Aufbereitung von E. coli Sphäroplasten

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Mikrobiologie

0 Ansichten • 4:30 Min. • September 26th, 2025

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Nehmen Sie eine E. coli-Kultur .

Verdünnen Sie die Kultur in frischen Medien und inkubieren Sie sie, um die bakterielle Teilung zu fördern.

Als nächstes wird die Kultur in Medien verdünnt, die einen bakteriellen Teilungshemmer enthalten, und inkubiert.

Die Bakterien wachsen weiter, ohne sich zu teilen, und bilden längliche Filamente.

Übertragen Sie die Kultur in ein frisches Röhrchen, zentrifugieren Sie dann, um die Filamente zu pelletieren und den Überstand zu entfernen.

Waschen Sie das Pellet mit einem osmotischen Stabilisator, um eine Sphäroplastenlyse zu verhindern. Entfernen Sie die Lösung.

Fügen Sie nacheinander Puffer, Lysozym, DNase und einen Chelatbildner hinzu. Ausbrüten.

Der Chelatbildner destabilisiert die äußere Membran des Filaments.

Lysozym baut die freiliegende Peptidoglycanschicht ab, wodurch die Filamente ihre Form verlieren und kugelförmige Strukturen bilden, die als Sphäroplasten bezeichnet werden.

Darüber hinaus baut DNase kontaminierende DNA ab, die aus beschädigten Filamenten freigesetzt wird.

Den osmotischen Stabilisator erneut hinzufügen, mischen und inkubieren.

Die Suspension in ein Röhrchen mit Puffer und Zentrifuge überführen.

Entfernen Sie überschüssigen Überstand und resuspendieren Sie die Sphäroplasten in einem Puffer für die nachgelagerte Analyse.

Um eine Übernachtkultur einzurichten, verwenden Sie eine sterile Mikropipettenspitze, um eine einzelne Bakterienkolonie von einer festen Agarkulturplatte in ein 14-Milliliter-Kulturröhrchen zu übertragen, das zwei bis drei Milliliter dreiprozentige Tryptikase-Sojabrühe, TSB, für eine 16- bis 21-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schütteln enthält. Zur Herstellung von gramnegativen E. coli-Sphäroplasten verdünnen Sie die Übernachtkultur im Verhältnis eins zu 100 und 25 Milliliter TSB in einem 250-Milliliter-Kolben und bringen Sie die Bakterien für weitere 2,5 Stunden in den Schüttinkubator zurück. Wenn die Lösung eine optische Dichte von 0,5 bis 0,8 bei 600 Nanometern erreicht hat, wird die Kultur in einem Verhältnis von eins zu zehn in frischem TSB in einem neuen 250-Milliliter-Kolben für eine zweite 2,5-stündige Inkubation mit einer wirksamen Endkonzentration von 60 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin verdünnt.

Zur Herstellung von einzelligen Filamenten von etwa 50 bis 150 Mikrometern Länge, wie sie unter einem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung sichtbar gemacht werden. Zentrifugieren Sie die bakterielle Lösung, um die Filamente zu ernten, und dekantieren Sie den Überstand. Waschen Sie die Filamente unter vorsichtiger Zugabe von einem Milliliter 0,8 molaren Saccharose und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Nach einer Minute wird der Überstand verworfen, ohne das Pellet zu stören, und die angegebenen Reagenzien in der entsprechenden Reihenfolge zu den Filamenten gegeben. Nach zehn Minuten bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von einer Minute nach und nach einen Milliliter Lösung A hinzufügen, dabei die Lösung vorsichtig von Hand schwenken. Inkubieren Sie die Lösung vier Minuten lang bei Raumtemperatur und teilen Sie dann die Filamentsuspension in zwei gleiche Aliquote zwischen zwei konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf, die sieben Milliliter Lösung B enthalten. Als nächstes pelletieren Sie die Filamente durch Zentrifugation und verwenden Sie eine serologische Pipette, um vorsichtig alle bis auf ein bis zwei Milliliter des Überstands zu entfernen, ohne die Pellets zu stören.

Verwenden Sie eine p1000-Mikropipette, um die Pellets vorsichtig wieder zu suspendieren. Überprüfen Sie ein kleines Aliquot der Probe lichtmikroskopisch auf Sphäroplastenbildung. Die Sphäroplasten können dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden oder bis sie drei Frost-Tau-Zyklen durchlaufen haben.

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Zuletzt aktualisiert: 15 August 2026