Optogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise für den Übergang vom Schlaf in den Wachzustand bei Mäusen

Sichern Sie eine anästhesierte Maus mit freiliegendem Schädel in einem stereotaktischen Rahmen.

Der Bettkern des Gehirns der Stria terminalis (BNST) enthält viral transduzierte Neuronen, die lichtempfindliche Kationenkanäle exprimieren.

Bohren Sie Löcher in den Schädel, setzen Sie optische Fasern ein und befestigen Sie diese mit Stützschrauben und Zahnzement.

Bohren Sie zusätzliche Löcher, um eine Baugruppe mit Elektroenzephalographie (EEG) und Elektromyographie (EMG) zu positionieren, und befestigen Sie sie mit Klebstoff.

Legen Sie die Nackenmuskulatur frei, um die EMG-Elektrodendrähte einzuführen, und lassen Sie dann die Erholung zu.

Schließen Sie die Maus an ein Aufnahmesystem an, platzieren Sie sie in einer Experimentierkammer und lassen Sie sie schlafen.

Geben Sie Licht durch die optische Faser, um die lichtempfindlichen Kationenkanäle zu aktivieren und einen Kationeneinstrom auszulösen, der Aktionspotentiale erzeugt.

Die Signale breiten sich in schlafregulierende Regionen aus und fördern die Wachheit.

Zeichnen Sie die EEG-Signale auf, um die Gehirnaktivität zu überwachen, und die EMG-Signale, um die Muskelaktivität zu erkennen und den Übergang vom Schlaf in den Wachzustand zu beobachten.

Für das Elektroenzephalogramm (EEG) und das Elektromyogramm (EMG) der Elektrodenimplantation löten Sie zunächst zwei Edelstahldrähte, von denen ein Millimeter Isolierung an beiden Enden abgezogen wurde, an die EMG-Elektroden und platzieren Sie die Mitte der Elektroden auf dem Bregma. Markieren Sie dann die Position für jede EEG-Elektrode.

Um die Position des optischen Faserimplantats zu bestimmen, befestigen Sie eine optische Faserzwinge am Manipulator und drehen Sie den Manipulatorarm um einen Winkel von plus oder minus 30 Grad gegen eine horizontale Linie. Setzen Sie die Faserspitze auf das Bregma und notieren Sie die Koordinaten. Bewegen Sie die Spitze an die angestrebte Einstichlinie und markieren Sie die Position auf dem Schädel und die Position für die Ankerschraube neben der Einstichstelle.

Verwenden Sie den Zahnbohrer, um den Schädel an jeder Stelle zu bohren, und verwenden Sie den Manipulator, um die optische Faser vorsichtig einzuführen, bis sie über den BNST reicht. Die Zwinge sollte auf dem verbleibenden Schädel aufliegen. Befestigen Sie die Faser mit einer Ankerschraube am Schädel und achten Sie darauf, dass die Dura nicht bricht oder das Gewebe beschädigt wird.

Bedecken Sie dann die Faser und die Schraube mit lichthärtendem Zahnzement. Bohren Sie anschließend Löcher für EEG/EMG-Elektroden und führen Sie die Spitze der ersten Elektrode in ein Loch ein. Halten Sie das Implantat mit einer Hand fest, tragen Sie Cyanacrylatkleber auf den Raum zwischen dem Schädel und der Elektrode auf und führen Sie die Elektrode den Rest des Weges ein, wobei Sie darauf achten, dass das Gewebe nicht beschädigt wird.

Wenn alle Elektroden platziert wurden, decken Sie den Umfang der Elektroden und der optischen Fasern mit zusätzlichem Cyanacrylatkleber und Cyanacrylat-Beschleuniger ab, um eine Unterbrechung an der Ferrule zum Glasfaserkabel und an den Verbindungszonen der Elektrode zum Anschlussdraht zu vermeiden. Legen Sie nun die Nackenmuskulatur frei und führen Sie die Drähte für die EMG-Elektrode unter den Muskel ein. Passen Sie die Länge der EMG-Elektrode so an, dass sie knapp unter die Nackenmuskulatur passt, und füllen Sie die Implantate mit mehr Cyanacrylat-Kleber und Beschleuniger.

Legen Sie dann die Maus auf ein Heizkissen mit Überwachung, bis sie vollständig wieder einsatzbereit ist. Für die EEG/EMG-Überwachung während der Photoanregung von Zielneuronen verwenden Sie zunächst einen Skalar, um die Laserintensität einzustellen, und verwenden Sie eine Ferrule, um die Spitze des Laserkabels an eine unbenutzte Glasfaser zu binden. Vergewissern Sie sich, dass an der Verbindungsstelle zwischen der Glasfaser und dem Kabel kein Platz vorhanden ist.

Geben Sie nach 20 Minuten den erwärmten Laser an den Intensitätsprüfer ab und stellen Sie die Intensität auf 10 Milliwatt pro Quadratmillimeter ein. Stellen Sie die Dauer des Lichtimpulses auf 10 Millisekunden, die Ruhephase auf 40 Millisekunden, den Zyklus auf 20 und die Wiederholung auf 20 ein. Ändern Sie den Lasermodus in Transistorlogik und vergewissern Sie sich, dass Lichtimpulse von der Faser emittiert werden, die vom Musterregler gesteuert wird.

Schließen Sie die implantierte Elektrode und den Kabeladapter an und decken Sie die Verbindungsstelle mit lichtundurchlässigem Material ab, um ein Austreten des Lasers zu verhindern. Und wenn der Laser bereit ist, bringen Sie die Mäuse zur EEG/EMG-Aufzeichnung in die Experimentierkammer. Um die Latenzzeit bis zum Wachzustand durch nicht schnelle Augenbewegungen oder Schlaf mit schnellen Augenbewegungen zu bewerten, begrenzen Sie die Aufzeichnungszeit und optimieren Sie die Standortgewinnzeit und lassen Sie die Mäuse mindestens eine Stunde lang frei in der Versuchskammer bewegen.

Überwachen Sie während des Versuchszeitraums die EEG- und EMG-Signale auf demselben Aufzeichnungsbildschirm. Werten Sie den Zustand der Maus als Wachzustand, Schlaf ohne schnelle Augenbewegungen oder Schlaf mit schnellen Augenbewegungen aus, indem Sie den Verstärkungsregler für jede Welle verwenden, um die Unterscheidung der einzelnen Zustände zu erleichtern. Zur Messung der Latenz zwischen Schlaf und Wachheit beobachten Sie einen stabilen Schlaf ohne schnelle Augenbewegung für 40 Sekunden, schalten Sie dann den Mustergenerator für die Photostimulation ein und bestätigen Sie die Laseremission zu den implantierten optischen Fasern.

Nehmen Sie dann die EEG/EMG-Signale auf, bis der Schlafzustand in den Wachzustand wechselt.