Name: Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur für Stoffwechselforschung. Diese Methode ermöglicht die Messung der mitochondrialen Atmung und Sauerstoffverbrauchsanalyse.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Eye Institute (R01 EY12998) an der FH Andrade unterstützt.

1. Herstellung der Puffer <ol><li> Schalten Sie Zentrifuge 5804R und auf 4 ° C. Schalten Sie Isotemp 3006D Wasserbad und auf 37 ° C. </li><li> Stellen Sie folgende Lösungen vor Muskel-Isolation: <ul><li> PBS: Lösen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Tabletten in destilliertem Wasser (5 Tabletten / Liter). Gut mischen. </li><li> PBS plus 10 mM EDTA: So bereiten Sie eine 100 ml-Lösung, 2 ml 500 mM EDTA und 98 ml PBS. </li><li> 8X Mitochondrien Puffer: 10,28 g Saccharose für eine Endkonzentration von 0,6 M, 400 mg der freien Fettsäuren Rinderserumalbumin (BSA) für eine Endkonzentration von 0,8%, 2,08 g HEPES für eine Endkonzentration von 160 mM, pH auf 7,4 und QS auf 50 ml mit destilliertem Wasser. </li><li> Isolation Buffer 1 (IB1): In 200 ul 500 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 10 mM, 0,392 g D-Mannitol zu einer Endkonzentration von 215 mM, 1,25 ml 8X Mitochondrien-Puffer, pH auf 7,4 und QS bis 10 ml mit destilliertem Wasser. </li><li> Isolation Buffer 2 (IB2): In 60 ul 500 mM EGTA für eine Endkonzentration von 3 mM, 0,392 g D-Mannitol zu einer Endkonzentration von 215 mM, 1,25 ml 8X Mitochondrien-Puffer, pH auf 7,4 und QS bis 10 ml mit destilliertem Wasser. </li><li> Experimentelle Buffer (EB): 100 l von 500 mM MgCl 2 für eine Endkonzentration von 5 mM, 0,392 g D-Mannitol zu einer Endkonzentration von 215 mM, 25 ul von 2,5 mM KH 2 PO 4 für eine endgültige Konzentration von 6,25 pM, 2 ul 100 mM EGTA für eine Endkonzentration von 20 uM, 1,25 ml der mitochondrialen Puffer, pH auf 7,4 und QS bis 10 ml mit destilliertem Wasser. </li></ul></li></ol> 2. Muscle Isolation <ol><li> In einem Eiskübel, legte drei 10 ml-Becher, Potter-Elvehjem Gewebe Mühlen und alle anderen notwendigen Instrumente / supplies auf Eis. Alles muss bleiben eiskalt während des gesamten Experiments. </li><li> Legen Sie IB1 und IB2 in Eiskübel und EB in warmen Wasserbad, wenn Sie fertig. </li><li> In den drei 10 ml Becher, sollten die folgenden Lösungen gegeben werden: <ul><li> Beaker 1: 10 ml PBS </li><li> Beaker 2: 10 ml PBS / EDTA </li><li> Beaker 3: 3 ml IB1 </li></ul></li><li> Tötet eine Ratte menschlich wie von Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. </li><li> Schnell isolieren 250-500 mg der Skelettmuskulatur, spülen Sie im Becherglas 1, dann Becherglas 2 übertragen. </li></ol> 3. Homogenisierung / Mitochondrial Isolation <ol><li> Transfer-Muskel Beaker 3 und fein hacken den Muskel mit einer Schere. </li><li> Übertragen Sie die Lösung für die Potter-Elvehjem Homogenisator. Homogenisieren der Muskel mit einem motorisierten Stößel (einer Bohrmaschine wird die Arbeit zu tun) 10-mal halten den Schlauch in Eis zu allen Zeiten. </li><li> Transfer-Homogenat zu vorgekühlte 2 ml Reaktionsgefäße und Zentrifuge bei 700 g für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Discard Pellet. </li><li> Centrifuge Überstand bei 10.500 g für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und Label SN1 (Überstand Nummer 1) und Muskel-Typ. </li><li> Re-suspend Pellet in 500 ul IB2. </li><li> Zentrifuge bei 10.500 g für 10 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und Label SN2 (Überstand Nummer 2) und Muskel-Typ. </li><li> Suspend letzten mitochondriale Pellet in 100 ul IB2. </li><li> Re-Spin-Finale mitochondrialen Suspension in Minifuge für ein paar Sekunden. Wenn es eine Pellet-, Transfer Überstand in ein neues vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Bestimmen Sie Proteinkonzentration mit der Bradford-Assay 8. </li></ol> 4. Kalibrierung der Elektrode HINWEIS: Vollständige Kalibrierung der Elektrode während der mitochondrialen Isolation. <ol><li> 100 ml destilliertem Wasser auf 250 ml Flasche. Lang kräftig für 20 Minuten, um das Wasser mit Luft-Gas-Gleichgewicht zu