Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Mitochondrien zu isolieren und eine mitochondriale Atmung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Skelettmuskulatur von sprühenden Ratten isoliert wird. Als nächstes wird der Muskel homogenisiert und die Mitochondrien werden durch Zentrifugation isoliert.

Anschließend wird die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay bestimmt. Schließlich wird die mitochondriale Atmung durch Polygraphie gemessen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Sauerstoffverbrauch durch die verschiedenen mitochondrialen Atmungszustände zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Skelettmuskulatur zu beantworten, wie z.B. die Wirkung verschiedener Eingriffe in die Mitochondrienfunktion. Obwohl diese Methode einen Einblick in den Stoffwechsel der Skelettmuskulatur geben kann, kann sie auch auf andere Organe wie Leber, Gehirn, Niere oder fast jedes Gewebe angewendet werden, bevor mit dem Eingriff begonnen wird. Um die Skelettmuskulatur zu isolieren, bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: P-B-S-P-B-S plus 10 millimolare EDTA, achtmal Mitochondrienpuffer Isolationspuffer eins oder IB eins, Isolationspuffer zwei oder IB zwei und experimenteller Puffer oder eb.

Anweisungen finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Schalten Sie anschließend die Zentrifuge ein und stellen Sie sie auf vier Grad Celsius ein. Schalten Sie ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein.

Legen Sie in einen schönen Eimer drei 10-Milliliter-Becher, einen Töpferbogen, Edelsteinschleifer, eine kleine chirurgische Schere und 10 Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Während des gesamten Experiments muss alles eiskalt bleiben. Legen Sie IB eins und IB zwei auf ICE und EB in ein warmes Wasserbad.

Geben Sie dann zu den drei Bechern auf dem Eisbecher die folgenden Lösungen: einen 10-Milliliter-PBS-Becher, zwei 10-Milliliter-P-B-S-E-D-T-A-Becher. Drei. Drei Milliliter ib. Man euthanasiert eine Ratte gemäß den Verfahren ein, die von Ihrem örtlichen institutionellen Tierpflege- und Saftausschuss genehmigt wurden.

Isolieren Sie anschließend schnell 250 bis 500 Milligramm Skelettmuskulatur mit einer Pinzette und einer Mayo-Klinikschere. Spülen Sie es in beca one und übertragen Sie es dann in beca two, um den Muskel zu homogenisieren. Zuerst in den dritten Becher geben und zum Schluss mit einer Schere fein hacken.

Übertragen Sie die Lösung in den Töpfer Elva Edelstein-Homogenisator, homogenisieren Sie den Muskel mit einem motorisierten Stößel 10 Mal, wobei Sie das Röhrchen immer im Eis halten. Anschließend wird das Homogenat in eine vorgekühlte Zwei-Milliliter-Mikrozentrifuge, Röhrchen und eine Zentrifuge bei 700 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius gegeben. Übertragen Sie den S-Überstand in ein neues, vorgefeiltes Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pelletzentrifuge.

Der S-Überstand bei 10.500 Gs für 10 Minuten Bei vier Grad Celsius wird der SNAT in ein neues vorgefülltes Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt und mit SN one und Muskeltyp Reese beschriftet. Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern IB two und zentrifugieren Sie es dann 10 Minuten lang bei 10.500 g bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie das Supinat in ein neues vorgefülltes Mikrozentrifugenröhrchen und markieren Sie es mit SN zwei und Muskeltyp.

Suspendieren Sie das endgültige mitochondriale Pellet in 100 Mikrolitern IB zwei. Drehen Sie es in einer Mini-Fuge für ein paar Sekunden. Wenn es ein Pellet gibt, übertragen Sie das Supinat in ein neues, vorgefülltes Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden.

Die Kalibrierung der Elektrode kann während der mitochondrialen Isolierung abgeschlossen werden. Zu Beginn 100 Milliliter destilliertes Wasser in einen 250-Milliliter-Kolbenstern geben und 20 Minuten lang kräftig aufgießen. Um das Wasser mit atmosphärischem Gas auszugleichen, bedecken Sie die GAT-Elektrode mit einigen Tropfen 50%igem Kaliumchlorid

Lege dann ein kleines Stück blaues Rizla-Blättchen auf die Elektrode. Dann ein Stück PTFE-Membran. Auf dem Nudelpapier.

Bringen Sie den inneren Ring mit dem Ringapplikator an und platzieren Sie dann den äußeren Ring in der Elektrodennut. Schließen Sie die Elektroden an und montieren Sie den größeren Kunststoffringsockel, die Mitochondrienkammer und die Wasserschläuche. Schalten Sie die GRAS-Boxen ein und starten Sie die GRAS-Software.

