Trennung von inneren und äußeren Membranfraktionen von gramnegativen Bakterien

Beginnen Sie mit der Gesamtmembranfraktion eines gramnegativen Bakteriums, einschließlich innerer und äußerer Membranvesikel, die in einer Saccharose niedriger Dichte suspendiert ist, die die strukturelle Integrität bewahrt.

Um die Membranvesikel zu trennen, geben Sie nacheinander Saccharoselösungen mit hoher und mittlerer Dichte in ein Ultrazentrifugenröhrchen.

Fügen Sie als Nächstes die Membranfraktion und die Saccharose niedriger Dichte hinzu, um einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten zu erzeugen.

Ultrazentrifuge zur Trennung von Vesikeln anhand ihrer Dichte.

Die weniger dichten inneren Membranvesikel bilden oben eine Schicht.

Die dichteren Vesikel der äußeren Membran, die reich an Lipopolysacchariden und Proteinen sind, bilden eine Bande an der Grenzfläche von Saccharoselösungen mittlerer und hoher Dichte.

Sammeln Sie die innere Membranschicht und verwerfen Sie die Gradientenlösung, wobei eine kleine Menge übrig bleibt.

Sammeln Sie dann die äußere Membranschicht.

Fügen Sie jeder Fraktion zur Stabilisierung einen Speicherpuffer hinzu.

Zentrifugieren, um die Vesikel zu trennen und den Überstand zu entfernen.

Resuspendieren Sie die gereinigten Membranvesikel, homogenisieren Sie sie