Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Krebsinvasion und -progression beinhalten ein modales Zellphänotyp, das durch Wachstumsfaktoren, Zytokine und Komponenten der extrazellulären Matrix im Tumormikromilieu komplex reguliert wird. Hyaluronsäure oder HA ist eine stromale Komponente der extrazellulären Matrix, die bekanntermaßen die Tumorprogression fördert, indem sie Invasion, Wachstum und Angiogenese durch die Interaktion von HA mit ihrem Zelloberflächenrezeptor verstärkt. CD44 induziert Signalkaskaden, die das Tumorzellwachstum, Überleben und die Migration fördern und dadurch die metastatische Ausbreitung erhöhen, um die Adhäsion, Migration und das Wachstum von Krebszellen auf exogenem HA zu untersuchen.

Mittels Standard-Photolithographie wird ein mikrostrukturiertes elastomerisches Stempel hergestellt, das anschließend verwendet wird, um ein strukturiertes Array von Aminoselin-Molekülen auf Glasuntergründen zu erzeugen. Danach wird eine Karbodiimid-Chemie durchgeführt, um HA kovalent an die mikrostrukturierten Aminoseline zu binden. Auf diese Weise entstehen Mikrostrukturen aus HA, auf die kultivierte Krebszellen anschließend aufgebracht werden können. Die Wechselwirkungen von Krebszellen mit exogenem Hyaluronsäure können dann mittels Lichtmikroskopie, hochauflösenden Bildgebungsverfahren wie der Rasterelektronenmikroskopie oder der immunfluoreszenten Mikroskopie sichtbar gemacht werden.

Die in diesem Videoartikel vorgestellte Methode zur Herstellung mikrostrukturierter HA-Oberflächen kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise die Rolle von exogenem Hyaluronsäure bei der Krebsprogression weiter aufzuklären. Um einen mikrostrukturierten Polymethylmethacrylat- oder PDMS-Stempel herzustellen, der zum Aufbringen von HA auf Glasobjektträger verwendet wird, heben Sie zunächst mit einer Pinzette eine neue Siliziumscheibe auf.

Dann über ein Laborwaschbecken. Spülen Sie die Wafer mit Ethanol aus der Waschflasche ab und trocknen Sie sie mit einem Luftstrom. Schalten Sie das Raumlicht aus.

Danach mit einer Pinzette das Wafer mithilfe einer Pipettenspitzenabdeckung auf einen Spin-Beschichter übertragen und mindestens 80 % der Waferoberfläche mit dem negativen Fotolack SU-2025 beschichten, indem 10 Sekunden bei 600 U/min spinbeschichtet wird. Anschließend 30 Sekunden bei 3000 U/min weiterbeschichten, das mit Fotolack beschichtete Wafer auf eine Heizplatte übertragen und bei 95 Grad Celsius für drei Minuten vorbaken. Danach von der Heizplatte entfernen und eine Minute abkühlen lassen.

Platzieren Sie eine vorgefertigte Maske mit dem gewünschten Muster auf der mit Photoresist beschichteten Wafer-Oberfläche und bestrahlen Sie diese 20 Sekunden lang mit UV-Licht. Danach übertragen Sie den Wafer auf eine Heizplatte und härten ihn bei 110 Grad Celsius sechs Minuten lang aus.

Schalten Sie die Beleuchtung ein und nehmen Sie das Wafer von der Heizplatte. An diesem Punkt sollten deutliche Muster mit einer Transferpipette sichtbar sein. Spülen Sie das Wafer vorsichtig mit SU eight Photoresistentwickler, nachdem Sie es dreimal mit Entwicklerlösung gespült haben, mit Ethanol nach.

Wenn ein weißer Rückstand vorhanden ist, wiederholen Sie die Spülung mit Photoresist-Entwicklerlösung oder tauchen Sie die Wafer einfach zwei Minuten lang in die Entwicklerlösung ein, spülen Sie erneut mit Ethanol, waschen Sie mit Wasser und trocknen Sie mit einem Luftstrom in einem großen Wellschiff. Mischen Sie die PDMS-Elastomerlösung und den Härter im Gewichtsverhältnis 10 zu 1; für die hier gezeigte Wafer ist eine Menge von 22 Gramm ausreichend. Geben Sie die Mischung in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 900 U/min.

