Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit Hilfe eines in vitro homologen Rekombinationsassays auf spezifische Varianten im BRCA-Eins-Protein zu testen. Dies wird erreicht, indem das endogene Wildtyp-BRCA-1-Protein durch die zu testende Variante durch Transfektion sowohl kurzer interferierender RNA, spezifisch für BRCA-eins, als auch eines Plasmids zur Reexpression von Test-BRCA-1-Variantenproteinen in Zellen in einem zweiten Schritt ersetzt wird, wobei die kurze interferierende RNA und das Plasmid für die Expression der mutierten BRCA-Eins-Proteine zusätzlich zu einem Plasmid zur Expression des ISCE-1-Proteins RET-reseziert werden. die DNA-Schäden an einer bestimmten Stelle im DNA-Genom der Testzelle verursacht. Anschließend werden die Zellen zwei bis drei Tage lang inkubiert, um die DNA-Schädigung und -Reparatur zu ermöglichen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, ob spezifische Proteinvarianten des BRCA-Eins-Proteins bei der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination auf der Grundlage einer durchflusszytometrischen Analyse von GFP-exprimierenden Zellen funktionieren.

Diese Technik kombiniert zwei etablierte Methoden, um ein vielseitiges System zur Analyse spezifischer Proteinvarianten bei der Reparatur von DNA-Schäden durch homologe Rekombination zu schaffen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass zuvor etablierte Methoden auf Zelllinien beruhten, die einen genetischen Knockout von BRCA one aufwiesen. Wir verwenden eine besser handhabbare Zelllinie, die von HELOC-Zellen abgeleitet ist und eine BRC-Depletion durch RNA-Interferenz des endogenen Proteins und eine Rückgabe des Testproteins in diesen Zellen ermöglicht.

Jetzt können wir mit der Expression einer Variante des BRC-Eins-Proteins auf homologe Rekombination testen. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit dem übermäßigen Zelltod während des Eingriffs. Es ist wichtig, dass die Transsektionsbedingung sorgfältig eingestellt wird, um die Wirkung der Rekombinationsreaktion zu maximieren und gleichzeitig die Zytotoxizität zu begrenzen.

Vor Beginn dieses Protokolls wurde die hela DR 13 neunzellige Linie durch Durchtrennung von hela-Zellen mit P-D-R-G-F-P etabliert. Die Zelllinie wird auf 10 Zentimeter großen Petrischalen in purem Mycin zur Selektion stabil transfizierter Zellen beibehalten. Das Rekombinationssubstrat im P-D-R-G-F-P-Plasmid und in den stabilen Transformanten enthält zwei inaktive Allele von GFP. Ein Allel ist inaktiv, da die 18-Basenpaar-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle für ISCE eingeschlossen ist.

In seiner kodierenden Sequenz erzeugt die Expression von ISCE in diesen Zellen einen doppelsträngigen DNA-Bruch oder DSB auf dem zweiten Allel des inaktiven GFP. Der Teil seiner Sequenz, der mit dem I SCE E korreliert; eine Stelle auf dem ersten Allel ist Wildtyp. Dieses zweite GFP-Allel kann als Sequenzspender für die homologe Rekombinationsreparatur des DSP fungieren und würde zu einem aktiven GFP-Allel führen, das am Tag vor der ersten Transfektion durch Durchflusszytometrie leicht nachgewiesen werden kann.

Besorgen Sie sich eine 10 Zentimeter große Schale von hela DR 13 neun Zellen, die mindestens zu 90 % konfluent sind, Trypsin Augen die Zellen in einem Milliliter für zwei bis drei Minuten. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie neun Milliliter D-M-E-M-F-B-S hinzufügen und die Zellsuspension durch Pipettieren gut mischen. Geben Sie 40 Mikroliter tryps-inisierte Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte in 0,5 Milliliter D-M-E-M-F-B-S und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Am ersten Tag sollten die Zellen zwischen 40 und 50 % konfluent sein. Beginnen Sie die Transfektion, indem Sie sowohl die irna mischen, um endogenes b RCA one als auch die b RCA one Mutante zu deprimieren, die Plasmid in optimalen Medien exprimiert. Kombinieren Sie dann die Nukleinsäuren mit der Lippe in einem optimalen Medium.

Fahren Sie mit der Lipektomie-Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers nach der Transfektion fort. Bringen Sie die Zellen zur Inkubation zurück. Ersetzen Sie das Medium vier bis sechs Stunden später durch ein Medium, das keine Antibiotika enthält.

Bringen Sie die Zellen am zweiten Tag über Nacht zur Inkubation zurück. Trypsin wird den Zellen zugesetzt, indem nach einer kurzen Inkubation bei 37 Grad Celsius 0,3 Milliliter Trip-le-Trypsin-Reagenz in jede Vertiefung gegeben werden, lockern die Zellen durch Auf- und Abpipettieren der Zellen im Trypsin-Reagenz. Sobald Trypsin ist, werden die Zellen von der 24-Well-Platte auf eine Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern D-M-E-M-F-B-S übertragen, um die Tripsin-Aktivität zu stoppen.

