Name: Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Lernen Sie eine kombinierte Methode aus lipophilen Farbstoffen, In-situ-Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie zur Analyse von Mausgewebe. Diese Technik maximiert den Informationsgewinn aus einem einzelnen Präparat und korreliert Morphologie mit Gen- und Proteinexpression.

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Konfokale Bilder wurden an der University of Iowa Carver Center for Imaging erhalten. Die Finanzierung wurde von einem SBIR Zuschuss (MH079805) zu BF Zusätzliche Unterstützung für die Zucht der Mäuse für dieses Projekt wurde von NIDCD (5R01DC00559007) zu BF zur Verfügung gestellt

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Maus Gewebe wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Iowa Institutional Animal Care und Verwenden Committee (ACURF 0804066) vereinnahmt.

In diesem Video zeigen wir eine Methode, um vier Techniken zu kombinieren, um die Datenerfassung und den Zusammenhalt durch die Korrelation von Daten innerhalb eines bestimmten Tieres (Abb. 3) zu maximieren. Dieser Ansatz verringert die Menge der Zucht und damit Zeit für die Veröffentlichung geeigneten Daten zu erhalten bei gleichzeitiger Verbesserung der Informationen über Co-Lokalisation und korrelative Wirkungen von Mutanten. Obwohl embryonalen Mäuse in diesem Video, erwachsenen Maus sowie andere Tiere wie Hühner, Xenopus und Zebrafisch eingesetzt wurden, können unter Verwendung dieser Techniken als gut. Bei Verwendung anderer Arten Proteinase K-Verdau kann verändert werden muss. Hier verwenden wir verschiedene fluoreszierende Farbstoffe NeuroVue gezielt Label bis zu drei neuronale Populationen von Interesse. Der Vorteil dieser Farbstoffe ist, dass sie in mutierten Mäusen, was problematisch sein kann, wenn sich ausschließlich auf die Immunhistochemie, die kann oder auch nicht durch die Mutationen analysiert werden betroffen sein können verwendet werden, und sie label Neuronen retrograd und anterograd 5. Eine aktuelle Studie hat auch die Anzahl der Neuronen Populationen, die gleichzeitig zu sechs 2 markiert werden können, erhöht. Danach können die lipophilen Farbstoff Verfolgung der gleichen Gewebe von Interesse dann mittels in-situ-Hybridisierung werden, für die Analyse der Gen-Transkription und können anschließend analysiert werden mittels Immunhistochemie für Protein-Verteilung. Letztere Analyse kann durch detaillierte Histologie, die zur Phänotypcharakterisierung 6 Fügen Sie können ergänzt werden. Diese multifaktoriellen Analyse hat das Potenzial, neue Erkenntnisse über korrelative Analyse gewinnen im gleichen Tier, die sonst möglicherweise unwahrscheinlich oder zumindest brauchen mehr umfangreiche Protokolle und Maus Zucht.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;In-situ&lt;/em&gt;-Hybridisierung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC DIG-Wasch- und Blockpuffer-Set</td><td>Roche Group</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Premix 20x SSC-Puffer</td><td>Roche Group</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat (DEPC)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche Group</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP-Fab-Fragmente</td><td>Roche Group</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>RNase A-Enzym 10 mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>Lachssperma-DNA 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-Filtereinheit 0,22&amp;mu;m; 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapierscheiben 0,2&amp;mu;m; 25 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4, in Beuteln</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Immunhistochemie:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst-Farbstoff</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Histologie:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly/Bed 812 Einbettmedium/DMP-30-Kit</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung 50 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>DPX-Montagemedium</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Rüttler</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank, eingestellt auf 60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Farbstoffmarkierung:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroscheren</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Feinzangen</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>NeuroVue-Farbstoff: Maroon, Rot, Jade</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank, eingestellt auf 36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Glycerin</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4 % und 0,4 %)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

die kombination lipophiler farbstoff, in situ hybridisierung, immunhistochemie und histologie