bringen. </li><li> Fügen Sie ein paar Tropfen 50% KCl zur Oxygraph Elektrode. </li><li> Legen Sie ein kleines Stück von Blue Rizla Zigarettenpapier auf der Elektrode. </li><li> Legen Sie ein Stück PTFE-Membran auf der Oberseite des Zigarettenpapier. </li><li> Wenden Sie den inneren Ring mit dem Ring-Applikator und platzieren Sie dann den Außenring in die Elektrode Nut. </li><li> Connect Elektroden und montieren den Rest der Ausrüstung: größer Kunststoffring Basis mitochondrialer Kammer und Wasserschläuchen. </li><li> Schalten Sie Oxygraph Boxen und starten Oxygraph Software. </li><li> Fügen Sie die äquilibriert Wasser mitochondrialen Kammer. </li><li> Add Rührstab und schalten Sie auf eine Geschwindigkeit von 60 Jahren. </li><li> Beginnen Sie ein neues Experiment. </li><li> Klicken Sie auf Kalibrieren und dann flüssigen Phase Kalibrierung für Box 1. Ändern Temperatur auf 37 ° C und klicken Sie auf "OK" zweimal. </li><li> Als "Override" auf "OK" klicken, und öffnen Sie die Stickstoff-Tank. </li><li> Platzieren Sie die Spitze verbundenStickstoff-Tank in die Kammer und zu etablieren Null Sauerstoff. Klicken Sie auf "OK", wenn sie von Schaltern "Override". </li><li> Saugen Sie Wasser und fügen Sie 500 ul der EB-Puffer zur mitochondrialen Kammern. </li><li> Seal Kammer mit Kolben. </li><li> Bei Verwendung mehrerer Boxen, wiederholen Sie die Schritte 11-15 für die Kalibrierung von Box 2. </li></ol> 5. Mitochondriale Atmung <ol><li> Starten Sie ein neues Experiment, lassen Sie es für ca. 1 Minute laufen, um zu signalisieren stabilisieren. </li><li> Add erforderliche Volumen der mitochondrialen Suspension (Schritt 3,11) für 150 ug in jeder Kammer, markieren Veranstaltung und lassen Sie sie für 1 Minute laufen. </li><li> Add 10 pl warmem 250 mm/125 mm Glutamat / Malat für eine Endkonzentration von 5 mM mM/2.5. Mark und für 1 Minute laufen zu lassen. Dies wird als Zustand 2 definiert. </li><li> Add 7,5 ul 10 mM ADP für eine endgültige Konzentration von 150 uM, Marke, und lassen Sie laufen für 30 Sekunden. Dies wird als State 3 definiert. </li><li> Fügen Sie weitere 7,5 ul 10 mM ADP, Marke, und lassen Sie laufen für 1,5 Minuten. </li><li> Add 0,5 ul kaltem 10 mM Oligomycin für eine endgültige Konzentration von 1 nM, Marke, und lassen Sie laufen für 3 Minuten. Dies ist als staatliche 4 definiert. </li><li> Add 1 ul kalter 0,1 mM FCCP für eine endgültige Konzentration von 0,2 uM, Marke, und lassen Sie laufen für 3 Minuten. Dies ist als staatliche 5 definiert. </li><li> Wenn Sie fertig sind, beenden experimentieren und zu speichern. </li><li> Erwerben Atemfrequenz mittels Oxygraph Software. </li><li> Geben Sie Normierungsfaktor: Wenn Zugabe von 150 pg mitochondriale Protein, dem Normierungsfaktor wird 0,15. </li><li> Berechnen normalisiert Atemfrequenz für die verschiedenen Atmung Staaten. </li><li> Berechnen Sie den Respiratory Control-Ratio (RCR), indem State 3 von State 4. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Zeigt eine repräsentative Verfolgung von Sauerstoffverbrauch durch Skelettmuskulatur Mitochondrien. Nach der Elektrode Signal stabilisiert ist, wird die Mitochondrien Probe auf die Oxygraph Kammer aufgenommen. State 2 Atmung beginnt mit Zusatz von Glutamat und Malat. Die Zugabe von ADP steigt der Sauerstoffverbrauch, die Definition Zustand 3 Atmung. ATP-Synthase wird durch Zugabe von Oligomycin blockiert, um den Zustand 4 Atmung zu erhalten. Schließlich ist FCCP hinzugefügt, um die mitochondriale Atmung (Zustand 5) zu entkoppeln. Tabelle 1 zeigt repräsentative Sauerstoffverbrauch Preise für die Zustände 2, 3, 4 und 5. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV) ist für jedes Experiment berechnet. RCR ≥ 4 wird als Beweis für eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung berücksichtigt. <table border="1"><tbody><tr><td> Staaten </td><td> Normalisierte Preise </td></tr><tr><td> State 2 </td><td> 34,74 </td></tr><tr><td> State 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> State 4 </td><td> 16,49 </td></tr><tr><td> State 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9,30 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mitochondriale Atemfrequenz. Representativeoxygen Verbrauch von Skelettmuskel Mitochondrien. Die Werte sind auf die Höhe der Mitochondrien aufgenommen, um die Kammer normalisiert. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV) wird durch Division Zustand 3 durch staatliche 4 bestimmt. Ein RCR ≥ 4 stellt eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

