Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Krebsinvasion und -progression beinhalten ein modales Zellphänotyp, das durch Wachstumsfaktoren, Zytokine und extrazelluläre Matrixkomponenten im Tumormikromilieu komplex reguliert wird. Hyaluronsäure oder HA ist eine stromale extrazelluläre Matrixkomponente, die bekanntermaßen die Tumorprogression fördert, indem sie Invasion, Wachstum und Angiogenese durch die Interaktion von HA mit ihrem Zelloberflächenrezeptor verstärkt. CD44 induziert Signalkaskaden, die das Tumorzellwachstum, Überleben und die Migration fördern und dadurch die metastatische Ausbreitung erhöhen, um die Adhäsion, Migration und das Wachstum von Krebszellen auf exogenem HA zu untersuchen.

Mittels Standard-Photolithographie wird ein mikrostrukturiertes elastomerisches Stempel hergestellt, das anschließend verwendet wird, um ein strukturiertes Array von Aminoselin-Molekülen auf Glasuntergründen zu erzeugen. Danach wird eine Karbodiimid-Chemie durchgeführt, um HA kovalent an die mikrostrukturierten Aminoseline zu binden. Auf diese Weise entstehen Mikrostrukturen aus HA, auf die kultivierte Krebszellen anschließend ausgesät werden können. Die Wechselwirkungen von Krebszellen mit exogenem Hyaluronsäure können dann mittels Lichtmikroskopie, hochauflösenden Abbildungstechniken wie der Rasterelektronenmikroskopie oder der immunfluoreszenten Mikroskopie sichtbar gemacht werden.

Die in diesem Videoartikel vorgestellte Methode zur Herstellung mikrostrukturierter HA-Oberflächen kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsforschung zu beantworten, beispielsweise die Rolle von exogenem Hyaluronsäure bei der Krebsprogression weiter aufzuklären. Um einen mikrostrukturierten Polymethylmethacrylat- oder PDMS-Stempel herzustellen, der zum Aufbringen von HA auf Objektträger verwendet wird, heben Sie zunächst mit einer Pinzette eine neue Siliziumscheibe auf.

Dann über ein Laborwaschbecken. Spülen Sie die Wafer mit Ethanol aus der Spülfalsche ab und trocknen Sie sie mit einem Luftstrom. Schalten Sie das Raumlicht aus.

Danach mit einer Pinzette die Wafer mit einer Transferpipette auf einen Spin-Beschichter übertragen und mindestens 80 % der Waferoberfläche mit dem negativen Fotolack SU 2025 beschichten, indem 10 Sekunden bei 600 U/min spinbeschichtet wird. Anschließend 30 Sekunden bei 3000 U/min. Den mit Fotolack beschichteten Wafer danach auf eine Heizplatte übertragen und bei 95 Grad Celsius für drei Minuten vorbrennen. Danach von der Heizplatte entfernen und eine Minute abkühlen lassen.

Platzieren Sie eine vorgefertigte Maske mit dem gewünschten Muster auf der mit Photoresist beschichteten Wafer-Oberfläche und bestrahlen Sie diese 20 Sekunden lang mit UV-Licht. Danach übertragen Sie den Wafer auf eine Heizplatte und härten ihn bei 110 Grad Celsius für sechs Minuten aus.

Schalten Sie die Lichter ein und nehmen Sie das Wafer von der Heizplatte. Zu diesem Zeitpunkt sollten deutliche Muster mit einer Transferpipette sichtbar sein. Spülen Sie das Wafer vorsichtig mit SU-acht-Fotolackentwickler, nachdem Sie es dreimal mit Entwicklerlösung gespült haben, anschließend mit Ethanol.

Wenn ein weißer Rückstand vorhanden ist, wiederholen Sie die Spülung mit Photoresist-Entwicklerlösung oder tauchen Sie die Wafer einfach zwei Minuten lang in die Entwicklerlösung ein, spülen Sie erneut mit Ethanol, waschen Sie mit Wasser und trocknen Sie mit einem Luftstrom in einem großen Wellschiff. Gemischte PDMS-Elastomerlösung und Härter im Gewichtsverhältnis 10 zu 1; für die hier gezeigte Wafer sind 22 Gramm ausreichend. In ein Zentrifugenröhrchen geben und fünf Minuten bei 900 U/min zentrifugieren.

