Bewertung der bakteriellen Chaperonaktivität mittels thermischer Entfaltung eines Modellproteins

Beginnen Sie damit, eine Cuvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer einzusetzen, das mit einem temperaturkontrollierten Cuvettehalter und einem Rührer ausgestattet ist.

Fügen Sie vorgewärmten Puffer bei mäßig saurem pH-Wert hinzu und stellen Sie die Haltertemperatur so ein, dass Spannungsbedingungen simuliert werden.

In die Testprobe wird ein säureschützender Begleiter aus E. coli hinzugefügt.

In der Kontrollprobe wird ein gleiches Volumen des Puffers hinzugefügt.

Als Nächstes wird in beide Proben ein temperatur- und säureempfindliches Substratprotein eingeführt.

Beginnen Sie mit der Überwachung der Lichtstreuung.

Inkubieren Sie die Proben unter Stressbedingungen, um das Entfalten des Substrats zu induzieren.

Beim mäßig sauren pH-Wert wird das Chaperon aktiv und stabilisiert das ungefaltete Protein.

Fügen Sie eine pH-neutralisierende Salzlösung hinzu und nehmen Sie weiterhin die Lichtstreuung auf.

In der Kontrollprobe führt die Rückkehr zum neutralen pH-Wert dazu, dass das ungefaltete Protein aggregiert, was die Lichtstreuung erhöht.

In der Testprobe fördert der Begleiter das Umfalten des Substrats, was zur geringeren Lichtstreuung im Vergleich zur Kontrolle führt.

Vergleichen Sie die Lichtstreusignale, um die Begleittätigkeit zu bewerten.

Setzen Sie eine Quarz-Cuvette von einem Milliliter in ein Fluoreszenzspektrophotometer, das mit temperaturkontrollierten Probenhaltern und Rührern ausgestattet ist.

Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge auf 350 Nanometer ein. Fügen Sie die entsprechenden Volumina vorgewärmten Puffers D bei den gewünschten pH-Werten zur Cuvette hinzu. Das Gesamtvolumen beträgt 1.000 Mikroliter.

Stellen Sie die Temperatur im Cuvette-Halter auf 43 Grad Celsius ein. Fügen Sie dem Puffer 12,5 mikromolare HdeB hinzu, gefolgt von der Zugabe von 0,5 mikromolaren MDH. Beginnen Sie mit der Überwachung der Lichtstreuung.

Inkubieren Sie die Reaktion 360 Sekunden, um eine ausreichende Entfaltung des MDH zu ermöglichen. Erhöhen Sie den pH-Wert auf sieben, indem Sie ein Volumen von 0,16 bis 0,34 Molaren ungepuffertem Dikaliumphosphat hinzufügen und weitere 440 Sekunden die Lichtstreuung aufzeichnen. Analysieren Sie die Daten, wie sie im Textprotokoll beschrieben sind.