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Jenseits einzelnes Gen-Funktion, um tiefer Schnitt in Genregulationsnetzwerken erfordert mehrere Mutationen in einem einzigen Tier zusammen. Eine solche Analyse von zwei oder mehreren Genen muss mit in-situ-Hybridisierung von anderen Genen oder Immunhistochemie ihrer Proteine ​​ergänzt werden, sowohl im Ganzen montiert entwickeln Organe oder Abschnitte für detaillierte Auflösung der zellulären und Gewebe Ausdruck Veränderungen. Kombinieren mehrerer Genveränderungen erfordert den Einsatz von cre oder flipase bedingt löschen Genen und zur Vermeidung von embryonaler Letalität. Erforderliche Zuchtprogramme drastisch verbessern Aufwand und die Kosten proportional zu der Anzahl der Gene mutiert, mit einem Ergebnis von sehr wenigen Tieren, die mit dem vollen Repertoire an genetischen Veränderungen gewünscht. Amortizing die große Menge an Aufwand und Zeit, diese wenigen kostbaren Exemplare, die Durchführung mehrerer Mutationen zu erhalten erfordert Gewebe-Optimierung. Darüber hinaus untersucht ein einzelnes Tier mit mehreren Techniken macht es einfacher, Gendeletion Defekte mit Expressionsprofile zu korrelieren. Wir haben eine Technik, um eine gründlichere Analyse eines bestimmten Tieres zu erhalten entwickelt, mit der Fähigkeit, mehrere verschiedene histologisch erkennbare Strukturen sowie Gen-und Protein-Expression aller analysieren aus der gleichen Probe in beiden ganze montiert Organe und Abschnitte. Obwohl Mäuse verwendet worden sind, um die Wirksamkeit dieser Technik demonstrieren kann es zu einer Vielzahl von Tieren angewendet werden. Dazu kombinieren wir lipophilen Farbstoff Tracing, whole mount in situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie, um die maximal mögliche Menge an Daten zu extrahieren.

Eine Kombination verschiedener Techniken, um die Datenerfassung von der Maus Gewebe zu maximieren wird vorgestellt.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Um über die Funktion eines einzelnen Gens hinauszugehen und tiefer in Genregulationsnetzwerke einzudringen, sind mehrere Mutationen erforderlich, die in einem einzigen Tier kombiniert werden. Eine solche Analyse von ...

