Name: The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Lernen Sie die Kultur primärer motorischer und sensorischer Neuronen aus embryonalen Ratten auf elektrogesponnenen Nanofaser-Gerüsten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung gerichteten Neuritenwachstums für Nervenregeneration.

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NIH K08 EB003996

1. Poly-L-Milchsäure (PLLA) Spinning-Lösung <ol><li> Lösen Sie 0,4 g PLLA in 9 mL Chloroform unter Rühren bei schwacher Hitze. </li><li> 1 ml Dimethylformamid auf die Lösung, womit sich die Endkonzentration der Lösung auf 4% PLLA (w / v) in Chloroform: DMF 9:1 (v / v). </li><li> Legen Sie die Lösung in einem Polypropylen oder Glas-Spritze mit einer stumpfen 23ga Metallspitze. </li></ol> 2. Spinning Substrat Vorbereitung 1 <ol><li> Machen Sie einen 8% (w / v) Lösung von 85:15 PLGA (Poly-Milchsäure-co-Glycolsäure) in Chloroform unter Rühren bei schwacher Hitze. </li><li> Coat sauber Glasdeckgläschen in PLGA durch Abdecken der Oberfläche jedes Deckglas mit der PLGA-Lösung. Lassen Sie die PLGA zu einem dünnen Film (ca. 30 min) trocknen lassen. </li></ol> 3. Elektrospinnen 2 <ol><li> Sichere PLGA beschichtet Glasdeckgläschen zum Kollektor mit leitfähigem Kohlenstoff Band. Für ausgerichteten Fasern, ist der Kollektor einer motorisch angetriebenen Rades. Für Wirrfasern, ist der Kollektor eine stationäre Platte. </li><li> Legen Spritze in Pumpe mit Spitze 20 cm vom Kollektor Rad. Set Pumpe auf ca. 2 ml / h und bei Verwendung eines Rades, die den Motor auf 300-400 RPM. Wenn möglich, tragen Sie eine -2 kV DC-Vorspannung an den Kollektor und +15 kV auf Metallspitze. In Abwesenheit des Zugangs zu einer bipolaren Spannungsversorgung, Masse des Kollektors. </li><li> Fasern Strahl aus der Spritze und sammeln auf dem rotierenden Rad. Weiter dreht, bis die gewünschte Dichte der Fasern erreicht wird. Swipe der Metall-Spitze mit einem Papiertuch angebracht, um eine nicht-leitenden Stab in regelmäßigen Abständen zur Vermeidung von Verstopfungen an der Spitze. </li></ol> 4. Moating 1 <ol><li> Nach Spinnen, "Graben" der elektrogesponnenen Proben durch Pipettieren einer Reihe von PLGA um den Umfang des Deckglases. Lassen Sie die PLGA, um zu trocknen. Dies erhält die Ausrichtung der Fasern während der Kultur. </li></ol> 5. Protein-Beschichtung <ol><li> Elektrogesponnene Fasern und Glas Kontrollen müssen in Protein vor Zellkultur beschichtet werden. Decken Sie die Substrate in einem Protein-Lösung für mindestens eine Stunde und dann absaugen überschüssige Lösung und weiterhin Absaugen, bis die Substrate trocken sind. Mögliche Protein-Lösungen gehören: PLL (Poly-L-Lysin) (100 pg / mL), Laminin (25 ug / mL) oder Fibronektin (50 ug / mL). Wenn PLL verwendet wird, sollte Substrate in sterilem Wasser gespült und getrocknet werden zweimal nach der ersten Beschichtung. </li></ol> 6. Erhalten E15 Rattenembryonen 3 * Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren durch die University of Michigan Ausschuss für Verwendung und Pflege von Tieren zugelassen getan. <ol><li> Zubereitung: Prüfen Sie, ob das Tier schwanger ist. Thaw 3 ml Trypsin, 3 ml FBS und warm eine Flasche L15. Feuer Politur einer Pasteurpipette. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente in 70% Ethanol für 30 min. </li><li> Vorbereiten und warmen plating Medien (siehe Tabelle 1). </li><li> Euthanasie: Führen Sie eine IP-Injektion von Ketamin / Xylazin. Warten Sie 10-15 Minuten und überprüfen Sie die fehlenden Hornhaut-und Pedal-Rücktritt Reflexe. Sobald Reflexe fehlen, führen Sie eine IC Injektion von Pentobarbital (FatalPlus). </li><li> Tent die Haut des Bauches. Schnitt durch die Haut-und Muskelschichten der Bauchhöhle aussetzen. Suchen Sie die Gebärmutter und lösen sie auf den Gebärmutterhals und Eierstöcken. </li><li> Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Schere und legen Sie sie sofort in warmes L15. (Alle folgenden Verfahren werden unter einem Binokular und Embryonen abgeschlossen und seziert Kabel sollten in warmen L15 jederzeit getaucht werden.) Enthaupten die Embryonen durch die Schließung einer Pinzette um das Kinn und unter dem Hinterhauptbein des Schädels. </li></ol> 7. Dissection 3 <ol><li> Setzen Sie den Embryo auf einer Seite. Schützen Sie das Rückenmark mit einem Satz von Zangen, während Sie den anderen Satz zu abstreifen Gliedmaßen und Bauchorgane. </li><li> Drehen Sie den Embryo und hält es fest mit einem Satz von Zangen. Snip entlang der Länge des Embryos, aus dem Hals bis zum Schwanz, bis das gesamte Kabel ausgesetzt ist. </li><li> Fassen Sie das Ende des Kabels vorsichtig und ziehen ihn über sich selbst auf den Schwanz zu entfernen. Die Schnur ziehen wird kostenlos mit Membran und Spinalganglien (DRG) befestigt. </li><li> Wenn DRG Explantation oder dissoziierte sensorischen Neuronen Kultur durchgeführt werden soll, snip der DRG ohne Kabel und deren