Um Luftblasen zu entfernen, legen Sie den strukturierten Wafer in eine passende Petrischale. Geben Sie so viel PDMS-Lösung darauf, dass der Wafer vollständig mit einer Dicke von etwa einem Viertel Zoll bedeckt ist. Falls sich noch Blasen auf der Oberfläche des Wafers befinden, stellen Sie ihn in einen Vakuum-Exsikkator, bis die Blasen verschwunden sind.

Übernacht bei Raumtemperatur aushärten lassen, um einen komplementären elastomeren Stempel zu bilden. Falls das PDMS nach 12 Stunden nicht vollständig ausgehärtet ist, das Wafer 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius im Ofen platzieren. Das PDMS vorsichtig vom Wafer entfernen.

Verwenden Sie anschließend ein Rasiermesser, um den Stempel auf die gewünschte Größe zuzuschneiden. Legen Sie den Stempel in ein Glas mit Ethanol, vorzugsweise in einem Kunststoffhalter, und behandeln Sie ihn 15 Minuten lang mit Ultraschall. Die Wafer können mehrfach verwendet werden, um neue elastomere Stempel herzustellen, mit denen ha in definierten Bereichen kovalent an Glasoberflächen immobilisiert werden kann.

Reinigen Sie zunächst alle zu verwendenden Objektträger in einem Plasma-Reinigungsgerät gemäß den Anweisungen im beigefügten Text. Nach der Reinigung der Glasobjektträger nehmen Sie diese mit einer Pinzette aus dem Plasma-Reinigungsgerät. Legen Sie die Objektträger in eine Kunststoff-Petri-Schale und stellen Sie sie für die spätere Verwendung beiseite.

Bereiten Sie anschließend die Amino-Clin-Lösung vor, die auf den Objektträger aufgebracht wird, um HA zu binden, und verwenden Sie dazu ein 15-Milliliter-Polystyrol-Zentrifugenröhrchen. Bereiten Sie eine frische 3 %ige (Volumen pro Volumen) Lösung von drei Amino-Propyl-Trimethoxy-Clin oder A-P-T-M-S in 95 % (Volumen pro Volumen) Ethanol mit einem Gesamtvolumen von fünf Millilitern vor und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren.

Während dieses Zeitraums wird A-P-T-M-S durch Hydrolyse in ein Ciol umgewandelt. Berühren Sie anschließend unter Ausschließlichkeit der Seiten das Muster des PDMS-Stempels und platzieren Sie es auf einem Spin-Coder-Chuck. Decken Sie die Musteroberfläche mit einem Transferpipettierer mit A-P-T-M-S ab.

Anschließend beschichten Sie die Oberfläche des Stempels durch Auftragen von A-P-T-M-S im Schleuderbeschichtungsverfahren bei 3.500 U/min für 30 Sekunden. Nach dem Entfernen des PDMS-Stempels aus dem Schleuderbeschichter drehen Sie ihn um, sodass die strukturierte Seite nach unten zeigt, platzieren Sie ein Ende des PDMS-Stempels in der Mitte des Objektträgers und drücken Sie vorsichtig darauf, bis der gesamte Stempel für eine Minute mit dem Objektträger in Kontakt steht. Danach entfernen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig und lassen Sie den mit A-P-T-M-S strukturierten Objektträger bei Raumtemperatur stehen.

Nach 30 Minuten die strukturierte Oberfläche mit Ethanol spülen und mit einem Luftstrom trocknen. Das PDMS-Stempel 15 Minuten lang beschallen, um überschüssiges A-P-T-M-S zu entfernen. Anschließend die Objektträger eine Stunde lang bei 115 Grad Celsius auf eine Heizplatte stellen, um die Oberflächen zu erwärmen und überschüssiges Wasser zu entfernen.

Mit Ethanol spülen und mit Luft unter Verwendung von Pinzette trocknen. Die Strukturplatte auf eine Glas-Petrischale übertragen. Mit einer Transferpipette die Glasplatte vollständig mit einer frisch zubereiteten Polyethylenglykol- oder PEG-Cline-Lösung bedecken, die als nicht-adsorptive Region um die Strukturen dient.

Nach einer 45-minütigen Inkubation bei 75 Grad Celsius die überschüssige PEG-Salzlösung abgießen. Anschließend, während man die Objektträger mit einer Pinzette hält, die Oberfläche der strukturierten Objektträger zuerst mit Toluol und dann erneut mit Wasser spülen und mit einem Luftstrom trocknen. Die Objektträger in eine befeuchtete Objektträgerbox stellen.

