Stereotaktische Transplantation einer neuronalen Zellsuspension in eine Maus mit traumatischer Hirnverletzung

Beginnen Sie mit einer vorgeladenen Spritze, die an einer stereotaktischen Spritzenpumpe befestigt ist.

Die Spritze enthält eine humaninduzierte pluripotente Stammzellsuspension, die aus neuralen Zellen gewonnen wird.

Positionieren Sie die Nadel über der chirurgisch freigelegten Hirnrinde einer Maus mit einem Schädel-Hirn-Trauma.

Senken Sie die Spritze so ab, dass sie die Dura mit der Nadelspitze berührt, passen Sie die Koordinaten an die Verletzungsstelle an und ziehen Sie sie leicht zurück.

Erstellen Sie nun einen kleinen Schnitt und legen Sie einen Eintrittspunkt für die Nadel fest.

Senken Sie anschließend den Kolben ab, um den Fluss der Zellsuspension zu ermöglichen.

Senken Sie die Nadel und dringen Sie in das Gehirn ein, um die Grenze zwischen grauer Substanz und weißer Substanz des tiefen Kortex zu erreichen.

Zum Schluss infundieren Sie die Zellsuspension langsam, während Sie die Operationsstelle mit Kochsalzlösung spülen, um die Hydratation aufrechtzuerhalten.

Ziehen Sie nach Abschluss die Nadel zurück, spülen Sie erneut und schließen Sie den Schnitt.

Im Laufe der Zeit reifen die transplantierten Zellen, stellen neuronale Schaltkreise wieder her und reparieren Hirnschäden.

Etwa 24 Stunden nach der Kraniektomie setzen Sie die Maus wieder in den stereotaktischen Rahmen ein.

Decken Sie die Maus mit dem gefensterten OP-Tuch ab. Spülen Sie die Inzisionsstelle mit steriler Kochsalzlösung, um die Stelle zu reinigen und die Nähte zu lockern. Verwenden Sie ein mit 70 % Ethanol getränktes Wattestäbchen, um die Inzisionsstelle sanft zu sterilisieren, und verwenden Sie eine feine Pinzette und eine Augenschere, um die Nähte zu entfernen.

Spülen Sie dann die Operations- und Kraniektomiestelle mit reichlich steriler Kochsalzlösung. Schwenken oder klopfen Sie in einer Biosicherheitshaube der Zellkultur vorsichtig auf das Zellröhrchen, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 7,5 Mikroliter Zellen durch das Kolbenende in eine Hamilton-Spritze zu laden.

Halten Sie die Spritze in einem Winkel von 120 Grad mit dem Kolbenende nach unten und führen Sie den Kolben ein, wobei Sie darauf achten, dass keine Luftblase zwischen der Aufhängung und der Kolbenspitze entsteht. Befestigen Sie die Dichtungsbaugruppe an der Pipettennadel und befestigen Sie die Nadel an der Spritze. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Pipettennadel zu bewegen, und befestigen Sie die Spritze an der stereotaktischen Spritzenpumpe.

Schieben Sie den Kolben vor, um sicherzustellen, dass die Spritzenpumpenbaugruppe ordnungsgemäß funktioniert, und bewegen Sie die Nadel in die Koordinaten für die Injektion. Richten Sie die Nadelspitze auf Bregma aus und setzen Sie die x- und y-Koordinaten auf Null. Bewegen Sie die Nadelspitze über die Kraniektomie zwei Millimeter lateral und minus einen Millimeter nach hinten zum Bregma und berühren Sie die Nadelspitze mit der Dura mater-Oberfläche.

Heben Sie die Nadel leicht an und machen Sie dann einen kleinen Schnitt in der Dura Mater an der Stelle, an der die Nadel Kontakt hatte. Stellen Sie die stereotaktische Koordinate auf z gleich Null ein und drücken Sie den Kolben, um zu bestätigen, dass die Zellsuspension ausreichend fließt, bevor Sie die Nadel in das Gehirn einführen. Führen Sie die Nadel bis zu einer Tiefe von z gleich minus 1,4 Millimetern in das Gehirn ein, um das Transplantat an der Grenze zwischen grauer Substanz und weißer Substanz des tiefen Kortex zu platzieren.

Starten Sie die Spritzenpumpe, um die Zellsuspension über einen Zeitraum von 15 Minuten zu infundieren. Verwenden Sie ein Mikroskop mit großem Arbeitsabstand, um den Abfluss der Zellsuspension zu überwachen, und spülen Sie die Operationsstelle während der Injektion mit steriler Kochsalzlösung, um die Hydratation des Gewebes aufrechtzuerhalten. Wenn alle Zellen abgegeben wurden, ziehen Sie die Transplantationsnadel langsam zurück und spülen Sie die Operationsstelle mit zusätzlicher Kochsalzlösung, bevor Sie den Schnitt mit neuen Nähten schließen.

Führen Sie dann die postoperative Versorgung wie demonstriert durch.