Verlegung an einen frischen Teller warme L15. <ol><li> Für DRG Explantation Kultur, überspringen auf 10,2 Schritt </li><li> Für dissoziiert sensorischen Neuronen Kultur, fahren Sie mit Schritt 9 </li><li> Für Motoneuronen Kultur, wird der DRG mit der Membran in Schritt 7,5 entfernt werden </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Membran aus dem Rückenmark, indem Sie es am oberen Ende der Schnur und Peeling it down, ähnlich wie das Entfernen einer langen Socke. Wiederholen Sie dies für alle Embryonen und dann hacken Sie die Kabel in kleine (2-3 mm) Stück. </li></ol><pclass motor neuron verarbeitung>5,6,7 <ol><li> Gießen Sie die gehackte Schnüre und L15 in eine konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min zur Pelletierung der Stücke. </li><li> Abgießen des Überstandes und 3 ml Trypsin auf die pelletierten Schnüre. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 20 min. </li><li> Add 3 mL FBS, konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min wieder Pellet. </li><li> Abgießen des Überstandes und Mantel ein Feuer poliert Pasteurpipette mit FBS. </li><li> Fügen Sie eine Pasteurpipette voll von L15 die konische und dann sanft verreiben, bis die Lösung homogen ist ohne sichtbare Klumpen. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Bereiten Sie einen 9% igen Optiprep in L15. Bereiten Sie ein Rohr mit 3 mL der Optiprep Lösung für alle zwei Embryonen (wenn es eine ungerade Anzahl von Embryonen, bis Runde). </li><li> Löschen Sie die homogenisierte Lösung auf die Optiprep Lösung, teilt sie gleichmäßig unter allen Rohren. Drehen Sie das Röhrchen bei 2000 RPM für 15 min. </li><li> Sorgfältig sammeln die Besten 2 mL von jeder Röhre und Pool in einem 50 ml konischen. Füllen Sie den konisch mit L15 und Spin bei 1000 RPM für 5 min auf die Zellen des Optiprep spülen. </li><li> Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge von plating Medien (250-500 ul). Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf lebende Zellen zu identifizieren. Direkt auf 10,1 Schritt </li></ol> 9. Sensory Neuron (SN) Ihnen 7 <ol><li> Gießen Sie die DRG aus dem Rückenmark und L15 in einem konischen Rohr und Spin entfernt bei 1000 RPM für 2-3 min zur Pelletierung der Stücke. </li><li> Abgießen des Überstandes und 3 ml Trypsin auf die pelletierten DRG. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 min. </li><li> Add 3 mL FBS, konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min wieder Pellet. </li><li> Abgießen des Überstandes und Mantel ein Feuer poliert Pasteurpipette mit FBS. </li><li> Fügen Sie eine Pasteurpipette voll von L15 die konische und dann sanft verreiben, bis die Lösung homogen ist ohne sichtbare Klumpen. Vermeiden Sie Luftblasen. </li><li> Drehen Sie das Homogenat bei 1000 rpm für 5 min. Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge von SN Beschichtung Medien (250-500 ul). Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf lebende Zellen zu identifizieren. Weiter auf 10,1 Schritt </li></ol> 10. Plating und Kultur <ol><li> Für dissoziiert SN oder MN Kultur: <ol><li> Decken Sie die Substrate, die mit ein paar Tropfen Medien fügen Sie dann ein geeignetes Volumen der Zellsuspension. Dissoziierten Zellen sollte bei einer geringen Dichte (25-50 Zellen / mm 2) beschichtet werden. Lassen Sie die Zellen für mindestens eine Stunde vor Überschwemmungen die Brunnen mit den Medien zu halten. </li></ol></li><li> Für DRG Explantation Kultur: <ol><li> Decken Sie die Substrate, die mit ein paar Tropfen Medien fügen Sie dann an die Medien DRG. Ordnen Sie die DRG, so dass sie gleichmäßig auf dem Substrat (ca. 4 DRG wird auf einem 22x22 mm Deckglas fit) verteilt werden. Lassen Sie die DRG für mindestens 4 Stunden vor Überschwemmungen die Brunnen mit den Medien zu halten. </li></ol></li><li> Kulturen können beibehalten werden bis zu 4 Tage ohne Medienbruch zu ändern. Für längere Kulturen, sollte die Hälfte Medien ändert sich mit feed Medien durchgeführt werden. Feed Medien ist die gleiche Zusammensetzung wie plating Medien abzüglich der L-Glutamin. </li></ol> 11. Immunocytochemistry 1,5,8 <ol><li> Fixierung von Zellen: Absaugen Medien und ersetzen mit warmem 4% PFA (Paraformaldehyd) für 30 min. Führen Sie dann 3x 5 min 1x PBS gewaschen. </li><li> Blocking / Permeabilisierung: Bereiten block / perm Lösung (1,25% Rinderserumalbumin in 1X PBS, 0,05% Triton X-100 und 2,0% normalem Ziegenserum). Absaugen PBS und gelten block / perm Lösung, um Proben für 30 Minuten. Führen Sie dann 1x 5 min 1x PBS gewaschen. </li><li> Primärer Antikörper: Bereiten primärer Antikörper-Arbeitslösung (10% normales Ziegenserum, 1,25% Rinderserumalbumin, 0,1% Na-Azid, 0,05% Triton X-100 und zu 10 ml mit 1x PBS). Fügen Sie die entsprechende Menge des primären Antikörpers (siehe Tabelle 2). Linie verschiedene Gerichte mit Parafilm. Legen Sie eine 200 ul Perle der primären Antikörper-Lösung auf