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Beginnen Sie mit einer nährstoffreichen Agarplatte, die mit Thiosulfat ergänzt ist.
Streifen Sie die Cyanobakterien und inkubieren Sie unter abwechselnden Hell- und Dunkelperioden, um den zirkadianen Zyklus aufrechtzuerhalten.
Während der Lichtperiode unterstützen die Nährstoffaufnahme und Thiosulfat das Bakterienwachstum und die Kondensation der DNA.
In der Dunkelzeit sparen die Zellen Energie und teilen sich.
Der abwechselnde Hell-Dunkel-Zyklus synchronisiert die Zellen mit dem gleichen Wachstums- und Teilungsstadium.
Fügen Sie nach der Lichtperiode eine Saccharoselösung hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um Cyanobakterien freizusetzen, die eine Farbveränderung verursachen. Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen.
Fügen Sie einen DNA-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff hinzu und inkubieren Sie im Dunkeln. Der Farbstoff bindet an die DNA der Cyanobakterien.
Zentrifugieren, um die Cyanobakterien abzutrennen und den Überstand zu entfernen.
Suspendieren Sie die Cyanobakterien in Saccharoselösung, geben Sie die Suspension auf einen Objektträger und decken Sie ihn ab.
Unter dem Fluoreszenzmikroskop bestätigt die blau kondensierte DNA in Zellen den synchronisierten, zirkadian regulierten Verlauf des Cyanobakterien-Zellzyklus.
Beginnen Sie mit der Züchtung von Cyanobakterien auf neun Zentimeter großen, sterilisierten BG-11-Platten, die 1,5 % Agar und 0,3 % Natriumthiosulfat enthalten. Inkubieren Sie die Platten bei 23 Grad Celsius unter einem 12-12-Lichtzyklus mit 50 Mikro-E Licht pro Quadratmeter und Sekunde. Um die Zellen zu erhalten, übertragen Sie sie wöchentlich auf frische BG-11-Agarplatten.
Innerhalb einer Woche erscheinen die Kulturen als grüne Bänder. Übertragen Sie die grünen Zellklumpen mit einer flammensterilisierten Schlaufe und streichen Sie sie auf die neue Platte. Um die DNA-Verdichtung zu beobachten, sammeln Sie die kultivierten Zellen sechs Tage lang am Ende der Lichtperiode.
Um die Zellen von der Platte zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,2-molare Saccharose hinzu. Sammeln Sie dann die Zellsuspension und wiederholen Sie die Zugabe und Entfernung von Saccharose, bis die Lösung grün wird. Die Farbänderung zeigt an, dass die meisten Zellen freigegeben wurden.
Übertragen Sie nun 500 Mikroliter der suspendierten Zelllösung in ein Microfuge-Röhrchen und fügen Sie Hoechst-Färbung für eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Lassen Sie die Zellen dann 10 Minuten lang im Dunkeln inkubieren. Als nächstes schleudern Sie die Zellen herunter, verwerfen den Überstand und resuspendieren sie in 10 Mikrolitern 0,2-molaren Saccharose.
Übertragen Sie anschließend einen Mikroliter der Suspension auf einen Objektträger, legen Sie einen Deckschirm auf und beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem UV-Filter ausgestattet ist. Suchen Sie mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv nach Hinweisen auf eine DNA-Verdichtung, die in den meisten Zellen beobachtbar sein sollte.