Um Luftblasen zu entfernen, legen Sie den strukturierten Wafer in eine passende Petrischale. Geben Sie so viel PDMS-Lösung darauf, dass der Wafer vollständig mit einer Dicke von etwa einem Viertel Zoll bedeckt ist. Falls sich Blasen auf der Oberfläche des Wafers befinden, stellen Sie ihn in einen Vakuum-Exsikkator, bis die Blasen verschwunden sind.

Übernacht bei Raumtemperatur aushärten lassen, um einen komplementären elastomeren Stempel zu bilden. Falls das PDMS nach 12 Stunden nicht vollständig ausgehärtet ist, das Wafer 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius im Ofen aushärten lassen. Das PDMS vorsichtig vom Wafer entfernen.

Verwenden Sie anschließend ein Rasiermesser, um den Stempel auf die gewünschte Größe zuzuschneiden. Legen Sie den Stempel in ein Glas mit Ethanol, vorzugsweise in einem Kunststoffhalter, und behandeln Sie ihn 15 Minuten lang mit Ultraschall. Die Wafer können mehrfach verwendet werden, um neue elastomere Stempel herzustellen, mit denen ha in definierten Bereichen kovalent an Glasoberflächen immobilisiert werden kann.

Reinigen Sie zunächst alle zu verwendenden Objektträger in einem Plasma-Reinigungsgerät gemäß den Anweisungen im beigefügten Text. Nachdem die Glasobjektträger gereinigt wurden, nehmen Sie sie mit einer Pinzette aus dem Plasma-Reinigungsgerät. Legen Sie die Objektträger in eine Kunststoff-Petrischale und stellen Sie sie für die spätere Verwendung beiseite.

Bereiten Sie anschließend die Amino-Clin-Lösung vor, die auf den Objektträger aufgebracht wird, um HA zu binden, und verwenden Sie dazu ein 15-Milliliter-Polystyrol-Zentrifugenröhrchen. Stellen Sie eine frische 3 %ige (Volumen pro Volumen) Lösung von drei Amino-Propyl-Trimethoxy-Clin oder A-P-T-M-S in 95 % (Volumen pro Volumen) Ethanol mit einem Gesamtvolumen von fünf Millilitern her und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren.

Während dieses Zeitraums wird A-P-T-M-S durch Hydrolyse in ein Ciol umgewandelt. Legen Sie als Nächstes das PDMS-Stempelmuster vorsichtig an den Seiten an einem Spin-Coder-Chuck ab. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die Musterfläche mit A-P-T-M-S zu bedecken.

Anschließend beschichten Sie die Oberfläche des Stempels durch Auftragen von A-P-T-M-S im Schleuderbeschichtungsverfahren bei 3.500 U/min für 30 Sekunden. Nach dem Entfernen des PDMS-Stempels aus dem Schleuderbeschichter drehen Sie ihn um, sodass die strukturierte Seite nach unten zeigt, platzieren Sie ein Ende des PDMS-Stempels in der Mitte des Objektträgers und drücken Sie vorsichtig darauf, damit der gesamte Stempel für eine Minute mit dem Objektträger in Kontakt steht. Danach entfernen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig und lassen Sie den mit A-P-T-M-S strukturierten Objektträger bei Raumtemperatur stehen.

Nach 30 Minuten die strukturierte Oberfläche mit Ethanol abspülen und mit einem Luftstrom trocknen. Das PDMS-Stempel 15 Minuten lang beschallen, um überschüssiges A-P-T-M-S zu entfernen. Anschließend die Objektträger eine Stunde lang bei 115 Grad Celsius auf eine Heizplatte stellen, um die Oberflächen zu erwärmen und überschüssiges Wasser zu entfernen.

Spülen Sie mit Ethanol und trocknen Sie mit Luft unter Verwendung einer Pinzette. Übertragen Sie den Strichlaserschlitten in eine Glaspetrischale. Verwenden Sie eine Transferpipette, um den Objektträger vollständig mit einer frisch zubereiteten Polyethylenglykol- oder PEG-Cline-Lösung zu bedecken, die als nicht-adsorptive Region um die Muster dient.

Nach einer 45-minütigen Inkubation bei 75 Grad Celsius die überschüssige PEG-Salzlösung abgießen. Anschließend, während die Objektträger mit einer Pinzette gehalten werden, die Oberfläche der strukturierten Objektträger mit Toluol spülen und danach erneut mit Wasser, anschließend mit einem Luftstrom trocknen. Die Objektträger in eine befeuchtete Objektträgerbox stellen.