dem Parafilm für jeden Untergrund. Kehren Sie die Substrate, schwimmende ihnen Zelle nach unten auf dem primären Antikörper funktionierende Lösung über Nacht (wenn der Raum ist klimatisiert oder besonders trocken ist, kann ein Stück Wasser gesättigt Papier in eine Ecke der Schale hinzugefügt werden, um Verdunstung des funktionierende Lösung zu verhindern) . </li><li> Sekundäre Antikörper: Entfernen Sie die Substrate aus dem primären (die funktionierende Lösung können gesammelt werden, bei 4 ° C und wiederverwendet werden) und führen 2x 5 min 1x PBS gewaschen. Apply 200 ul sekundären Antikörper verdünnt 1:200 in PBS (auch auf Parafilm gesäumt Gericht invertiert) für 4 Stunden. </li><li> Entfernen Sie aus sekundären führen Sie dann 2x 5 min 1x PBS gewaschen. Berg Substrate auf Objektträgern mit Prolong goldhaltigen DAPI oder einem anderen geeigneten nuklearen Gegenfärbung. </li></ol> 12. Repräsentative Ergebnisse: Die typische Morphologie ausgerichtet und zufällige electrospun Fasern sind in Abbildung 1 dargestellt. Wir in der Regel erhalten MN Reinheit von&gt; 90% Neuronen 7,8 mit diesem Protokoll und wir haben gewartet DRG Kulturen so lange wie 1 Woche ohne nennenswerte Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Abbildung 2 zeigt typische MN Auftritt auf Glas und Fasern nach 24 Stunden Kultur-und Immunfärbung. Immungefärbte DRG für drei Tage auf Glas und Fasern kultiviert werden in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Fiber Alignment wird durch die Wahl des Kollektors manipuliert. A.) Fasern auf einem rotierenden Rad Sammler und B. gesponnen Aligned) random Fasern versponnen auf eine stationäre Platte Sammler. Maßstabsbalken = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative Motoneuronen für TuJ1 (grün) und DAPI (blau) nach 24 Stunden der Kultur auf PLL beschichteten A. gebeizt) Fasern und B.) Glas. Maßstabsbalken = 20 um. <img src="/files/ftp_upload/2389/2389fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Representative DRG gefärbt Neurofilament (grün) nach 3 Tagen Kultur auf PLL beschichteten A.) Glas und B.) Fasern. Maßstabsbalken = 200 um. <table border="1"><tbody><tr><td> Stammlösung: </td><td> MN Medien: </td><td> DRG / SN Medien: </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 Albumin </td><td> 12,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 mg mL -1 apo-Transferrin </td><td> 50 pl </td><td> 40 ul </td></tr><tr><td> 50 ug mL -1 β-Estradiol </td><td> 2,7 ul </td><td> 2,2 ul </td></tr><tr><td> 0,1 mg mL -1 Biotin </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 Katalase </td><td> 8 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 15 mg mL -1 D-Galaktose </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 ug mL -1 Hydrocortison </td><td> 3,7 ul </td><td> 2,9 ul </td></tr><tr><td> 0,63 mg mL -1 Progesteron </td><td> 0,5 ul </td><td> - </td></tr><tr><td> 16 mg mL -1 Putrescin </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> 50 ug mL -1 Selen </td><td> 3,4 ul </td><td> 4,1 ul </td></tr><tr><td> 2,5 mg mL -1 Superoxiddismutase </td><td> 50 pl </td><td> - </td></tr><tr><td> * 500 ng mL -1 nerve growth factor </td><td> - </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 100X PSN </td><td> 0,5 ml </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> * B27 </td><td> 1 mL </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> * 2 mM L-Glutamin </td><td> 35 ul </td><td> 35 ul </td></tr><tr><td> * Neurobasal </td><td> auf 50 mL </td><td> auf 50 mL </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Hinzufügen Stern (*)-Komponenten zu den Medien kurz vor dem Gebrauch. Die restlichen Komponenten kann als Stammlösung hergestellt werden und bei -20 ° C bis zum Gebrauch 6,7. <table border="1"><tbody><tr><td> Primary (Konzentration) </td><td> Neurons: </td><td> Glia: </td><td> Fibroblasten: </td></tr><tr><td> anti-β-Tubulin (TuJ1) (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> Anti-Neurofilament (1:1000) </td><td> ✓ </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> Anti-S-100 (1:250) </td><td> X </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td></tr><tr><td> Anti-NGFR p75 (1:500) </td><td> ✓ </td><td> ✓ </td><td> X </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Die Auswahl des primären Antikörpers ist abhängig von den Zielen der Ermittler. Die oben genannten sind mehrere Antikörper und die Konzentrationen wir mit Erfolg in unserem Labor verwendet wurden. S-100 ist besonders nützlich, um Schwann-Zellen zu identifizieren und / oder schau auf kontaminierende Fibroblasten, aber beachten Sie, dass es in Kombination muss mit NGFR p75 verwendet werden, um zwischen Gliazellen und fibroblasts4 unterscheiden. Wir haben auch bemerkt, dass NGFR p75 Flecken sehr leicht Neuriten während Neurofilament oder TuJ1 ausgezeichnete Wahl sind, wenn das Ziel ist es, individuelle Neuriten zu visualisieren. </pclass>