Lassen Sie die Sechs-Well-Platte über Nacht unter den gleichen Bedingungen wie zuvor zwei Tage nach der ersten Transfektion inkubieren. Bereiten Sie das SIR A, die BRCA-Mutante, die Plasma-DNA exprimiert, und die ISCE-Mutante, die Plasmid exprimiert, in 62,5 Mikrolitern Optum vor. Mischen Sie diese Lösung mit 2,5 Mikrolitern LIPEKTOMIE 2060 und 2,5 Mikrolitern Optum.

Fahren Sie mit der Transfizierung der Zellen nach einer vier- bis sechsstündigen Inkubation fort. Ersetzen Sie das Medium durch D-M-E-M-F-P-S ohne Antibiotika. Bringen Sie die Zellen am sechsten Tag wieder in den Inkubator zurück.

Trypsin ist die Zellen in jeder Vertiefung durch Zugabe von 0,5 Millilitern Trip-e-Trypsin-Reagenz. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter D-M-E-M-F-B-S hinzufügen, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 U/min für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem D-M-E-M-F-B-S und analysieren Sie 10.000 Zellen pro Well auf GFP-Expression.

Bei der Durchflusszytometrie werden einzelne lebende Zellen anhand von Vorwärts- und Größenstreuparametern gegattet. GFP-positive Zellen werden mit dem GFP-Fluoreszenzdetektor gerichtet und die Ergebnisse werden als Histogramm dargestellt. Verbleibende Zellen können für die Fotografie durch Fluoreszenz neu plattiert werden.

Mikroskopie des gewünschten BRCA one reguliert den Weg zur Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen durch homologe Rekombination. Diejenigen Zellen, die durch homologe Rekombination repariert wurden, können mit der Fluoreszenzmikroskopie leicht nachgewiesen werden. Die Depletion von BRCA one durch RNAi führt zu einer starken Abnahme der detektierten GFP-positiven Zellen.

Die Ausgabe der FCA ist ein Histogramm mit der GFP-Intensität pro Zelle auf der x-Achse und der Anzahl der Zellen auf der y-Achse. In Ermangelung von transfizierten, ich SCE ein exprimierendes Plasmid. Es wurden keine GFP-positiven Zellen nachgewiesen.

Die Ergebnisse in den Spalten zwei bis sechs wurden alle von Zellen entnommen, in denen ISC eins, das Plasmid exprimierte, am dritten Tag transfiziert wurde. In einem typischen Satz von Ergebnissen aus einem einzigen Experiment sind 15,5 % der Zellen GFP-positiv, nachdem ich eine Expression von einer SCE und die Kontrolle der RNAi-Depletion für ein irrelevantes Gen durch Vergleich der Depletion von BRCA one und der Hinzufügung eines leeren Plasmidvektors durchgeführt habe. Reduktion der GFP-Umwandlung auf 0,7 %Zugabe von exogenem Wildtyp-BRCA-Eins, vollständig wiederhergestellte homologe Rekombination, nachgewiesen durch Gewinnung von 15 bis 16 %GFP-positiven Zellen.

In ähnlicher Weise Ausprägung einer anderen Variante von unbekannter Bedeutung. Die BRCA one I 21 B-Mutation vollständig wiederhergestellt. BRCA, eine abhängige homologe Rekombinationsfunktion, die der BRCA one M 18 T-Mutante zurückkommt, hatte einen ähnlichen Effekt wie die Vektorkontrolle.

Da diese Variante in ähnlichen Konzentrationen wie das endogene Protein exprimiert wird, deutet dies darauf hin, dass die BRCA one M 18 T-Variante in der homologen Rekombination nicht funktionsfähig ist. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, das Wachstum der Zellen zu überwachen, dass die Zellen langsam und bei geringer Konfektion wachsen und die Menge der verwendeten Transfektionsmischung reduziert werden muss. Es ist auch wichtig, das Transfektionsmedium rechtzeitig zu entfernen.

Wir stellen fest, dass in den Tagen nach der Transfektion eine hohe Zytotoxizität vorliegt, wenn Antibiotika in das Medium aufgenommen werden. Aus diesem Grund fehlen dem gesamten Medium nach dem ersten Tag Antibiotika Nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Brustkrebsforschung den Weg, die Genetik von BRC-1-Varianten mit unbekannter klinischer Bedeutung in Krebskliniken zu erforschen.

Wir hoffen, dass der in dieser Arbeit entwickelte funktionelle BRC one Assay eine bessere Vorhersage der Auswirkungen von BRC one Varianten auf die Krebsprädisposition ermöglichen wird.