Um über die Funktion einzelner Gene hinauszugehen und genregulatorische Netzwerke zu analysieren, sind mehrere Mutationen in einem einzigen Organismus erforderlich. In diesem System optimieren wir die Menge an Daten, die aus einem einzelnen Gewebe gewonnen werden, um genetische Mutationen mit morphologischen und Expressionsprofilen zu korrelieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein lipophiles Farbstoff injiziert wird, um mehrere diskrete neuronale Populationen sichtbar zu machen.Die in-situ-Zwei-Hybridisierung wird durchgeführt, um das räumlich-zeitliche Muster von Gen-Transkripten sichtbar zu machen. Während die Immunhistochemie spezifische Muster der Proteinexpression widerspiegelt, trägt die zusätzliche Dimension der histologischen Schnitttechnik zur Phänotyp-Charakterisierung bei. Kombiniert ermöglicht dieses experimentelle System die Analyse mehrerer verschiedener histologisch erkennbarer Strukturen sowie der Gen- und Proteinexpression, und zwar an derselben Probe sowohl in ganzmontierten als auch in geschnittenen Präparaten. Ein System, das lipophile Farbstoffmarkierung und C-Zwei-Hybridisierung, Immunhistochemie sowie Histologie kombiniert.Diese Technik maximiert die gewonnenen Informationen aus einer einzelnen Probe, indem sie die Morphologie mit der Gen- und Proteinexpression korreliert. Für alle Gewebeschnitte und -manipulationen fixieren Sie die Tiere durch transkardiale Perfusion mit 4 % Parafomaldehyd in 0,1-molarer Phosphatpufferlösung unter Verwendung peristaltischer Pumpen mit geeignet dimensionierten Nadeln. Da die DY lichtempfindlich sind, lagern Sie sie in einem dunklen, geschlossenen Behältnis; um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie unter dem Stereomikroskop einen separaten Satz Instrumente für jede einzelne Farbstoffbehandlung.Bestimmen Sie eine Anwendungsstelle für den Farbstoff, um die betreffende neuronale Population selektiv zu markieren und andere überflüssige Strukturen auszusparen. Entfernen Sie überflüssiges Gewebe, um die gewählte Stelle visuell zu überprüfen und Zugang für die Platzierung des Farbstoffs zu erhalten. Schneiden Sie die vorbeladenen Neuro-View-Farbstoff-Filterstreifen nun mit einer Mikroschere in passend große dreieckige Stücke.Stellen Sie sicher, ein möglichst kleines Stück zu schneiden, um eine Markierung anderer Strukturen zu vermeiden, die in weiches Gewebe wie das Gehirn direkt eingeführt werden sollen. Führen Sie den Filter mit einer Spitze des Filterdreiecks ein, um das Gewebe zu durchdringen. Bei steiferem Gewebe machen Sie einen Einschnitt, um die Einführung des D. zu erleichtern. Verwenden Sie keine Präpariernadel, um den Filter in das Gewebe hineinzuschieben.Stellen Sie die Proben in ein sicher verschlossenes Gefäß mit 4 % Paraformaldehyd und inkubieren Sie sie je nach Alter und zu überbrückendem Diffusionsabstand zwei bis 14 Tage bei 36 Grad Celsius im Dunkeln. Überprüfen Sie mithilfe eines Auflicht-Fluoreszenzmikroskops, ob sich der Farbstoff an die gewünschte Position ausgebreitet hat, und präparieren Sie das interessierende Gewebe aus. Befestigen Sie die Probe mit Glycerin auf einem Objektträger, um sie mit einem konfokalen Mikroskop abzubilden.Nach der Bildgebung lipophiler Augen auf dem konfokalen Mikroskop überführen Sie die Proben in eine zwei Milliliter fassende, RNase-freie Eppendorf-Röhrchen mit RNase-freier PBS, um das Glycerin systematisch auszuwaschen. Führen Sie die Proben einer Dehydratisierung und Rehydratisierung mittels einer abgestuften Methanolreihe bei vier Grad Celsius zu. Beginnen Sie mit einer Inkubation in 100 % Methanol für mindestens eine Stunde und arbeiten Sie bis zu 25 % Methanol für 15 Minuten herunter.Dreimal für jeweils fünf Minuten in 1× PBS waschen. Das Gewebe mit zwei Mikrolitern einer 20 Milligramm pro Milliliter Stammlösung Proteinase K in zwei Millilitern frischem PBS verdauen. Die Verdauungsreaktion anhand der Veränderung der Gewebetrübung von undurchsichtig zu nahezu klar überwachen.Um die Enzymverdauung zu stoppen, inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd. Anschließend waschen Sie einmal mit PBS für eine Minute, gefolgt von drei weiteren Waschungen zu je fünf Minuten. Entsorgen Sie die letzte PBS-Waschung, wobei besonders darauf geachtet werden sollte, so viel wie möglich zu entfernen, als Vorbereitungsschritt vor der Hybridisierung.Die Proben in 1,8 Milliliter Hybridisierungspuffer inkubieren. Eine Stunde lang bei 60 Grad Celsius auf einem Inverter mischen. Salmonensperma-DNA durch 10-minütige Inkubation bei 85 Grad Celsius denaturieren, anschließend auf Eis stellen, 200 Mikroliter denaturierte, einfachsträngige DNA und etwa 100 Nanogramm DIG-markierte Riba hinzufügen. Die Sonde zu jeder Probe geben und über Nacht bei 60 Grad Celsius in einem Hybridisierungs-Ofen hybridisieren.Behandeln Sie die Proben mit drei Waschungen à 10 Minuten mit zweifach SSC bei 60 Grad Celsius im Hybridisierofen. Entfernen Sie wichtig jegliche endogene Alkalische-Phosphatase-Aktivität durch eine Waschung mit zweifach SSC für 60 Minuten bei 70 Grad Celsius in einem ISO-Temp-Wärmespeicherblock. Waschen Sie die Proben anschließend fünf Minuten mit PBS.Ersetzen Sie nun das PBS und geben Sie ein Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter Lösung von RNasen A hinzu. Inkubieren Sie 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem ISO-Temp-Wärmeblock. Entsorgen Sie das PBS mit RNasen A und waschen Sie dreimal mit Waschlösung, jeweils 