<ol><li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. Chapter 19 (1998).</li>
<li>Kameda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glial+progenitor+markers+p75NTR+and+S100+protein+in+the+developing+mouse+parathyroid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland.</a> Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-I+prevents+glutamate-induced+motor+neuron+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death.</a> Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).</li>
<li>Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-I+prevents+apoptosis+in+neurons+after+nerve+growth+factor+withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal.</a> J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste umfasst die ordnungsgemäße Herstellung des elektrogesponnenen Fasersubstrate. In flüssigen Medien wird die PLLA-Fasern, PLGA Film-und PLGA Graben aus dem Deckglas als eine Einheit zu trennen. Wenn die PLGA weggelassen wird, wird die PLLA-Fasern nicht eine flache Platte bleiben - sie werden curl up in einem unbrauchbaren Gewirr. So ist die PLGA-Film als ein geeignetes Substrat zur Faserausrichtung während der Kultur pflegen enthalten. Der Graben ist nach dem Schleudern sowohl um sicherzustellen, dass die Fasern fest an den PLGA-Film fixiert und strukturelle Steifigkeit, um den Film add hinzugefügt. Der Graben dient auch als ein nützliches Griff, wenn die Substrate während der Fixierung, Färbung und Montage sind manipuliert. Trituration ist der zweite entscheidende Schritt. Es sollten alle Anstrengungen, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Darüber hinaus haben wir viel höhere Ausbeuten erhalten, wenn ein feuerpolierte Pipette für diesen Schritt verwendet wird. Um Feuer polieren, leichte einem Bunsenbrenner und fügen Sie eine Lampe, um die Pipette. Pass die Spitze der Pipette schnell durch die Flamme 2-3 Mal während kontinuierlich Quetschen und Loslassen der Glühbirne - Luftstrom durch die Pipette wird verhindern, dass die Spitze von ganz geschlossen sein. Untersuchen Sie die Spitze der Pipette, um sicherzustellen, das Loch ist noch offen, und dass die Kanten erscheinen kurz vor Gebrauch abgerundet. Elektrospinnen ist ein sehr vielseitiger Prozess, der Elektrospinnen Parameter können geändert werden, um Fasern mit einer Vielzahl von Morphologien zu erzeugen. Tan et al. (2005) Details einer systematischen Untersuchung von Parametern, die den Durchmesser von PLLA elektrogesponnenen Fasern. Wang et al. (2009) präsentiert eine detaillierte Studie über die Einflussgrößen auf die Ausrichtung der elektrogesponnenen PLLA-Fasern.

