Screening von Inhibitoren der bakteriellen membrangebundenen Pyrophosphatase mit einem kolorimetrischen Assay

Die bakterielle membrangebundene Pyrophosphatase (mPPase) hydrolysiert Pyrophosphat zu Orthophosphat, während Natriumionen durch die Membran gepumpt werden.

Um die inhibitorische Wirkung gegen mPPasen zu bewerten, fügen Sie den Tubenstreifen steigende Konzentrationen von Phosphatstandards hinzu.

Geben Sie Testverbindungen, die die mPPase hemmen können, in die Röhrchen, wobei Sie Wasser als Kontrolle haben.

In Liposomen eingebettete mPPasen, die vom thermophilen Bakterium Thermotoga maritima abgeleitet sind, werden in alle Röhrchen mit Ausnahme der Standards gegeben.

Versiegeln und bei der optimalen Temperatur inkubieren, um das Enzym zu aktivieren.

Fügen Sie Natriumpyrophosphat hinzu, um die Reaktion zu initiieren und Orthophosphat freizusetzen.

Übertragen Sie die Röhrchen auf eine Kühlplattform, um die Reaktion zu stoppen, und zentrifugieren Sie, um Kondenswasser zu entfernen.

Fügen Sie das Molybdat-Ascorbat-Reagenz hinzu, um mit Orthophosphat zu reagieren und Phosphomolybdsäure zu bilden.

Fügen Sie die Arsenit-Citrat-Lösung hinzu, um die Säure zu reduzieren und einen stabilen blauen Komplex zu bilden.

Den Inhalt auf eine Multiwell-Platte umfüllen und die Absorption messen.

Eine geringere A