Bewertung der bakteriellen Chaperonaktivität mittels thermischer Entfaltung eines Modellproteins

Beginnen Sie damit, eine Cuvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer einzusetzen, das mit einem temperaturkontrollierten Cuvettehalter und einem Rührer ausgestattet ist.

Fügen Sie vorgewärmten Puffer bei mäßig saurem pH-Wert hinzu und stellen Sie die Haltertemperatur so ein, dass Spannungsbedingungen simuliert werden.

In die Testprobe wird ein säureschützender Begleiter aus E. coli hinzugefügt.

In der Kontrollprobe wird ein gleiches Volumen des Puffers hinzugefügt.

Als Nächstes wird in beide Proben ein temperatur- und säureempfindliches Substratprotein eingeführt.

Beginnen Sie mit der Überwachung der Lichtstreuung.

Inkubieren Sie die Proben unter Stressbedingungen, um das Entfalten des Substrats zu induzieren.

Beim mäßig sauren pH-Wert wird das Chaperon aktiv und stabilisiert das ungefaltete Protein.

Fügen Sie eine pH-neutralisierende Salzlösung hinzu und nehmen Sie weiterhin die Lichtstreuung auf.

In der Kontrollprobe führt die Rückkehr zum neutralen pH-Wert dazu, dass das ungefaltete Protein aggregiert, was die Lichtstreuung erhöht.

In der Testprobe fördert der Begleiter das Umfalten des Substrats, was zur geringeren Lichtstreuung im Vergleich zur Kontrolle führt.

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