Bewertung der Pneumokokken-Adhäsion an primäre humane Endothelzellen unter konstantem Medienfluss
JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologie
0 Ansichten • 3:20 Min. • September 26th, 2025
Legen Sie einen mit Gelatine beschichteten Objektträger, der an eine mikrofluidische Pumpe angeschlossen ist, auf einen Mikroskoptisch.
Der Objektträger enthält primäre humane Endothelzellen, die unter fließenden Medien kultiviert wurden, mit Strings des von-Willebrand-Faktors oder VWF, einem Glykoprotein, auf der Zelloberfläche.
Diese Fäden werden durch die Stimulation der Zellen mit Histamin erzeugt.
Der kontrollierte Medienfluss, der durch die mikrofluidische Pumpe appliziert wird, fördert die VWF-Sekretion und das Abwickeln. Dadurch werden bestimmte Bindungsdomänen für die VWF-Zeichenfolgen verfügbar gemacht.
Stoppen Sie den Medienfluss, fügen Sie einen grünen Fluorophor-konjugierten VWF-spezifischen Antikörper hinzu und setzen Sie den Fluss fort, um die Strings mit dem Antikörper zu markieren.
Unterbrechen Sie den Medienfluss und führen Sie rot fluoreszierende Protein-exprimierende Pneumokokken-Bakterien ein.
Starten Sie den Fluss neu, um die Bakterien zu verteilen und die Anheftung an die exponierten Domänen durch Oberflächenadhäsine zu ermöglichen.
Visualisieren Sie mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die Bindung von Bakterien an die Fäden in Echtzeit.
Stoppen Sie den Medienfluss und erfassen Sie Z-Stapel-Bilder, um die Anheftung von Bakterien an die Endothelzellen zu quantifizieren.
Zur mikroskopischen Visualisierung stellen Sie die Fluidikeinheit in die 37 Grad Celsius heiße Heizkammer. Legen Sie den Objektträger auf den Tisch eines vorgewärmten Mikroskops.
Kontrolle der Zellmorphologie und der Integrität der HUVEC-Schicht vor der Injektion von Histamin und Bakterien in den Flusskreislauf. Behalten Sie die Flow-Einstellung bei. Induzieren Sie die Freisetzung von VWF aus endothelial lebensfähigen Palade-Körpern, indem Sie 136 Mikroliter einer 100 millimolaren Histamin-Stammlösung durch eine Injektionsöffnung in das EKGMS-Medium injizieren, das im Perfusionsschlauch zirkuliert.
Für den Immunfluoreszenznachweis von multimerisierten VWF-Strings injizieren Sie 20 Mikrogramm eines VWF-spezifischen FITC-konjugierten Antikörpers in einem Volumen von 200 Mikrolitern PBS in das zirkulierende 13,6 Milliliter EKGMS-Medium. Um die Pneumokokken-Bindung an die auf HUVEC-Zelloberflächen erzeugten VWF-Strings zu quantifizieren, injizieren Sie 1,35 mal 10 bis zur achten KBE pro Milliliter RFP, die Pneumokokken in einem maximalen Volumen von einem Milliliter exprimieren, unter Verwendung des Injektionsanschlusses in das EKGMS-Medium. Wählen Sie ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv für die Mikroskopvergrößerung und passen Sie die Fluoreszenzfiltereinstellungen in der Mikroskopsoftware an den RFP-Kanal mit einem 540-Nanometer-Detektionsfilter zum Nachweis von RFP-exprimierenden Pneumokokken an.
Zur Quantifizierung der bakteriellen Bindung an die VWF-Strings erstellen Sie Snapshots von Z-Stapeln von mindestens 30 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten, und zählen Sie die Menge an Pneumokokken.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Visualisierung der Bindung von Bakterien an von-Willebrand-Faktor-(VWF-)Stränge auf humanen endothelialen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie beschrieben. Das Verfahren beinhaltet die Stimulierung der Zellen mit Histamin zur Förderung der VWF-Sekretion sowie die Zugabe fluoreszenzmarkierter Antikörper und Bakterien, um deren Wechselwirkungen zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Der von-Willebrand-Faktor ist ein Glykoprotein, das an der Blutgerinnung beteiligt ist.
- Endothelzellen spielen eine entscheidende Rolle in der Gefäßbiologie.
- Das Verständnis der bakteriellen Adhäsion an Endothelzellen ist wichtig für die Infektionsforschung.
- Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie lassen sich zelluläre Wechselwirkungen in Echtzeit visualisieren.
Zweck der Studie
- Die Bindung von Pneumokokken-Bakterien an VWF-Stränge auf endothelialen Zellen mittels Immunfluoreszenztechniken sichtbar machen.
- Die bakterielle Anheftung mittels Immunfluoreszenztechniken quantifizieren.
- Die Wirkung von Histamin auf die Sekretion und Entfaltung von VWF untersuchen.
