pipette zu verhindern, während Sie sich einem Ziel-Hippocampus-Neuron nähern, bis sich ein Membrangrübchen bildet.

Schalten Sie auf Unterdruck um, um eine Abdichtung mit der Membran zu erzeugen.

Wechseln Sie zwischen Über- und Unterdruck, um Zellschäden zu minimieren.

Wenden Sie einen Elektroporationsimpuls an, um die Membran vorübergehend zu permeabilisieren und den Plasmideintritt zu erleichtern.

Ziehen Sie die Pipette bei gleichbleibendem Überdruck zurück und wiederholen Sie die Elektroporation für benachbarte Zielneuronen.

Übertragen Sie die elektroporierte Scheibe auf ein frisches Insert und inkubieren Sie es, um die Expression des interessierenden Gens zu ermöglichen.

Um Schnittkulturen für die Elektroporation vorzubereiten, werden die interessierenden Kultureinsätze in einzelne drei Zentimeter große Petrischalen überführt, die mit 900 Mikrolitern Nährmedium beladen sind, und die Kulturen in einen Kohlendioxid-Inkubator auf dem Tisch gestellt. Anschließend werden frische Kultureinsätze mit einem Milliliter Scheibenkulturmedium pro Einsatz in einer 3,5 Zentimeter großen Petrischale mindestens 30 Minuten lang vorinkubiert und die Leitungen der Elektroporationsanlage fünf Minuten lang mit 10 % Bleiche sterilisiert.

Am Ende der Perfusion spülen Sie die Leitungen mindestens 30 Minuten lang mit ionisiertem autoklaviertem Wasser, bevor Sie mit einem Filter aus sterilisiertem aCSF perfundieren, das 0,001 millimolares Tetrodotoxin enthält. Stellen Sie den Elektroporatorimpuls auf eine Amplitude von minus fünf Volt, einen Rechteckimpuls, einen Zug von 500 Millisekunden, eine Frequenz von 50 Hertz und eine Impulsbreite von 500 Mikrosekunden ein. Füllen Sie eine Glaspipette mit fünf Mikrolitern plasmidhaltiger interner Lösung und schnippen und klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf die Spitze, um eingeschlossene Blasen zu entfernen.

Vergewissern Sie sich mit einem Präpariermikroskop, dass die Spitze nicht beschädigt ist, und befestigen Sie die Pipettenspitze sicher an der Elektrode. Wenn die Spitze mit dem aCSF in Berührung kommt, notieren Sie die Pipettenwiderstandsanzeige des Elektroporators. Um eine Schnittkultur zu isolieren, schneiden Sie die Membran des Kultureinsatzes mit einer scharfen Klinge ab und verwenden Sie eine scharfe abgewinkelte Pinzette, um die Schnittkultur vorsichtig in die Elektroporationskammer zu überführen.

Fixieren Sie dann die Kulturposition mit einem Scheibenanker. Für die Elektroporation der interessierenden Zellen üben Sie mit dem Mund positiven Druck auf die Pipette aus und verwenden Sie die dreidimensionalen Drehregler, um die Pipettenspitze nahe an die Oberfläche der Schnittkultur zu manövrieren. Betrachten Sie die Kultur mit dem Mikroskop, nähern Sie sich der Zielzelle mit der Spitze und halten Sie den Überdruck aufrecht, bis sich ein Grübchen auf der Zelloberfläche bildet.

Bei der Visualisierung des Grübchens wird schnell ein leichter Unterdruck mit dem Mund ausgeübt, so dass sich zwischen der Pipettenspitze und der Plasmamembran eine lose Dichtung bildet. Die Membran dringt leicht in die Pipette ein. Es sollte eine etwa 2,5-fache Erhöhung des Anfangswiderstands der Pipette beobachtet werden, was sich in einer Tonerhöhung aus den Lautsprechern zeigt.

Üben Sie schnell wieder positiven Druck aus, damit sich das Grübchen neu bildet. Führen Sie dann sofort mindestens zwei weitere Druckzyklen durch, wie gerade gezeigt, ohne Pause. Halten Sie nach dem letzten Druckimpuls den Unterdruck für eine Sekunde aufrecht.

Wenn der Ton aus den Lautsprechern einen stabilen Scheitelpunkt in der Tonhöhe erreicht, verwenden Sie das Fußpedal, um den Elektroporator schnell zu pulsieren. Ziehen Sie die Pipette nach der Elektroporation vorsichtig etwa 100 Mikrometer von der Zelle zurück, ohne Druck auszuüben, und üben Sie erneut positiven Druck aus, um sicherzustellen, dass der Widerstand ähnlich der Ausgangsanzeige ist, bevor Sie sich der nächsten Zelle nähern. Wenn alle gewünschten Zellen elektroporiert wurden, überführen Sie die Schnittkultur in einen der vorbereiteten Frischkultureinsätze und legen Sie den Einsatz bis zu drei Tage lang bei 35 Grad Celsius.