<table><tbody><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>11415</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2289</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>Akorn Inc</td><td>AK8227</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC 23009-0010</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E 1132</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Superoxiddismutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4636</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PSN</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1680149</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Nalge Nunc international</td><td>1689149</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Accurate Chemical &amp; Scientific Corporation</td><td>2011</td><td></td></tr><tr><td>PLL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 4759</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TuJ1</td><td>BD Biosciences</td><td>556321</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Neurofilament</td><td>EMD Millipore</td><td>AB1987</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGFR p75</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3908</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Kohleband</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold +DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

the culture of primary motor und sensorischen neuronen in definierten medien auf elektrogesponnene poly-l-lactid nanofiber gerüste

The Culture of Primary Motor and Sensory Neurons in Defined Media on Electrospun Poly-L-lactide Nanofiber Scaffolds

Elektrospinnen ist eine Technik zur Herstellung von Mikro-bis Nano-Fasern. Fasern können mit unterschiedlichem Grad der Ausrichtung von hoch zu völlig zufällig ausgerichtet elektrogesponnenen werden. Darüber hinaus können Fasern aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich biologisch abbaubare Polymere wie Poly-L-Milchsäure (PLLA) gesponnen werden. Diese Eigenschaften machen elektroversponnenen Fasern geeignet für eine Vielzahl von Gerüsten Anwendungen im Tissue Engineering. Unser Fokus liegt auf den Einsatz von ausgerichtet elektrogesponnenen Fasern für die Regeneration von Nerven. Wir haben bereits gezeigt, dass ausgerichtet elektrogesponnenen PLLA-Fasern das Auswachsen von primären sensorischen und motorischen Neuronen in vitro zu lenken. Wir behaupten, daß die Verwendung eines primären Zellkultur-System unerlässlich ist bei der Beurteilung Biomaterialien zu modellieren realen Neuronen in vivo so eng wie möglich zu finden. Hier beschreiben wir Techniken, die in unserem Labor verwendet werden, um faserigen Gerüste und Kultur Spinalganglien Explantate sowie dissoziiert sensorischen und motorischen Neuronen, auf elektrogesponnenen Gerüste electrospin. Allerdings sind die Elektrospinnen und / oder Kultur hier vorgestellten Verfahren leicht für die Verwendung in anderen Anwendungen angepasst.

Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

Electrospinning ist eine Technik zur Herstellung von Fasern im Mikro- bis Nanobereich. Fasern können mit unterschiedlichen Ausrichtungsgraden elektrogesponnen werden, von hochgradig ausgerichteten ...