Stellen Sie die Box dann in einen biologischen Sicherheitswerkbank und schalten Sie die UV-Lampe für eine Stunde ein, um eine keimtötende Bestrahlung durchzuführen. Arbeiten Sie von diesem Punkt an in der biologischen Sicherheitswerkbank weiter. Um die Sterilität außerhalb der Haube aufrechtzuerhalten, bereiten Sie eine wässrige sterile HA-Lösung mit einem Volumen von einem Milliliter und einer Konzentration von 10 Millimolar vor.

Ein Ethyl-3,3-dimethylaminopropyl-carbodiimid oder EDC, 5 Millimolar, und Hydroxy-CIN-Aid und 50 Mikrogramm pro Milliliter. Steriles, mit Fluorescein markiertes HA, EDC ist ein vernetzender Reagenz der Länge null, das mit den Carboxylgruppen von HA reagiert, um aminreaktive Intermediate zu bilden. Da dieses Intermediat einer Hydrolyse unterliegt, wird NHS hinzugefügt, um die Effizienz der Carbodiimidreaktion zu erhöhen.

Als Nächstes 200 Mikroliter Aliquots steriler HA-Lösung auf das strukturierte Glas auftragen, bis der strukturierte Bereich bedeckt ist. Danach die Objektträgerbox schließen, um die Präparate vor Licht zu schützen. Die strukturierten Substrate sollten 16 bis 24 Stunden ungestört unter der Haube belassen werden, während die HA-Lösung mit dem mikrostrukturierten A-P-T-M-S-A reagiert und eine stabile MI-Bindung zwischen dem HA-Zwischenprodukt und der primären Aminogruppe von A-P-T-M-S ausbildet.

Am nächsten Tag die HA-Lösung mit einer APA-Tropfpipette absaugen. Die Objektträger mit PBS waschen und dann die Oberfläche eine Stunde lang mit 1 % BSA in PBS bedecken. Die Oberfläche ist nun bereit für die Zellkultur.

Platzieren Sie HA-Mikromusteroberflächen in einer sterilen Petrischale, um auf HA-Mikromusteroberflächen zu kultivieren. Säen Sie Einzelzell-Suspensionen von Krebszellen mit Dichten zwischen 0,4 und einer Million Krebszellen pro 18,75 cm² Glasoberfläche in einem Milliliter Zellmedium aus, um die Oberfläche der Glasobjektträger abzudecken. Platzieren Sie die Zellen vorsichtig in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Achten Sie darauf, dass das Medium nicht überläuft. Die Zelladhäsion sollte innerhalb von 24 Stunden erfolgen und kann mithilfe eines invertierten Lichtmikroskops beobachtet werden.

Die Zellkulturoberflächen können bis zu fünf Tage lang aufrechterhalten werden. Unter Standardbedingungen des Inkubators sollte das Medium jeden zweiten Tag gewechselt werden. Die Zellmorphologie und das Zellwachstum können mithilfe eines invertierten Lichtmikroskops beobachtet werden.

Anschließend können zusätzliche zelluläre Assays angewendet werden, um die Reaktionen auf die HA-Oberfläche im hier gezeigten Beispiel zu analysieren. HA-Muster-Oberfläche, visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskop und Bild. J-Analyse der Fluoreszenzintensität zeigt die Demobilisierung des HA-Musters.

Die HA-Mikromusteroberflächen ermöglichen die Untersuchung der Wechselwirkungen von Krebszellen mit exogenem HA. Hier wird die Adhäsion von Krebszellen auf HA-Mikromusteroberflächen gezeigt. Sowohl Kolon- als auch Brustkarzinomzellen hefteten sich nach 24-stündiger Kultivierung bevorzugt an HA-Flecken an. Mithilfe hochauflösender Bildgebung durch Rasterelektronenmikroskopie können die Wechselwirkungen kultivierter Zellen mit immobilisierten HA-Oberflächen analysiert werden.

In diesem Rasterelektronenmikrograf ist die Wechselwirkung von Darmkrebszellen mit HA zu erkennen, wobei eine höhere Vergrößerung rechts dargestellt ist. Hier sind Brustkrebszellen gezeigt, die auf HA-Oberflächen kultiviert wurden, erneut mit einer höheren Vergrößerung rechts. Diese Analyse demonstriert eindeutig das Vorhandensein adhäsiver Fortsätze, die die Ausbreitung von Krebszellen auf HA-Mikromustern fördern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man HA-Mikromusteroberflächen herstellt und sie zur Untersuchung der Reaktion von Krebszellen anwendet.