Messung der Wirkstoffbindung an Caseum aus Tuberkulose-Läsionen mit der Rapid Equilibrium-Dialysemethode

Nehmen Sie eine homogene Suspension von Caseum - dem nekrotischen, lipidreichen Material aus Tuberkuloseläsionen, das in seinem Kern arzneimitteltolerante Mykobakterien beherbergt.

Geben Sie das Testmedikament in das Homogenat und den Wirbel, um seine Wechselwirkung mit der Caseum-Matrix zu erleichtern.

Setzen Sie einen Schnellgleichgewichtsdialyseeinsatz mit Spender- und Empfängerkammern, die durch eine semipermeable Membran getrennt sind, in die Basisplatte ein.

Laden Sie das mit dem Wirkstoff versetzte Homogenat in die Donorkammer und fügen Sie der Empfängerkammer Puffer hinzu.

Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie mit Rotation.

Während der Inkubation diffundiert das freie Medikament über die Membran und erreicht ein Gleichgewicht zwischen beiden Kammern.

Sobald das Gleichgewicht erreicht ist, verdünnen Sie die Spenderprobe mit Puffer und die Empfängerprobe mit arzneimittelfreiem Homogenat, um die Matrixbedingungen für die Arzneimittelquantifizierung zu normalisieren.

Quantifizieren Sie abschließend die Wirkstoffkonzentration und berechnen Sie die ungebundene Wirkstofffraktion oder fu.

Der Fu spiegelt das freie Medikament wider, das zur Verfügung steht, um in das Caseum zu diffundieren und arzneimitteltolerante Mykobakterien zu erreichen.

6,5 Mikroliter der vorbereiteten Testmasse werden zu 643,5 Mikrolitern des Homogenats gegeben. Um die Endkonzentration von fünf Mikromolaren und Wirbeln zu erreichen.

Setze dann die roten Einsätze in die Grundplatte ein. Bereiten Sie die Einsätze für jeden Test vor, jede Verbindung in dreifacher Ausfertigung.

Geben Sie 200 Mikroliter der mit Wirkstoffen dotierten Matrix in die rote Spenderkammer jedes roten Einsatzes. Geben Sie dann 350 Mikroliter PBS in jede Empfängerkammer.

Legen Sie ein Klebesiegel auf die Platte und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius auf dem Thermomischer bei 200 Umdrehungen pro Minute für vier Stunden. Mischen Sie nach der Inkubation den Inhalt der Spender- und Empfängerkammer vorsichtig, indem Sie zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 20 Mikroliter Homogenat aus jeder der Donorkammern auf 20 Mikroliter sauberes PBS in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

In ähnlicher Weise werden 20 Mikroliter Aliquots von PBS-Proben aus den Empfängerkammern auf 20 Mikroliter sauberes Homogenat übertragen.

Durch die Matrixanpassung sind zwei separate Farbsehkurven in Homogenat und PBS für die quantitative Analyse nicht mehr erforderlich. Der Inhalt der Spenderkammer kann sich im Laufe der Zeit sedimentieren. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Pipettieren, bevor Sie Aliquots entfernen.