Wir präsentieren ein Protokoll, um lebensfähige Mitochondrien aus Skelettmuskulatur zu isolieren. Wenn Ertrag ist ein Problem, kann das Protokoll durch Inkubation der isolierten Muskel in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin für 30 Minuten in Eis verändert werden. Um sicherzustellen, komplette Muskel-Verdau mit Trypsin, muss der Muskel vollständig zerkleinert werden. Nach dem 30-minütigen Inkubation, muss der PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin-Lösung komplett mit 3 ml der Isolation Puffer 1 (IB1) ersetzt werden. Darüber hinaus kan...

<table><tbody><tr><td>95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Gemisch</td><td>Lokaler Gaslieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumsalz von Adenosin-5&amp;#8242;-diphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Blaues Rizla-Papier</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Protein-Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komprimierter Stickstoff</td><td>Lokaler Gaslieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglycol-bis-tetraessigsäure (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Freie Fettsäuren an Rinderserumalbumin gebunden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsalz von HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Männliche Sprague-Dawley-Ratten</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300–500 g</td><td></td></tr><tr><td>Apfelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffelektroden-Scheibe</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01-Software</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem-Homogenisatoren</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Membran (0,0125 mm &amp;#215; 25 mm)</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Bohrmaschine SKIL 3320</td><td>Baumarkt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriale isolation von der skelettmuskulatur

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondrien sind Organellen Steuerung der Leben und Tod der Zelle. Sie in wichtigen Stoffwechselreaktionen beteiligt, synthetisieren die meisten der ATP, und regeln eine Reihe von Signalkaskaden 2,3. Vergangene und gegenwärtige Forscher haben isolierte Mitochondrien aus Ratten und Mäusen Gewebe wie Leber, Gehirn und Herz 4,5. In den letzten Jahren haben viele Forscher auf die Untersuchung der mitochondrialen Funktion von Skelettmuskeln konzentriert. Hier beschreiben wir eine Methode, die wir erfolgreich für die Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskeln 6 verwendet. Unser Verfahren erfordert, dass alle Puffer und Reagenzien hergestellt sind frisch und müssen etwa 250-500 mg der Skelettmuskulatur. Wir untersuchten Mitochondrien aus Ratte und Maus gastrocnemius und Zwerchfell isoliert und Ratte Augenmuskeln. Mitochondriale Protein-Konzentration wird mit dem Bradford-Assay gemessen. Es ist wichtig, dass die mitochondriale Proben aufbewahrt eiskalt während der Vorbereitung und funktionelle Studien in relativ kurzer Zeit (~ 1 h) durchgeführt werden kann. Mitochondriale Atmung gemessen mittels Polarographie mit einer Clark-Elektrode (Oxygraph System) bei 37 ° C 7. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden. Isolierte Mitochondrien (150 ug) sind bis 0,5 ml der experimentellen Puffer (EB) aufgenommen. State 2 Atmung beginnt mit Zusatz von Glutamat (5mm) und Malat (2,5 mM). Dann wird Adenosindiphosphat (ADP) (150 nM) zugegeben, um den Zustand 3 zu beginnen. Oligomycin (1 pM), einer ATPase-Synthase-Blocker, wird verwendet, um den Zustand 4 zu schätzen. Schließlich Carbonyl Cyanid p-[Trifluormethoxy]-phenyl-Hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wird zugegeben und 5 measurestate oder abgekoppelt Atmung 6. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV), das Verhältnis von Staat 3 bis Zustand 4 wird nach jedem Experiment berechnet. Ein RCR ≥ 4 wird als Beweis für eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung berücksichtigt. Zusammenfassend stellen wir eine Methode zur Isolierung von lebensfähigen Mitochondrien aus Skelettmuskeln, die in biochemischen (zB Enzymaktivität, Immundetektion, Proteomik) und funktionelle Untersuchungen (mitochondriale Atmung) genutzt werden können.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano angepasst<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). Die Mitochondrien isoliert Verfahren erfordert etwa 2 Stunden. Die mitochondriale Atmung kann in ca. 1 Stunde abgeschlossen sein.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondrien sind Organellen, die über Leben und Tod der Zelle entscheiden. Sie nehmen an zentralen Stoffwechselreaktionen teil, synthetisieren den Großteil des ATP und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien zu isolieren und die mitochondriale Atmung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Skelettmuskel von spray dly-Ratten isoliert wird. Anschließend wird das Muskelgewebe homogenisiert und die Mitochondrien durch Zentrifugation abgetrennt.Die Protein­konzentration wird anschließend mithilfe des Bradford-Assays bestimmt. Schließlich wird die mitochondriale Atmung mittels Polygraphie gemessen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die den Sauerstoff­verbrauch in den verschiedenen Zuständen der mitochondrialen Atmung zeigen.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Skelettmuskulatur beantworten, beispielsweise die Wirkung verschiedener Interventionen auf die mitochondriale Funktion. Obwohl diese Methode Einblicke in den Stoffwechsel der Skelettmuskulatur ermöglicht, kann sie auch auf andere Organe wie Leber, Gehirn, Niere oder nahezu jedes Gewebe angewendet werden, bevor das Verfahren beginnt. Um die Skelettmuskulatur zu isolieren, bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: P-B-S-P-B-S mit 10 Millimolar EDTA, achtfach Mitochondrien-Puffer, Isolationspuffer eins oder IB eins, Isolationspuffer zwei oder IB zwei sowie Versuchspuffer oder eb.Siehe den beigefügten schriftlichen Protokollabschnitt für Anweisungen. Als Nächstes schalten Sie die Zentrifuge ein und stellen sie auf vier Grad Celsius. Schalten Sie ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius.In einem geeigneten Behälter drei 10-Milliliter-Bechergläser, einen Potter-Elvehjem-Homogenisator, Gewebemörser, kleine chirurgische Scheren und 10 Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis legen. Alles muss während des gesamten Experiments eiskalt gehalten werden. IB eins und IB zwei auf Eis legen und EB in ein warmes Wasserbad stellen.Dann geben Sie die folgenden Lösungen zu den drei Bechern auf Eis: Becher eins, 10 Milliliter PBS; Becher zwei, 10 Milliliter P-B-S-E-D-T-A; Becher drei, drei Milliliter ib. Euthanasieren Sie eine Ratte gemäß den von Ihrem lokalen institutionellen Tierversuchsausschuss genehmigten Verfahren.Isolieren Sie anschließend schnell 250 bis 500 Milligramm Skelettmuskel mit einer Pinzette und einer Mayo-Klinik-Schere. Spülen Sie ihn in Becher eins, überführen Sie ihn dann in Becher zwei, um den Muskel zu homogenisieren. Überführen Sie ihn zuerst in Becher drei und zerkleinern Sie ihn schließlich mit der Schere. Überführen Sie die Lösung in den Potter-Elvehjem-Homogenisator und homogenisieren Sie den Muskel mithilfe eines motorisierten Stößels zehnmal, wobei das Gefäß stets auf Eis gehalten wird. Anschließend überführen Sie das Homogenat in vorab gekühlte 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren 10 Minuten bei 700 × g und 4 °C. Überführen Sie das überstehende S-Überstand in ein neues vorab gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen und verwerfen Sie den Pellet.Das S-Supernatant bei 10.500 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, das