In vitro bakterielle Transinfektion von T-Zellen durch immunologische Synapsenbildung

Beginnen Sie mit Vertiefungen, die CD4⁺ T-Zellen enthalten, die Rezeptoren exprimieren, die spezifisch für das Ovoalbuminpeptid oder OVAp sind.

In die Vertiefung der Negativkontrolle wird eine poröse Membraneinlage eingesetzt.

Entnehmen Sie dendritische Zellen, die mit Bakterien infiziert und mit OVAp beladen sind, in einem Röhrchen zur Oberflächenpräsentation.

Dendritische Zellen werden direkt in die Testvertiefung und in den Einsatz in der Negativkontrollvertiefung gegeben.

Fügen Sie den Vertiefungen Medien hinzu und inkubieren Sie.

In der Testvertiefung interagieren die Zellen und bilden eine immunologische Synapse, die den bakteriellen Transfer von der dendritischen Zelle zur T-Zelle erleichtert, ein Prozess, der als Transinfektion bekannt ist.

In der Negativkontrollvertiefung verhindert die Membranbarriere die Zell-Zell-Interaktion und hemmt dadurch die Transinfektion.

Das Antibiotikum Gentamicin in die Vertiefungen geben und inkubieren.

Gentamicin kann nicht in eukaryotische Zellen eindringen, so dass nur nicht-internalisierte Bakterien abgetötet werden, während internalisierte Bakterien überleben.

Die Testprobe mit infizierten T-Zellen und die Kontrollprobe mit nicht infizierten T-Zellen sind nun bereit für die T-Zellisolierung und die Quantifizierung der Transinfektion.

Geben Sie auf eine 24-Well-Kulturplatte zwei Millionen CD4⁺ T-Zellen in einem Volumen von 0,5 Millilitern in jede der fünf Vertiefungen.

Um den physischen Kontakt zu kontrollieren, platzieren Sie anschließend Polycarbonat-Transwell-Barrieren mit einer Porengröße von drei Mikrometern in der dritten und vierten Vertiefung. Geben Sie in die erste Vertiefung 0,1 Milliliter der infizierten überladenen dendritischen Zellen. In die zweite Vertiefung geben Sie 0,1 Milliliter der infizierten, nicht geladenen dendritischen Zellen.

Geben Sie 0,1 Milliliter der infizierten überladenen dendritischen Zellen in eine Vertiefung und 0,1 Milliliter der infizierten, nicht geladenen dendritischen Zellen in die andere Vertiefung. Schließlich infizieren Sie als Negativkontrolle die fünfte Vertiefung der CD4⁺ T-Zellen direkt bei einem MOI von 10. Bringen Sie dann das Gesamtvolumen der Vertiefung mit RPMI auf 0,6 Milliliter.

Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang, damit sich Immunsynapsen bilden können. Nach der Inkubation 100 Mikrogramm Gentamicin pro Milliliter Medium in jede Vertiefung geben und eine Stunde lang inkubieren. Gentamicin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das nicht in der Lage ist, in eukaryotische Zellen einzudringen.

Daher tötet Aminoglykosid in diesem Schritt extrazelluläre Bakterien, aber keine intrazellulären Bakterien.