10 Minuten lang.Schließlich die verbleibenden RNA-Moleküle durch eine 60-minütige Inkubation bei 70 Grad Celsius in einem ISO-Temperierblock erhitzen und aktivieren. Der letzte Schritt ist die Visualisierung der Ribo-Sonde. Die Proben eine Stunde lang in Blockpuffer in 1-facher Konzentration inkubieren.Entfernen Sie den Blockpuffer und geben Sie zwei Milliliter Blockpuffer, die ein Mikroliter Anti-Ditch-Antikörper enthalten, zu jeder Probe hinzu. Inkubieren Sie über Nacht und waschen Sie mehrmals mit einemmaligem Waschpuffer, wie angegeben. Anschließend inkubieren Sie die Proben über Nacht in einemmaligem Waschpuffer.Spülen Sie die Proben 10 Minuten lang mit einmaligem Detektionspuffer und überführen Sie die Proben in eine Mehrfachbrunnenplatte. Entsorgen Sie den Puffer und entwickeln Sie die Farbe mit BM Purple, da BM.Purple lichtempfindlich ist. Decken Sie die Probe mit Folie oder einer Schachtel ab, sobald die gewünschte Signalstärke erreicht ist.Spülen Sie die Proben fünf Minuten lang mit einmaligem Detektionspuffer in den Vertiefungen. Bilden Sie die Proben mittels Transmissionsmikroskopie ab oder lagern Sie sie in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie lipophile Farbstoffe aus dem Gewebe bei Bedarf mit einer gestuften Ethanolreihe.Anschließend das Gewebe durch schrittweises Hinzufügen von PBS über fünf bis zehn Minuten wieder befeuchten. Danach das Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler in 2,5 % normalem Ziegenserum und 0,5 % Triton X-100 blockieren, dann mit dem primären Antikörper, der in der Blocklösung verdünnt wurde, 48 Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler inkubieren. Dreimal für jeweils eine Stunde mit PBS waschen, anschließend die Proben erneut blockieren und danach mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper, der in der Blocklösung verdünnt wurde, 12 bis 24 Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Schüttler inkubieren. Ab diesem Zeitpunkt ist darauf zu achten, dass die Probe vor Licht geschützt wird, da die sekundären Antikörper lichtempfindlich sind.Waschen Sie die Proben erneut dreimal mit PBS, jeweils eine Stunde lang. Analysieren Sie die Proben abschließend durch Bildgebung mittels epifluoreszenz- und konfokaler Mikroskopie. Das Einbetten in Epoxidharz und das Schneiden erfordern die Fixierung des Gewebes in 2,5 % GLUTARALDEHYD und 1 % PFA in 0,1 molarer Phosphatpufferlösung, üblicherweise über Nacht in einem Glasprobenröhrchen. Dehydrieren Sie das Gewebe durch Inkubation in aufsteigenden Ethanol-Konzentrationen. Um nun zu Lösungsmitteln überzugehen, inkubieren Sie es zunächst 5 Minuten lang im Verhältnis 1:1 in absolutem Ethanol und Propylenoxid, gefolgt von fünfmaligem Waschen in reinem Propylenoxid je 10 Minuten. Infiltrieren Sie die Probe anschließend mit Harz durch einfache Inkubation im Verhältnis 1:1 von Propylenoxid zu Harz über Nacht auf einem Schüttler.Geben Sie die Lösung mit der Probe in eine flache Einbettform und lassen Sie sie vier bis sechs Stunden lang auf dem Laborpult stehen, um das Propylenoxid verdunsten zu lassen. Überführen Sie die Proben in einer Endform für vier Stunden in 100 % Harz. Einbetten Sie die Proben in Harz und bringen Sie ein Etikett an.Lassen Sie das Harz durch Inkubation bei 60 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden polymerisieren. Um überschüssiges Harz zu minimieren, bearbeiten Sie den Harzblock nach Bedarf mit einer Rasierklinge. An einem Ultramikrotom.Schneiden Sie serielle Schnitte von ein bis zwei Mikrometern, montieren und bilden Sie die Proben mittels Durchlicht- und Epifluoreszenzmikroskopie ab. Lipophile Farbstoffe mit unterschiedlichen Wellenlängen können die Visualisierung zentraler Projektionen dreier verschiedener Hirnnerven erleichtern. Hier wird lipophiles Farbstoffmittel in die peripheren Anteile des Nervus trigeminus, des Nervus glossopharyngeus und des Nervus vagus eingebracht.Nach der Inkubation zur Farbstoffdiffusion werden die zentralen Nervenfasern zum Hirnstamm mittels Hellfeldmikroskopie sichtbar gemacht. Wenn das R&uuml;ckenmark pr&auml;pariert und flach montiert wird, ist eine Markierung der zentralen Forts&auml;tze der drei markierten Nerven deutlich erkennbar. Unter Hellfeldmikroskopie erm&ouml;glicht das konfokale Mikroskop eine dreidimensionale Darstellung, bei der spezifische Bereiche beleuchtet werden, und die Verwendung von drei verschiedenen Farbstoffen erlaubt die Beurteilung der Verteilung jeder einzelnen Population.Im Vergleich zu den anderen werden hier die afferenten Bahnen des Innenohrs in einem neugeborenen Mausmodell mittels Neuro-View dargestellt. Rot in C: zwei Hybridisierungen für Prox1 sowie eine Kombination aus Immunreaktivität gegen Anti-Tubulin und Anti-Prox1, um die afferenten Bahnen sichtbar zu machen.Außerdem bildet ein zwei Mikrometer dicker Epoxidharzschnitt die Cochlea im Querschnitt ab. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Platzierung des lipophilen Farbstoffs sorgfältig zu wählen. Ein gutes Verständnis der Neuroanatomie ist dabei hilfreich und man sollte außerdem bei allen lichtempfindlichen Schritten Vorsicht walten lassen.Dieses Verfahren verringert die Menge der Zucht und die Zeit, die zur Gewinnung publizierbarer Daten benötigt wird, und verbessert gleichzeitig die Informationen über Kolokalisation und Deckungseffekte bei Mutanten.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

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