SNAT in ein neues vorbefülltes Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit SN eins und Muskeltyp Reese beschriften. Den Pellet in 500 Mikrolitern IB zwei suspendieren, anschließend bei 10.500 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Das Supernatant in ein neues vorbefülltes Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit SN zwei und Muskeltyp beschriften.Suspendieren Sie das endgültige mitochondriale Pellet in 100 Mikroliter IB zwei. Zentrifugieren Sie es kurz in einer Mini-Zentrifuge. Falls ein Pellet vorhanden ist, überführen Sie das Überstand in ein neues vorbefülltes Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden.Die Kalibrierung der Elektrode kann während der mitochondrialen Isolierung durchgeführt werden. Zunächst 100 Milliliter destilliertes Wasser in einen 250-Milliliter-Kolben geben und 20 Minuten lang kräftig rühren. Um das Wasser mit atmosphärischem Gas zu equilibrieren, bedecken Sie die GRAT-Elektrode mit einigen Tropfen 50%igem Kaliumchlorid.Als Nächstes ein kleines Stück blaues Rizla-Filterpapier auf die Elektrode legen. Dann ein Stück PTFE-Membran darauf.Bringen Sie den inneren Ring mit Hilfe des Ringapplikators auf und setzen Sie anschließend den äußeren Ring in die Elektrodennut ein. Schließen Sie die Elektroden an und montieren Sie die größere Kunststoffringbasis, die Mitochondrienkammer und die Wasserschläuche. Schalten Sie die GRAT-Boxen ein und starten Sie die GRAS-Software.Geben Sie das equilibrierte Wasser in die mitochondriale Kammer. Fügen Sie dann einen Rührstab hinzu, um den Rührstab einzuschalten. Klicken Sie auf Hardware.Dann rühren Sie mit einer Geschwindigkeit. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 60 ein und klicken Sie auf. Beginnen Sie anschließend ein neues Experiment.Klicken Sie auf Kalibrieren und anschließend auf Flüssigphasenkalibrierung. Ändern Sie bei Box eins die Temperatur auf 37 Grad Celsius und klicken Sie zweimal auf OK. Wenn „Überschreiben“ zu „OK“ wechselt, klicken Sie darauf und öffnen Sie den Stickstoffgasbehälter.Bringen Sie die mit dem Stickstofftank verbundene Spitze in die Kammer ein und stellen Sie den Sauerstoffgehalt auf null ein. Klicken Sie auf „Okay“, wenn der Überschreibungsmodus beendet ist. Aspirieren Sie das Wasser und geben Sie 500 µL EB in die mitochondrialen Kammern.Verschließen Sie die Kammer mit einem Kolben. Wenn mehrere Boxen verwendet werden, wiederholen Sie den Vorgang ab dem Kalibrierschritt für jede Box. Starten Sie ein neues Experiment und lassen Sie es etwa eine Minute lang laufen.Um das Signal zu stabilisieren, geben Sie das notwendige Volumen der Mitochondrien-Suspension hinzu, um in jeder Kammer 150 Mikrogramm zu erreichen. Markieren Sie den Vorgang und lassen Sie es eine Minute laufen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter warme 250 Millimolar Glutamat, 125 Millimolar Malat hinzu, um eine Endkonzentration von 5 Millimolar Glutamat, 2,5 Millimolar Malat zu erreichen, markieren Sie diesen Schritt und lassen Sie es eine Minute lang laufen.Dies wird als Zustand zwei definiert. Fügen Sie anschließend 7,5 µL einer 10 mM aDP-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 150 µM zu erreichen. Markieren Sie dann und lassen Sie es 30 Sekunden laufen.Dies wird als Zustand drei definiert. Geben Sie weitere 7,5 µL 10 mmolarer DP-Markierung hinzu und lassen Sie die Reaktion 1,5 Minuten laufen. Fügen Sie 0,5 µL kalten 10 mmolaren Oligomycins hinzu, um eine Endkonzentration von einem µmolaren Markierung zu erreichen, und lassen Sie die Reaktion drei Minuten lang laufen.Dies wird als Zustand vier definiert. Geben Sie einen Mikroliter kaltes, 0,1 Millimolar FCCP hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Mikromolar zu erreichen, und lassen Sie RUM drei Minuten lang inkubieren. Dies wird als Zustand fünf definiert.Wenn Sie fertig sind, beenden und speichern Sie das Experiment. Erfassen Sie die Atmungsraten mithilfe der Raft-Software. Geben Sie den Normalisierungsfaktor ein.Wenn 150 Mikrogramm mitochondriales Protein hinzugefügt werden, beträgt der Normalisierungsfaktor 0,15. Berechnen Sie die normalisierten Atmungsaktivitäten für die verschiedenen Atmungszustände. Berechnen Sie das Atmungskontrollverhältnis (Respiratory Control Ratio, RCR), indem Sie Zustand drei durch Zustand vier dividieren.Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs durch Mitochondrien der Skelettmuskulatur. Nachdem das Elektroden-Signal stabilisiert ist, wird die Mitochondrienprobe in die GRAT-Kammer gegeben. Der Zustand zwei der Atmung beginnt mit der Zugabe von Glutamat und Malat.Die Zugabe von A DP erhöht den Sauerstoffverbrauch. Definition von Zustand drei. Die Atmung erfolgt, während A TP-Synthase durch die Zugabe von Oligomycin blockiert ist, um die Atmung im Zustand vier zu erhalten.Schließlich wird FCCP hinzugefügt, um die mitochondriale Atmung zu entkoppeln. Dieses Diagramm zeigt repräsentative Sauerstoffverbrauchsraten für die Zustände 2, 3, 4 und 5. Für jedes Experiment wird das Atmungs-Kontroll-Verhältnis (Respiratory Control Ratio, RCR) berechnet.Ein RCR-Wert über vier gilt als Hinweis auf eine leistungsfähige mitochondriale Präparation. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, mitochondriale Proben stets auf Eis zu halten. Nach Abschluss dieses Verfahrens.Andere Methoden wie Western Blots können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich des Gehalts an mitochondrialen Proteinen zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien aus Skelettmuskel isoliert sowie die mitochondriale Atmung untersucht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Hier präsentieren wir eine Modifikation einer zuvor berichteten Methode, die die Isolierung von qualitativ hochwertigen und gereinigten Mitochondrien aus kleineren Mengen von Maus-Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Verfahren führt zu hochgradig gekoppelten Mitochondrien, die während mikrotiterplattenbasierter Respirometirc-Assays mit hoher Funktion atmen.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Hier wird eine Quadrizeps-Muskelprobe von einem anästhesierten Schwein entnommen und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Anschließend werden die Atemfrequenzen der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I, II und IV mittels hochauflösender Respirometrie bestimmt.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondrien sind wichtige Stoffwechselorganellen, die eine hohe phänotypische Plastizität in der Skelettmuskulatur aufweisen. Der Import von Proteinen aus dem Zytosol ist ein kritischer Weg für die Organellenbiogenese, der für die Expansion des Retikulums und die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion unerlässlich ist.  Daher dient der Proteinimport als Barometer für die Zellgesundheit.

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Analyse von respiratorischen Superkomplexen, wenn nur geringe Mengen an Proben zur Verfügung stehen.

Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben 

Bioenergetische und metabolomische Studien an Mitochondrien haben ihre facettenreiche Rolle bei vielen Krankheiten gezeigt, aber die Isolierungsmethoden für diese Organellen variieren. Die hier beschriebene Methode ist in der Lage, hochwertige Mitochondrien aus mehreren Gewebequellen zu reinigen. Die Qualität wird durch Atemkontrollverhältnisse und andere Metriken bestimmt, die mit hochauflösender Respirometrie bewertet werden.

Robuste mitochondriale Isolierung aus Herzgewebe von Nagetieren 

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Verfahren zur enzymatischen Dissoziation Oberfläche Kennzeichnung und Reinigung mittels Durchflusszytometrie von fibro / adipogene und myogenen Vorläuferzellen aus murinen Skelettmuskel.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Lernen Sie die Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur für Stoffwechselforschung. Diese Methode ermöglicht die Messung der mitochondrialen Atmung und Sauerstoffverbrauchsanalyse.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

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