Verwendete Methoden
- Primäre humane endotheliale Zellen, kultiviert unter fließendem Medium.
- Histamininjektion zur Stimulation der VWF-Sekretion.
- Fluoreszenzantikörperfärbung von VWF-Strängen.
- Echtzeit-Aufnahme der bakteriellen Anheftung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von VWF-Strängen auf endothelialen Zellen.
- Quantifizierung der Anheftung von Pneumokokken an VWF-Strängen.
- Nachweis der Rolle von Histamin bei der Sekretion und Entfaltung von VWF.
- Gewonnene Erkenntnisse über bakterielle Adhäsionsmechanismen auf endothelialen Oberflächen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht die effektive Visualisierung und Quantifizierung der Bindung von Bakterien an endotheliale Zellen.
- Histamin spielt eine bedeutende Rolle bei der Modulation der VWF-Dynamik.
- Diese Studie trägt zum Verständnis bakterieller Interaktionen mit dem vaskulären Endothel bei.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung und Quantifizierung der Anheftung von Pneumokokken an von-Willebrand-Faktor-Strängen auf primären humanen endothelialen Zellen unter physiologischen Flussbedingungen. Sie bietet ein physiologisch relevantes Modell zur Untersuchung der Mechanismen der frühen bakteriellen Adhäsion bei vaskulären Infektionen. Der Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Risikominderung in der antimikrobiellen Wirkstoffentwicklung, indem er bakterielle Adhäsine mit der Interaktion von Wirtsendothelzellen unter Flussbedingungen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem die Bindung von Bakterien an spezifische Wirtsliganden unter Flussbedingungen visualisiert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung bakterieller Adhäsine und Wirtsrezeptoren in einem dynamischen endothelialen Modell.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen durch Quantifizierung der Anheftungskinetik, die für vaskuläre Infektionswege relevant ist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare VWF-Strangbildung auf endothelialen Oberflächen für konsistente Nachweise der bakteriellen Bindung.
- Quantitative Auswertung: Liefert messbare Daten zur Anheftung mittels Z-Stapel-Bildgebung und quantitativer Erfassung fluoreszierender Bakterien zur Beurteilung positiver Ergebnisse.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit mikrofluidischen Plattformen, die einen mittleren Durchsatz bei der Untersuchung von Inhibitoren oder Mutantenstämmen ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert die pneumokokkale Endotheladhäsion, einen entscheidenden Schritt in der Pathogenese von Sepsis und Meningitis.
- Translationale Kontinuität: Verbindet in-vitro-Bindungsdaten mit präklinischer Wirksamkeit, indem die Zielstrukturenbindung unter Flussbedingungen validiert wird.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der Hemmung der bakteriellen Anheftung an physiologisch relevante endotheliale Liganden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für den Übergang von der frühen Entdeckung zur präklinischen Phase und unterstützt die Hypothesenprüfung bei der Zielvalidierung sowie die Assay-Entwicklung für antiinfektiöse Wirkstoffkandidaten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bakterieller Adhesin-Wirt-Liganden-Interaktionen unter physiologischem Scherstress.
- Screening: Bietet assaysbereite endotheliale Modelle mit quantifizierbaren, reproduzierbaren Bindungsendpunkten zur Evaluierung von Verbindungen oder Stämmen.
- Analytik: Erzeugt quantitative, fluoreszenzbasierte Messwerte, die den Vergleich der Anheftung unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Bindungsereignisse mit pathophysiologischer Relevanz in Modellen vaskulärer Infektionen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare endotheliale Durchflussplattform zur Untersuchung mehrerer Pathogene oder Wirtziele.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in den Mechanismus der bakteriellen Adhäsion unter Flussbedingungen und reduziert die Uneindeutigkeit bei der Zielstrukturvalidierung.
- Operativer Wert: Standardisiert die VWF-Stimulation, Markierung und bakterielle Belastung, um reproduzierbare Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Auswahl aussichtsreicher Wirkstoffe, indem Verbindungen anhand ihrer Fähigkeit gefiltert werden, die physiologisch relevante Anheftung zu hemmen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von antiinfektiösen Wirkstoffkandidaten, die auf Endotheladhäsionswege abzielen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur primärer endothelialer Zellen und in mikrofluidischen Flusssystemen.
- Benötigt eine Fluoreszenzmikroskopie mit Z-Stapel-Funktion und geeigneten Filtern für die Detektion von RFP und FITC.
- Setzt standardisierte Protokolle zur Histaminstimulation und Antikörperfärbung voraus, um eine konsistente Erzeugung von VWF-Strängen zu gewährleisten.
- Erfordert die Optimierung von Bakterieninokulum und Flussraten, um physiologische Relevanz und reproduzierbare Anheftung sicherzustellen.
- Auf Pathogene oder Liganden beschränkt, die unter Flussbedingungen mit VWF oder ähnlichen endothelialen Substraten interagieren.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026