Stellen Sie die Box dann in einen biologischen Sicherheitswerkbank und schalten Sie die UV-Lampe für eine Stunde ein, um eine keimtötende Bestrahlung durchzuführen. Arbeiten Sie ab diesem Zeitpunkt in der biologischen Sicherheitswerkbank weiter. Um die Sterilität außerhalb der Haube aufrechtzuerhalten, bereiten Sie eine wässrige sterile HA-Lösung von einem Milliliter mit einer Konzentration von 10 Millimolar vor.

Ein Ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiimid oder EDC, 5 Millimolar, und Hydroxy-CIN-Aid und 50 Mikrogramm pro Milliliter. Steriles, mit Fluorescein markiertes HA-EDC ist ein vernetzender Agent mit „Null-Länge“, der mit den Carboxylgruppen von HA reagiert, um aminreaktive Intermediate zu bilden. Da dieses Intermediat anfällig für Hydrolyse ist, wird NHS hinzugefügt, um die Effizienz der Carbodiimid-Reaktion zu erhöhen.

Als Nächstes 200 Mikroliter Aliquots steriler HA-Lösung auf das strukturierte Glas auftragen, bis der strukturierte Bereich bedeckt ist. Danach die Objektträgerbox schließen, um die Präparate vor Licht zu schützen. Die strukturierten Substrate sollten 16 bis 24 Stunden ungestört unter dem Abzug belassen werden, während die HA-Lösung mit dem mikrostrukturierten A-P-T-M-S-A reagiert und eine stabile MI-Bindung zwischen dem HA-Zwischenprodukt und der primären Aminogruppe von A-P-T-M-S ausbildet.

Am nächsten Tag die HA-Lösung mit einer APA-Tropfpipette absaugen. Die Objektträger mit PBS waschen und dann die Oberfläche eine Stunde lang mit 1 % BSA in PBS bedecken. Die Oberfläche ist nun bereit für die Zellkultur.

Platzieren Sie HA-Mikromusteroberflächen in einer sterilen Petrischale, um auf HA-Mikromusteroberflächen zu kultivieren. Säen Sie Einzelzell-Suspensionen von Krebszellen mit Dichten zwischen 0,4 und einer Million Krebszellen pro 18,75 cm² Glasoberfläche in einem Milliliter Zellmedium aus, um die Oberfläche der Glasobjektträger abzudecken. Platzieren Sie die Zellen vorsichtig in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. Achten Sie darauf, dass das Medium nicht überläuft. Die Zelladhäsion sollte innerhalb von 24 Stunden erfolgen und kann mithilfe eines invertierten Lichtmikroskops beobachtet werden.

Zellkulturoberflächen können bis zu fünf Tage lang aufrechterhalten werden. Unter Standardbedingungen des Inkubators sollte das Medium jeden zweiten Tag gewechselt werden. Morphologie und Wachstum der Zellen können mithilfe eines invertierten Lichtmikroskops beobachtet werden.

Zusätzliche zelluläre Assays können anschließend angewendet werden, um die Reaktionen auf die HA-Oberfläche im hier gezeigten Beispiel zu analysieren. HA-Muster-Oberfläche, visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskop und Bild. J-Analyse der Fluoreszenzintensität zeigt die Demobilisierung des HA-Musters.

Die HA-Mikromusteroberflächen ermöglichen die Untersuchung der Wechselwirkungen von Krebszellen mit exogenem HA. Hier wird die Adhäsion von Krebszellen auf HA-Mikromusteroberflächen gezeigt. Sowohl Kolon- als auch Brustkarzinomzellen hefteten sich nach 24-stündiger Kultivierung bevorzugt an HA-Flecken an. Mithilfe hochauflösender Bildgebung durch Rasterelektronenmikroskopie können die Wechselwirkungen kultivierter Zellen mit immobilisierten HA-Oberflächen analysiert werden.

In diesem Rasterelektronenmikrograf ist die Wechselwirkung von Darmkrebszellen mit HA zu erkennen, wobei eine höhere Vergrößerung rechts dargestellt ist. Hier sind Brustkrebszellen, die auf HA-Oberflächen kultiviert wurden, erneut gezeigt, wobei erneut eine höhere Vergrößerung rechts zu sehen ist. Diese Analyse demonstriert eindeutig das Vorhandensein adhäsiver Fortsätze, die die Ausbreitung von Krebszellen auf HA-Mikromustern fördern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man HA-Mikromusteroberflächen herstellt und anwendet, um die Reaktion von Krebszellen zu untersuchen.