Fluoreszenzbildgebung der bakteriellen Besiedlung im Nierengewebe der Maus

Beginnen Sie mit einer Mausniere, die mit manipulierten Gram-positiven Bakterien infiziert ist, die das Gewebe besiedeln und Läsionen bilden.

Alle bakteriellen Zellen exprimieren rote Fluoreszenz, während läsion-spezifische Wirtsbedingungen die Expression von grünem fluoreszierendem Protein in bestimmten Zellen ermöglichen.

Behandeln Sie die Niere mit einem Fixativ und inkubieren Sie im Dunkeln, um die Gewebestruktur zu erhalten und die Zellmembranen teilweise zu permeabilisieren.

Das Organ in ein geeignetes Medium einbetten, einfrieren und in dünne Gewebescheiben aufteilen.

Legen Sie die Scheibe auf einen geladenen Glasträger zur Haftung.

Färben Sie das Gewebe mit einem nuklearen Farbstoff.

Der Farbstoff dringt in Wirts- und Bakterienzellen ein und bindet an die DNA.

Legen Sie einen Deckmantel über das Gewebe und betrachten Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop mit speziellen Bildgebungskanälen.

Die nukleare Färbung zeichnet die Wirts- und Bakterien-DNA ab.

Alle Bakterien im Gewebe zeigen rote Fluoreszenz, während die grüne Fluoreszenzexpression den Ort der Wirts-Pathogen-Interaktion anzeigt.

Am geeigneten experimentellen Endpunkt entnehmen Sie Niere, Herz, Leber, Lunge und Milz in 15-Milliliter-Polypropylenröhren mit 10 % gepuffertem Formalin für eine 24- bis 48-stündige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln oder Rotation.

Am Ende der Fixierung werden die Organe in ein klares Gefriermedium eingebettet, um bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Verwenden Sie einen Kryostat, um 10 Mikrometer dicke Gewebeschnitte zu erfassen, und trocknen Sie die Schnitte auf einzelnen, vorgereinigten, geladenen Glasobjektträgern 20 Minuten im Dunkeln, bevor Sie ein mit DAPI ergänztes Hardmontagemedium auftragen. Anschließend werden Deckscheiben aufgetragen und die Objektträger über Nacht bei Raumtemperatur ausgehärtet, bevor die Proben bei 4 Grad Celsius in die Langzeitlagerung überführt werden.

Um Läsionen in den Proben zu identifizieren, wird ein Objektträger auf die Bühne eines lasergescannten konfokalen Mikroskops gelegt und mit einem geeigneten Objektiv einzelne Zellen visualisiert, um Bilder der Läsionen zu machen.