Ausgerichtete Elektrospinnfasern von BUN lenken das Wachstum von Neuronen in vitro und sind ein potenzieller Bestandteil von Gerüsten für die Nervenregeneration. Hier werden Elektrospinnfasergeflechte aus BUN hergestellt, und primäre sensorische und motorische Ratte-Neuronen werden darauf kultiviert. Zunächst werden faserige Gerüste mittels Elektrospinnen auf Glasdeckgläser aufgebracht.Primäre Neuronen werden anschließend aus Ratten des 15. embryonalen Tages gewonnen und auf elektrogesponnenen Fasergeflechten kultiviert. Die Neuronen dürfen anhaften und wachsen, anschließend werden sie fixiert und mit immunzytochemischen Methoden gefärbt. Die Bildgebungsergebnisse zeigen Veränderungen in der Morphologie der auf elektrogesponnenen Fasern kultivierten Neuronen, was darauf hindeutet, dass die Nanotopographie der elektrogesponnenen Fasern das Auswachsen der Neuriten lenken kann.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Verwendung transformierter Zelllinien, liegt darin, dass primäre Neuronen in vitro das Verhalten von Neuronen in vivo genauer nachahmen als transformierte Zellen. Diese Techniken ermöglichen es den Anwendern, elektrospun Fasern mit anderen Zelltypen zu verwenden. Alternativ können Anwender kultivierte motorische und sensible Neuronen für andere Untersuchungszwecke nutzen.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da das Elektrospinnen ein empfindlicher Prozess ist, was wir in unserem begleitenden Videoartikel ausführlicher erläutern. Um elektrogesponnene Faser-Substrate herzustellen, bereiten Sie zunächst eine 8%ige Lösung von 85 zu 15 Polylactid-co-glycolid-Säure oder PLGA in Chloroform und eine 4%ige Poly-L-lactid- oder PLLA-Lösung in Chloroform zu, indem Sie bei schwacher Erwärmung umrühren. Beschichten Sie anschließend saubere Glasdecken mit PLGA, indem Sie die Oberfläche jedes Deckgläschens mit der PLGA-Lösung bedecken. Lassen Sie das PLGA zu einem dünnen Film austrocknen, was etwa 30 Minuten dauert.Nachdem das PLGA trocken ist, verwenden Sie leitfähiges Kohlenstoffband, um einen PLG. A-beschichteten Deckgläser entweder auf einer motorbetriebenen Walze zur Herstellung ausgerichteter Fasern oder auf einer stationären Platte für zufällige Fasern zu befestigen. Platzieren Sie eine Spritze, die die 4%ige PLLA-Lösung enthält, in einer Pumpe mit einer Spitze, die 20 Zentimeter vom Sammler entfernt positioniert ist.Stellen Sie die Pumpe auf etwa 0,22 Milliliter pro Stunde ein. Stellen Sie den Radmotor auf 300 bis 400 Umdrehungen pro Minute ein. Legen Sie eine Gleichspannung von minus zwei Kilovolt an den Kollektor und plus 15 Kilovolt an die Leiterplatte an, die mit der Metallspitze in Kontakt steht.Wenn kein Zugang zu einer geerdeten bipolaren Stromversorgung besteht, startet der Kollektor die Spritzenpumpe, wobei die Fasern aus der Spitze der Spritze austreten und sich am rotierenden Rad sammeln. Weiterdrehen, bis die gewünschte Faserdichte erreicht ist, um ein Verstopfen der Metallspitze zu verhindern; diese in regelmäßigen Abständen mit einem auf einem nichtleitenden Stab befestigten Papiertuch abwischen, nachdem die PLGA-Pipettenspitze entlang des Randes des Deckgläschens einen Ring gezogen hat. Im Wesentlichen wird so ein Graben um die Elektrospinnanordnung angelegt.Fun-Proben ermöglichen das Trocknen des PLGA. Dies bewahrt die Ausrichtung der Fasern während der Kultur. Die elektrogesponnenen Fasern und die Glas-Kontrollen müssen vor der Zellkultur mit Protein beschichtet werden.Decken Sie die Substrate mindestens eine Stunde lang mit Polyol, Lysin, Laminin oder Fibronectin ab. Anschließend saugen Sie die überschüssige Lösung ab, bis die Substrate trocken sind. Falls Polyol-Lysin verwendet wird, sollte das Substrat nach der ersten Beschichtung zweimal mit steriler Wasser gespült und getrocknet werden.Nachdem sie trocken sind, bringen Sie die Substrate in sechs-Well-Gewebekulturplatten für die Zellkultur ein, um die kultivierten Zellen vorzubereiten, die auf Elektrospinnfasern wachsen sollen. Gewinnen Sie E15-Embryonen von einer euthanasierten trächtigen Ratte. Beginnen Sie damit, den Bereich mit 70 %igem Ethanol zu sterilisieren, und heben Sie anschließend die Bauchhaut an.Schneiden Sie durch die Haut- und Muskelschichten, um die Bauchhöhle freizulegen. Lokalisieren Sie die Gebärmutter und trennen Sie sie am Gebärmutterhals und an den Eierstöcken ab. Überführen Sie die Gebärmutter in eine sterile Schale.Entfernen Sie dann die Embryonen mit einer Schere aus dem Uterus und geben Sie sie sofort in warmes L 15. Nachdem Sie die Embryonen enthauptet haben, legen Sie einen Embryo unter Schonung des Rückenmarks mit einer Pinzette auf die Seite. Benutzen Sie die andere Pinzette, um die Gliedmaßen und Bauchorgane zu entfernen.Drehen Sie danach das Embryo und halten Sie es mit einer Pinzette fest. Lösen Sie vorsichtig entlang des Embryos vom Hals bis zum Schwanz, bis das gesamte Rückenmark freigelegt ist. Greifen Sie vorsichtig das Ende des Rückenmarks und ziehen Sie es über sich selbst hinweg in Richtung Schwanz. Um es zu entfernen, ziehen Sie die Schnur, wobei die Membran und die Spinalganglien daran haften bleiben. Falls eine Kultur von Spinalganglien-Explantaten oder dissoziierten sensorischen Neuronen durchgeführt werden soll, schneiden Sie die Spinalganglien von der Schnur ab und überführen Sie sie in eine neue Schale mit warmem L 15. Für die Kultur von Motoneuronen.Fassen Sie die Membran vom vorderen Ende des Rückenmarks an und ziehen Sie sie nach unten ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang – ähnlich wie beim Ausziehen einer langen Socke – für alle Embryonen und verwenden Sie dann eine Pinzette, um die Rückenmarksstränge in kleine Stücke zu zerschneiden, um Kulturen von Motoneuronen zu erhalten.Geben Sie die gehackten Rückenmarkstücke und L-15 in ein kegelförmiges Reagenzglas und zentrifugieren Sie zwei bis drei Minuten bei 180 × g. Um die Stücke zu pelletieren, entfernen Sie den Überstand und geben Sie drei Milliliter Trypsin in die pelletierten Rückenmarkstücke. Stellen Sie das Reagenzglas in ein Wasserbad bei 37 °C und inkubieren Sie es 20 Minuten lang.Nach der Inkubation drei Milliliter FBS in das kegelförmige Reagenzglas geben. Anschließend bei 180 × g zwei bis drei Minuten zentrifugieren, um es abzuschrecken. In der Zwischenzeit eine COTA-Feinbearbeitungspipette mit FBS befeuchten, indem man das FBS in die Pipette aufzieht und dann wieder ausstößt.Dadurch wird verhindert, dass Gewebestücke während der Trizierung am Glas haften. Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann eine volle Pasteurpipette L-15 in das kegelförmige Reagenzglas und trizurieren Sie vorsichtig mit der mit FBS beschichteten Pipette, bis die Lösung homogen ist und keine sichtbaren Klumpen mehr vorhanden sind.Vermeiden Sie Blasen. Bereiten Sie pro zwei Embryonen ein Gefäß mit drei Millilitern 9 % Opre in L 15 vor. Bei einer ungeraden Anzahl von Embryonen fügen Sie einen Tropfen hinzu.Die homogenisierte Lösung wird auf die Opti-Prep-Lösung gegeben, wobei der Homogenat gleichmäßig auf alle Röhrchen verteilt wird. Der Homogenat bildet eine sichtbare trübe Schicht auf der Opti-Prep-Lösung. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 15 Minuten lang mit 700 × g.Sammeln Sie vorsichtig die oberen zwei Milliliter aus jedem Röhrchen und überführen Sie sie in einen 50-Milliliter-Konus. Füllen Sie den Konus mit L-15 auf und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang mit 180 × g, um die Zellen von Opre zu reinigen. Entfernen Sie den Überstand.Das Pellet ist selten mit bloßem Auge sichtbar. In diesem Stadium suspendieren Sie die Zellen in einer kleinen Menge an Anzuchtmedium. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode, um lebende Zellen zu identifizieren.Die Zellen sind nun bereit zum Ausplattieren. Es wird eine Reinheit von über 90 % Neuronen erwartet, um Kulturen sensorischer Neuronen zu erhalten. Beginnen Sie damit, die aus den Rückenmarken und L 15 entnommenen dorsalen Wurzelganglien in ein kegelförmiges Reagenzglas zu gießen.Zentrifugieren Sie mit 180 × g für zwei bis drei Minuten, um die Pellets nach der Zentrifugation zu sammeln. Gießen Sie das Überstandsmaterial ab und geben Sie drei Milliliter Trypsin in das pelletierte DRG; inkubieren Sie es in einem Wasserbad bei 37 °C. Nach 10 Minuten nehmen Sie das Reagenzglas aus dem Wasserbad und geben drei Milliliter FBS hinzu. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 180 × g für zwei bis drei Minuten, um das Pellet erneut zu erhalten.Unterdessen eine Feuerpolier-Pasta-Pipette mit FBS beschichten. Wie zuvor die mit FBS beschichtete Pipette verwenden, um eine volle Pipette L-15 zum Pellet hinzuzufügen, und vorsichtig pipettieren, bis die Lösung homogen ist und keine sichtbaren Klumpen mehr vorhanden sind. Nach dem Zentrifugieren des Homogenats bei 180 × g für fünf Minuten sollten Luftblasen vermieden werden.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einer kleinen Menge an Sensory-Neuronen-Plattierungsmedium. Zählen Sie die Zellen mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode, um lebende Zellen zu identifizieren. Die Zellen sind nun bereit zum Plattieren, um sensorische oder motorische Neuronen zu kultivieren.Beginnen Sie damit, die mit Protein beschichteten Elektrospinnfasersubstrate mit einigen Tropfen Medium zu bedecken. Anschließend eine geeignete Menge Zellsuspension hinzufügen. Dissoziierte Zellen sollten mit geringer Dichte ausplattiert werden.Lassen Sie die Zellen mindestens eine Stunde im Inkubator anhaften, bevor Sie die Vertiefungen mit Medium überschichten und erneut in den Inkubator zurückbringen, um sie weiterzukultivieren. Dorsalwurzelganglien-Auberginen bedecken die proteinbeschichteten elektrogesponnenen Fasermaterialien mit einigen Tropfen Medium. Anschließend fügen Sie Dorsalwurzelganglien dem Medium hinzu.Ordnen Sie die Spinalganglien so an, dass sie gleichmäßig über das Substrat verteilt sind. Auf einem 22 mal 22 Millimeter großen Deckglas finden etwa vier Spinalganglien Platz. Stellen Sie die Spinalganglien-Kulturen in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und lassen Sie sie mindestens vier Stunden nach der Inkubation anhaften. Überfluten Sie die Vertiefungen mit Medium und stellen Sie sie in den Inkubator zurück. Die Kulturen können bis zu vier Tage lang ohne Mediumwechsel gehalten werden. Für längere Kulturen sollten halbe Mediumwechsel mit Fütterungsmedium durchgeführt werden.Das Kulturmedium weist dieselbe Zusammensetzung wie das Aufschichtmedium ohne L-Glutamin auf. Sobald die Zellen den gewünschten Zeitpunkt erreicht haben, kann die Immunzytochemie gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll durchgeführt werden. Dieses REM-Bild veranschaulicht die typische Morphologie ausgerichteter und zufällig angeordneter elektrogesponnener Fasern.Die Faseranordnung wird durch die Wahl des Sammlers gesteuert. Beachten Sie, dass Fasern, die auf einen rotierenden Radsammler gesponnen werden, gleichmäßig ausgerichtet sind. Im Gegensatz dazu weisen Fasern, die auf einen stationären Sammler gesponnen werden, eine zufällige Morphologie auf.Diese Bilder zeigen eine Färbung von Motoneuronen für Beta-Tubulin in Grün und eine DPI-Kernfärbung in Blau. Nach 24-stündiger Kultur auf PLL-beschichteten Fasern und Glas auf Fasern weisen Motoneuronen typischerweise nur wenige Fortsätze auf, die von dem Zellkörper parallel zur Ausrichtungsrichtung der Fasern ausgehen, die in diesem Bild von links nach rechts verläuft. Die Hauptfortsätze von Zellen, die auf Fasern kultiviert wurden, sind deutlich länger als die Hauptfortsätze von Zellen, die zu vergleichbaren Zeitpunkten auf Glas kultiviert wurden.Punkte auf gläsernen Motoneuronen weisen typischerweise nach 24 Stunden mehr Fortsätze auf, die radial vom Zellkörper ausgehen. Die auf Fasern kultivierten Neuronen. Der Hauptfortsatz ist auf Glas außerdem kürzer als die auf Fasern in diesen Bildern sichtbaren.Die Spinalganglien sind für Neurofilamente angefärbt, die in Grün dargestellt sind. Nach drei Tagen Kultur auf PLL-beschichtetem Glas zeigen die Spinalganglien auf dem Glas radial verlaufende Neuriten. Es besteht ebenfalls eine erhebliche Überlappung benachbarter Neuriten auf den Fasern.Die Neuriten strahlen ebenfalls radial vom Ganglion aus. Anschließend ändern sie jedoch die Richtung und folgen der Ausrichtung der Fasern. Es kommt signifikant seltener zu einer Überlappung benachbarter Neuriten, sobald diese Verfahren beherrscht sind.Das Elektrospinnen kann in etwa 30 Minuten abgeschlossen werden, und motorische sowie sensible Neuronen können in etwa zwei Stunden gewonnen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sterile Techniken anzuwenden. Die Verwendung einer flammenglasierten Pipette für den Iterationsschritt ist notwendig, um das Überleben der Neuronen zu maximieren.Zusätzlich ist es wichtig, das Adhäsionsmolekül und die elektrogesponnenen Fasern für die geeignete Dauer zu inkubieren. Wenn beispielsweise die Fasern weniger als eine Stunde mit Polylysin beschichtet werden, ist die Beschichtung unzureichend, um die Zelladhäsion zu unterstützen. Werden die Fasern hingegen zu lange, beispielsweise über Nacht, mit Polylysin behandelt, können sie sich zersetzen.Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass die meisten Mikroskope die Visualisierung von Neuronen auf Fasern während der Kultur nicht ermöglichen. Der Grund hierfür liegt darin, dass die Fasern und die neuronalen Fortsätze sich stark ähneln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Kulturen von motorischen und sensiblen Neuronen aus Ratten vom Embryonaltag 15 auf elektrogesponnenen Fasermaterialien angezüchtet werden können.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Hochspannungen äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets geeignete Vorsichtsmaßnahmen, um den Bediener von der elektrischen Spinnvorrichtung zu isolieren.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Dieses Video zeigt die Erstellung eines 3D-polarisierten neuronalen Gewebemodells unter Verwendung von Seiden-Kollagen-Gerüsten. Es beschreibt den Prozess der Aussaat neuronaler Zellen auf porösen Seidengerüsten, der Inkubation für die Zellanhaftung, der Einbettung des Gerüsts mit Kollagen und unterstreicht die Bedeutung der unterstützenden Kollagenmatrix bei der Bildung eines 3D-polarisierten Nervengewebemodells.

Entwicklung eines auf Seidenkollagen basierenden 3D-Modells von polarisiertem Nervengewebe

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen.  Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

Dieser Artikel beschreibt eine Reihe von Setups für die Aussaat menschlicher mesenchymaler Stammzellen auf Materialien, in diesem Fall elektrogesponnene Garne, die die Basis von Standard-Kultur-Well-Platten nicht bedecken, um die Anzahl der Zellen, die sich anfänglich anheften, im Vergleich zur bekannten Seeding-Dichte zu maximieren und zu quantifizieren.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Einblicke in die komplexen Aktionen des Gehirns erfordern fortschrittliche Forschungswerkzeuge. Hier demonstrieren wir ein neuartiges, auf Seidenkollagen basierendes 3D-Modell von neuronalem Gewebe, das einer gehirnähnlichen Architektur ähnelt. Das Modell kann verwendet werden, um die Assemblierung neuronaler Netzwerke, die axonale Führung, Zell-Zell-Interaktionen und die elektrische Aktivität zu untersuchen.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Fortschritte in der Biomaterialtechnologie ermöglichen die Entwicklung dreidimensionaler Konstrukte vom Typ Mehrzelle. Wir haben Elektrospinning-Protokolle entwickelt, um drei einzelne Gerüste herzustellen, um die Hauptstrukturzellen der Atemwege zu kultivieren und ein 3D-In-vitro-Modell der Bronchiolenwand der Atemwege zu erstellen.

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Hier zeigen wir, wie Epithelzellen, die mit Fibroblasten in dem nanofaserigen membranbasierten Zweischichtsystem kultiviert wurden, stabil an der Membran haften und auf ihr wachsen können.

Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Lernen Sie die Kultur primärer motorischer und sensorischer Neuronen aus embryonalen Ratten auf elektrogesponnenen Nanofaser-Gerüsten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung gerichteten Neuritenwachstums für Nervenregeneration.

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste (Video) | JoVE Journal

The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

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