Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Bei diesem Verfahren wird ein rekombinanter Impfstoff, der das SARS-CoV-RBD-Protein exprimiert, hergestellt und seine Fähigkeit zur Induktion neutralisierender Aktivität gegen ein SARS-Pseudovirus evaluiert. Zunächst wird das RBD-Protein aus dem Kulturüberstand transfizierter 293T-Zellen exprimiert und gereinigt. Das gereinigte Protein wird anschließend zur Immunisierung verwendet.

Mäuse und Seren werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung von den geimpften Mäusen gesammelt, um das Neutralisationspotenzial der Immusera zu quantifizieren. Es wird ein Pseudovirus-Neutralisationstest durchgeführt, bei dem ein rekombinant hergestelltes, Luciferase exprimierendes SARS-Pseudovirus erzeugt und mit einem titrierten Maul-SRA inkubiert wird. Anschließend wird die Fähigkeit dieser neutralisierten Viren, Zellen zu infizieren, die den SARS-Korezeptor ACE exprimieren, durch Messung der relativen Luciferase-Aktivität in den infizierten Zellen bewertet.

Die 50 %-Neutralisationsantikörpertiter können anschließend berechnet werden. Mein Name ist Tu. Ich bin derzeit Postdoktorand im Labor.

Der Hauptvorteil des Pseudovirus-Neutralisationstests gegenüber bestehenden Methoden wie Neutralisationstests mit lebenden Viren besteht darin, dass diese Technik relativ sicher ist. Sie erfordert kein infektiöses SARS-Virus und kann in einem Labor ohne Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt werden. Mein Name ist Demonstrationsverfahren wird liegen und DU ist ein forschender Postdoktorand in meinem Labor, der sich auf die Entwicklung von Impfstoffen gegen neu auftretende Infektionskrankheiten wie SARS und Infl konzentriert. Tauen Sie Aliquote sterilen zweifachen HBS-Puffers (pH 7), 2,5 molarem Calciumchlorid und RBD-Plasmid bei Raumtemperatur auf.

Nach dem Auftauen der Lösungen zwei Milliliter zweifach konzentriertes HBS in ein 50-Milliliter-Kegelrohr überführen; in einem 15-Milliliter-Röhrchen 200 Mikroliter Calciumchlorid mit 40 Mikrogramm RBD-Plasmid vermischen. Das Volumen unter Verwendung steriler, destillierter Wasser bei Raumtemperatur mit einer sterilen 5-Milliliter-Pipette auf zwei Milliliter einstellen. Die Plasmidlösung tropfenweise unter ständigem, aber sanftem Wirbeln zur zweifach konzentrierten HBS-Lösung hinzufügen.

Es ist entscheidend, diesen Wirbel langsam und kontinuierlich zu halten, um ein Präzipitat mit ausreichender Konsistenz für eine hohe Transfektionseffizienz zu erhalten. 20 Minuten bei Raumtemperatur lagern. Nach dieser Inkubation die Mischung tropfenweise einem Kolben mit 50 bis 70 % konfluenten 293T-Zellen hinzufügen.

In einem Volumen von 40 Millilitern Zellkulturmedium ist es wichtig, die Transfektionslösung gleichmäßig zu verteilen. Mischen Sie das Medium unmittelbar nach dem Hinzufügen der Transfektionsmischung. Stellen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einen 5 % Kohlendioxid-Brutschrank.

Nach acht bis zehn Stunden Inkubation wird das komplette Zellmedium entfernt und durch 50 Milliliter frisches, serumfreies Opti-MEM ersetzt, um Störungen durch Serum bei der nachfolgenden Proteinreinigung zu vermeiden. Danach werden die Zellen in den 37 °C-Inkubator zurückgebracht. Zwei Tage später wird das Überstand, der das exprimierte RBD-Protein enthält, gesammelt und 15 Minuten bei 6.000 U/min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Sobald die Zellen pelletiert sind, wird der Überstand in ein frisches Gefäß überführt und Proteaseinhibitorcocktail hinzugefügt.

Um den Proteinabbau zu verhindern, verwenden Sie Nickel-NTA-Superflow gemäß den Herstelleranweisungen, um das RBD-rekombinante Protein aus dem geernteten Überstand zu reinigen. Eluieren Sie das RBD-Protein mit einem Puffer, der 250 Millimolar OLE enthält. Konzentrieren Sie anschließend mithilfe von Amicon-Ultra-15-Röhrchen das gereinigte Protein, das OLE enthält, durch Zentrifugation bei 3000 U/min und vier Grad Celsius für etwa 15 Minuten. Entsorgen Sie den Durchlauf.

Fügen Sie PBS zu den RBD-Konzentrationgefäßen hinzu und zentrifugieren Sie erneut bei 3000 RPM und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Wiederholen Sie die Waschung zweimal. Um die vollständige Entfernung von Ole zu gewährleisten, wird das gereinigte Protein nun in PBS gelöst; pipettieren Sie das Protein in ein sauberes 1,5-Milliliter-EOR-Gefäß.

Berechnen Sie abschließend die Konzentration des gereinigten Proteins mithilfe eines NanoDrop unter Verwendung von PBS als Blindwert und lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius. Geben Sie zunächst ein Milliliter steriles PBS zu einem Vial des Sigma-Adjuvansystems hinzu. Erwärmen Sie es im Wasserbad auf 40 bis 45 Grad Celsius vor und wirbeln Sie das Vial gründlich zwei bis drei Minuten lang um.

Als Nächstes bereiten Sie die Protein-Adjuvans-Emulsion in einem 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen vor. Mischen Sie die gewünschte Menge des in PBS verdünnten, aufgetauten gereinigten Proteins mit einem gleichen Volumen Adjuvansystem und durchmischen Sie die Mischung kräftig im Vortex für zwei bis drei Minuten. Bereiten Sie außerdem Kontroll-Emulsionen vor, indem Sie das Adjuvans mit alleinigem PBS mischen. Subkutan.

Injizieren Sie mindestens fünf BC-Mäuse im Alter von vier bis sechs Wochen jeweils mit 200 Mikrolitern der initialen Impfmischung, die 20 Mikrogramm Protein pro Dosis enthalten, oder mit der Kontrollemulsion 21 Tage nach der initialen subkutanen Inokulation. Verabreichen Sie Auffrischungsdosen, die jeweils 10 Mikrogramm Protein in einem Endvolumen von 200 Mikrolitern enthalten. Entnehmen Sie Blutproben von jedem Maus vor der initialen Immunisierung sowie 10 Tage nach jeder Impfung und lagern Sie das isolierte Serum nach Hitzeeinwirkung bei minus 20 Grad Celsius.

Inaktivierung des Komplements bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten, 16 Stunden vor der Transfektion, platte 2 9 3 T-Zellen in 100 Millimeter Zellkulturschalen mit einer Dichte von 2 Millionen Zellen pro Schale. Bereite das Transfektionsreagenz wie zuvor beschrieben vor und ko-transfektiere die Zellen mit einem Plasmid, das das SARS-CoV-S-Protein kodiert, und einem weiteren, das das ENV-defekte, Luciferase exprimierende HIV-1-Genom kodiert. Acht bis 10 Stunden nach der Transfektion.

Ersetzen Sie das Medium durch 10 Milliliter frisches DMEM-Medium mit 10 % Serum und stellen Sie die Zellen anschließend in den Inkubator zurück. Zwei Tage später gewinnen Sie das Snat, das das SARS-Pseudovirus enthält. Lassen Sie das Überstandsvolumen durch einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter laufen, um zelluläre Trümmer zu entfernen, und portionieren Sie das Virus.

Unmittelbar verwenden oder bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung mit einer Mehrkanalpipette in einer Platte einfrieren. 293T-Zellen, die den SARS-CoV-Rezeptor ACE2 in der 96-Loch-Gewebekulturplatte bei einer Konzentration von 10.000 Zellen pro 100 Mikroliter pro Loch ausdrücken, und die Zellen 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Eine separate 96-Loch-Platte verwenden, um den rekombinanten, Luciferase exprimierenden SARS-Pseudovirus zu titrieren, und zunächst in den Reihen A und B der ersten Platte die geeignete Virus-Konzentration für den Neutralisationstest bestimmen.

150 Mikroliter pro Vertiefung von 10 % FBS-DMEM. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter unverdünntes Virus in die Reihen A1 und B1 und führen Sie eine doppelte serielle Verdünnung in Zweifachschritten durch, indem Sie jeweils 150 Mikroliter von den Vertiefungen der ersten Reihe in die Vertiefungen der nächsten Reihe überführen, und so weiter bis zur Reihe 11. Entsorgen Sie die letzten 150 Mikroliter und geben Sie kein Virus in die Reihe 12.

Nachdem die serielle Verdünnung durchgeführt wurde und die ACE 2 93 T-Zellen 16 Stunden lang inkubiert wurden, infizieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter aus jedem Well der Virusplatte in das entsprechende Well der Platte mit den Zellen übertragen. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius, damit die Viren die Zellen infizieren können. Bestimmen Sie den Infektionsgrad in jedem Well, indem Sie die Platte in einem Ultra 3 84-Luminometer auslesen.

Die Menge der Infektion steht in proportionalem Verhältnis zur Intensität der Luciferase-Aktivität. Die Virus-Konzentration, bei der die relative Luciferase-Einheit etwa tausendmal höher ist als die Hintergrund-Luciferase-Einheit der allein in Spalte 12 befindlichen Zellen, wird im Neutralisationstest verwendet. Richten Sie die Neutralisation zunächst in einer separaten 96-Well-Platte ein, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter 10 % FBS-DMEM in die Wells der Spalte eins und 120 Mikroliter in die Wells der anderen Spalten geben.

Fügen Sie anschließend jeweils drei Mikroliter der zu testenden Mauserumproben in duplizierten Vertiefungen der ersten Spalte hinzu. In diesem Beispiel enthalten die ersten beiden Vertiefungen 50-fach verdünntes Serum von einem mit RBD immunisierten Maus, die nächsten beiden Serum von einer zweiten mit RBD immunisierten Maus und die letzten vier Vertiefungen Serum von zwei Kontrolltieren, die mit PBS immunisiert wurden. Führen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette eine 5-fache serielle Verdünnung des Serums durch, indem Sie 30 Mikroliter aus allen Vertiefungen der ersten Spalte in die Vertiefungen der zweiten Spalte überführen und diesen Schritt bis zur elften Spalte wiederholen.

Entfernen Sie die restlichen 30 Mikroliter und lassen Sie die Vertiefungen in Spalte 12 serumfrei. Geben Sie anschließend 120 Mikroliter pro Vertiefung eines verdünnten SAR-Pseudovirus hinzu. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um Anti-RBD-Antikörpern im Mausserum die Bindung an und Neutralisierung des SARS-Pseudovirus zu ermöglichen.

Nach dieser Inkubation überführen Sie 100 Mikroliter des neutralisierten Virus aus jedem Well in die entsprechenden Wells der 96-Well-Platte, die ACE2-exprimierende 293T-Zellen enthält. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, um die Infektion zu ermöglichen. Sobald die Zellen infiziert sind, entfernen Sie das Medium mit einer Mehrkanalpipette und ersetzen Sie es durch jeweils 100 Mikroliter frisches Medium pro Well.

Bringen Sie die Platte nach 72 Stunden bei 37 Grad Celsius erneut in den Inkubator zurück. Entfernen Sie erneut den Überstand. Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Pseudoviren, die nicht durch das Mauserum neutralisiert wurden, mithilfe einer Mehrkanalpipette in der Lage gewesen sein, Zellen zu infizieren. Fügen Sie 60 Mikroliter pro Vertiefung eines Luciferase-Zellkultur-Lysereagens hinzu.

Stellen Sie die Platte auf einen Schüttler bei Raumtemperatur und lassen Sie die Zellen eine bis zwei Stunden lang lysieren. Sobald die Zellen lysiert sind, überführen Sie 50 Mikroliter der Zelllysate in eine 96-Well-Luminometerplatte und geben Sie pro Vertiefung 50 Mikroliter Luciferase-Substrat hinzu. Verwenden Sie ein Ultra 3 84-Luminometer, das im Luminometermodus für 96-Well-Platten eingestellt ist, um die Platte auszulesen und die relative Luciferase-Aktivität in den verschiedenen Vertiefungen zu bestimmen, aus der der Prozentsatz der neutralisierten Viren abgeleitet werden kann.

Diese Daten zeigen, dass der Prozentsatz der erzielten Virusneutralisierung proportional zur Konzentration des Serums von mit RBD immunisierten Mäusen ist. Im Gegensatz dazu ist das Serum von mit PBS injizierten Tieren nicht in der Lage, das Virus bei keiner der hier untersuchten Konzentrationen zu neutralisieren. Der NT50 oder der Serumtitel, bei dem 50 % des Virus neutralisiert werden, kann leicht abgeleitet werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass Selbstsicherheit und Geduld für den Erfolg von Experimenten unerlässlich sind. Nachdem Sie sich diese Videos angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man rekombinanten SARS-Impfstoff in Maman-Zellsublinien exprimiert und die Fähigkeit untersucht, eine neutralisierende Antikörperantwort in Mausmodellen auszulösen.