JoVE-Enzyklopädie der Experimente
Mikrobiologie
0 Aufrufe • 2:23 Min. • November 28th, 2025
Beginnen Sie mit Staphylococcus aureus , die in einer Abschrecklösung mit Siliziumperlen suspendiert ist und bei niedriger Temperatur gelagert wird, um seinen Stoffwechselzustand zu erhalten.
Homogenisierung der Bakterien unter kalten Bedingungen, um intrazelluläre Inhalte freizusetzen und gleichzeitig den enzymatischen Abbau der Metaboliten zu minimieren.
Zentrifugieren Sie das Lysat und entnehmen Sie den metabolitreichen Supernatanten.
Fügen Sie dem Extrakt ein organisches Lösungsmittel hinzu und wirbeln, um Makromoleküle aus löslichen Metaboliten auszufällen.
Zentrifugieren, um den Niederschlag zu pelletieren und den Supernatant in Phiolen zu übertragen.
Laden Sie die Fläschchen in ein Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-System.
Innerhalb der Chromatographiesäule interagieren Metaboliten mit der festen stationären Phase basierend auf ihren chemischen Eigenschaften.
Fügen Sie einen Puffer hinzu, um die Metaboliten zu elutieren. Dann werden die Metaboliten in die Elektrospray-Ionisationsquelle des Massenspektrometers geleitet, um sie zu ionisieren.
Die Ionen werden dann anhand ihres Masse-Ladungs-Verhältnisses getrennt.
Die resultierenden Daten werden mit einer Referenzdatenbank verglichen, um die Metaboliten zu identifizieren.
Um mit der Metabolitenextraktion zu beginnen, tauen Sie die Proben zunächst auf Nasseis auf. Anschließend werden die Zellen in einem Homogenisator mit vier 30-Sekunden-Stößen bei 6000 U/min zerstört, mit zwei Minuten Abkühlzeit auf Trockeneis zwischen den Zyklen.
Klären Sie die Lysate 15 Minuten lang in einem vorgekühlten, gekühlten Mikrozentrifugenröhrchen mit maximaler Geschwindigkeit. Nach der Zentrifugation wird das Überstandsmittel in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr übertragen. Mit einer Mikropipette wird ein kleiner Teil der Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, um den im Textprotokoll beschriebenen Restpeptidgehalt zu quantifizieren.
Lagern Sie den Rest der Probe bei minus 80 Grad Celsius. Siehe das Textprotokoll zur Analyse der Metaboliten mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie.