Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Beginnen Sie mit einer Suspension eines abgeschwächten Stammes eines pathogenen Bakteriums.

Der abgeschwächte Stamm weist eine verminderte Pathogenität aufgrund gezielter Deletionen in Virulenzgenen auf.

Die Bakterien sind chromosomal mit einem biolumineszierenden Operon markiert, das eine autonome Lichtproduktion ermöglicht.

Die Bakterien exprimieren das biolumineszierende Operon und produzieren ein Luciferase-Enzym und einen Enzymkomplex, der das Luciferase-Substrat synthetisiert.

Luciferase oxidiert das Substrat, um sichtbares Licht zu erzeugen.

Die Suspension wird zentrifugiert und der Überstand wird verworfen.

Waschen Sie die Zellen mit einem Puffer, zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand, um die verbleibenden nicht-zellulären Bestandteile zu entfernen.

Suspendieren Sie die Zellen im Puffer, um eine optimale Bakterienkonzentration zu erreichen, und ziehen Sie die Suspension in eine Spritze.

Injizieren Sie die Suspension intraperitoneal in eine Maus und überführen Sie sie dann in einen Käfig.

Visualisieren Sie das Biolumineszenzsignal in regelmäßigen Abständen.

Der abgeschwächte Stamm bleibt lokalisiert, und die Biolumineszenz nimmt allmählich ab, was auf eine Abklingen der Infektion hinweist.

Tauen Sie am Morgen der Injektionen die Kryofläschchen der Bakterienzellen drei bis vier Stunden lang bei vier Grad Celsius auf. Bewahren Sie die Fläschchen nach dem Auftauen auf Eis auf und injizieren Sie die Mäuse innerhalb von zwei Stunden. Übertragen Sie den Inhalt jedes Kryofläschchens in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 4.500 mal G.

Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet wieder in einem Milliliter PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und suspendieren Sie die Zellen in PBS erneut auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 bis zur neunten koloniebildenden Einheit pro Milliliter. Entnehmen Sie drei Proben aus der endgültigen Suspension jedes Stammes, um Konzentration, Genotyp und Phänotyp zu validieren.

Für jeden Stamm aliquotieren Sie 1,5 Milliliter der Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und bereiten das PBS für Kontrollinjektionen vor. Sammeln Sie die Mäuse und Materialien, die für die Injektion benötigt werden, in einem sterilen Operationssaal für Tiere und wischen Sie alle Oberflächen mit Desinfektionstüchern ab, bevor Sie beginnen. Tragen Sie zwei Paar Latexhandschuhe, um das Risiko einer Punktion zu begrenzen, wenn Sie gebissen werden, sowie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und eine Gesichtsmaske.

Nehmen Sie die Maus aus dem Käfig und wiegen Sie sie, wobei Sie den Schwanz mit einem Permanentmarker für die Nachverfolgung nach der Injektion markieren. Öffnen Sie eine neue Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel und ziehen Sie 200 Mikroliter steriles PBS auf. Fassen Sie die Maus mit Daumen und Zeigefinger hinter die Ohren und kneifen Sie, um eine Hautfalte im Nacken zu erzeugen.

Befestigen Sie dann den Schwanz mit dem kleinen Finger in der Handfläche, um die Maus flach und unbeweglich zu halten. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 30 Grad in die Bauchhöhle links oder rechts der Mittellinie ein. Heben Sie die Nadel leicht an, um sicherzustellen, dass sie nicht in Organe eingeführt wurde.

Injizieren Sie dann langsam das PBS und ziehen Sie die Nadel zurück. Typisch ist ein Bolus an der Injektionsstelle. Legen Sie die Nadel in den dafür vorgesehenen Entsorgungsbehälter für scharfe Gegenstände und bewegen Sie die Maus in einen separaten Käfig.

Wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Maus und nachdem alle Mäuse aus einem Käfig injiziert wurden, bringen Sie sie zurück in ihren ursprünglichen Käfig. Nach der Injektion der Kontrollgruppe injizieren Sie die Testgruppen auf die gleiche Weise. Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, bringen Sie die Mäuse zurück in den Haltungsraum und reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionstüchern.

Stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1,5 Liter pro Minute und den Isofluran auf 3,5 % ein und bewegen Sie die Maus in die Anästhesiekammer, dann in die temperaturstabilisierte Stufe nach der Anästhesie. Positionieren Sie die Maus mit ausgestreckten Armen auf dem Rücken und setzen Sie einen Nasenkegel für die Verabreichung von 2,5 % Isofluran während der Bildgebung ein.

Schließen Sie die Tür und machen Sie biolumineszierende Bilder und Röntgenaufnahmen der Maus. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig ein, und überwachen Sie sie. Er sollte innerhalb von drei bis fünf Minuten wieder zu Bewusstsein kommen.