Geben Sie das äquilibrierte Wasser in die Mitochondrienkammer. Fügen Sie dann einen Rührstab hinzu, um den Rührstab einzuschalten. Klicken Sie auf Hardware.

Rühren Sie dann eine Stufe um. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 60 ein und klicken Sie auf. Beginnen Sie als Nächstes ein neues Experiment.

Klicken Sie auf Kalibrieren und dann auf Flüssigphasenkalibrierung. Ändern Sie für Feld eins die Temperatur auf 37 Grad Celsius und klicken Sie zweimal auf OK. Wenn sich die Überschreibung in "OK" ändert, klicken Sie darauf und öffnen Sie den Stickstoffgastank.

Setzen Sie die mit dem Stickstofftank verbundene Spitze in die Kammer ein und stellen Sie keinen Sauerstoff ein. Klicken Sie auf OK, wenn die Außerkraftsetzung geändert wird. Saugen Sie das Wasser ab und geben Sie 500 Mikroliter EB in die Mitochondrienkammern.

Verschließen Sie die Kammer mit einem Kolben. Wenn Sie mehrere Boxen verwenden, wiederholen Sie den Vorgang mit dem Kalibrierungsschritt für jede Box. Starten Sie ein neues Experiment, und lassen Sie es etwa eine Minute lang laufen.

Um das Signal zu stabilisieren, fügen Sie das notwendige Volumen der Mitochondriensuspension hinzu, um 150 Mikrogramm in jeder Kammer zu erreichen. Markieren Sie das Ereignis und lassen Sie es ausführen. Fügen Sie eine Minute lang 10 Mikroliter warmes 250 millimolares Glutamat, 125 millimolares Malat für eine Endkonzentration von fünf millimolaren Glutamat, 2,5 Millimolar Malatmarke, hinzu und lassen Sie es eine Minute lang laufen.

Dies ist als Zustand zwei definiert. Als nächstes fügen Sie 7,5 Mikroliter 10 Millimolar pro DP hinzu, um eine Endkonzentration von 150 Mikromolar zu erreichen. Markieren Sie dann und lassen Sie es 30 Sekunden lang laufen.

Dies ist als Zustand drei definiert. Fügen Sie weitere 7,5 Mikroliter mit 10 Millimolar einer DP-Markierung hinzu und lassen Sie es 1,5 Minuten lang laufen. Fügen Sie 0,5 Mikroliter kaltes 10 millimolares Oligomycin für eine Endkonzentration von einer mikromolaren Markierung hinzu und lassen Sie es drei Minuten lang laufen.

Dies ist als Zustand vier definiert. Fügen Sie einen Mikroliter kaltes, 0,1 millimolare FCCP für eine Endkonzentration von 0,2 Mikromolaren Markierung hinzu und lassen Sie RUM drei Minuten lang laufen. Dies ist als Zustand fünf definiert.

Wenn Sie fertig sind, beenden Sie das Experiment, und speichern Sie es. Erfassen Sie die Atemfrequenzen mit der Raft-Software. Geben Sie den Normalisierungsfaktor ein.

Wenn 150 Mikrogramm mitochondriales Protein hinzugefügt werden, beträgt der Normalisierungsfaktor 0,15. Berechnen Sie die normierten Atmungsraten für die verschiedenen Atmungszustände. Berechnen Sie das Atemkontrollverhältnis (RCR), indem Sie den Zustand drei durch den Zustand vier dividieren.

Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Nachverfolgung des Sauerstoffverbrauchs durch die Skelettmuskulatur. Mitochondrien. Nachdem das Elektrodensignal stabilisiert ist, wird die Mitochondrienprobe in die GAT-Kammer gegeben. Zustand zwei, die Atmung beginnt mit der Zugabe von Glutamat und Malat.

Die Zugabe von A DP erhöht den Sauerstoffverbrauch. Definieren von Zustand drei. Atmung Eine TP-Syntase wird durch die Zugabe eines Liga-Mycins blockiert, um die Atmung des vierten Zustands zu erreichen.

Schließlich wird FCCP hinzugefügt, um die mitochondriale Atmung zu entkoppeln. Dieses Diagramm zeigt repräsentative Sauerstoffverbrauchsraten für die Zustände 2, 3, 4 und fünf. Das Respiratory Control Ratio (RCR) wird für jedes Experiment berechnet.

Eine RCR von mehr als vier gilt als Beweis für eine lebensfähige Mitochondrienvorbereitung Beim Versuch dieses Verfahrens. Es ist wichtig, mitochondriale Proben immer im Eis aufzubewahren. Befolgen Sie dieses Verfahren.

Andere Methoden wie Western Blots können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie den Gehalt an mitochondrialen Proteinen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den mitochondrialen Muskel vom Skelet-Muskel sowie die mitochondriale Atmung isoliert.