Name: Purifying Plasmid-DNA aus Bakterien-Kolonien mit dem Qiagen Miniprep Kit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Lernen Sie die Plasmid-DNA-Aufreinigung aus Bakterien mit dem Qiagen Miniprep Kit für die gerichtete Mutagenese. Diese Methode ermöglicht Forschern die Sequenzierung zur Verifizierung genetischer Modifikationen.

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purifying plasmid-dna aus bakterien-kolonien mit dem qiagen miniprep kit

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA Aufreinigung aus E. coli ist ein Kern-Technik für die molekulare Klonen. Kleine Reinigung (Miniprep) von weniger als 5 ml Bakterienkultur ist ein schneller Weg für Klon Überprüfung oder DNA-Isolierung, durch weitere enzymatische Reaktionen (Polymerase-Kettenreaktion und Restriktionsverdau) gefolgt. Hier haben wir das allgemeine Verfahren der Miniprep durch die QIAGEN QIAprep 8 Miniprep Kit, mit dem Ziel der Einführung dieser hoch effizienten Technik den allgemeinen Anfänger für molekularbiologische Techniken auf Video aufgezeichnet. Das gesamte Verfahren ist auf alkalischen Lyse von E. coli Zellen, die durch Adsorption von DNA an Silica folgte in der Gegenwart von hohen Salz. Es besteht aus drei Schritten: 1) Vorbereitung und Abwicklung von einer bakteriellen Lysat, 2) Adsorption von DNA an die Membran QIAprep, 3) Waschen und Elution von Plasmid-DNA. Alle Schritte werden ohne den Einsatz von Phenol, Chloroform, CsCl, Ethidiumbromid, und ohne Alkohol-Fällung durchgeführt. Es dauert in der Regel weniger als 2 Stunden, um die gesamte Vorgang zu beenden.

Purifying Plasmid-DNA aus Bakterien-Kolonien mit dem Qiagen Miniprep Kit

Die Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli ist eine Kerntechnik für das molekulare Klonieren. Die Reinigung im kleinen Maßstab (Miniprep) aus weniger als 5 ml bakterieller ...

Ich komme aus dem Labor von Mike Halen, Abteilung für Physiologie und Biophysik, University of California, Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man mit einem Kollagen-Mini-Präparat DNA aus Bakterien reinigt. Dies führe ich als einen Schritt eines gezielten Mutagenese-Experiments durch.Nachdem ich das Plasmid erhalten habe, werde ich das Insert sequenzieren, um zu überprüfen, ob die ausgewählten Klone die gewünschten Mutationen enthalten. Bevor wir die Minipräparation durchführen, fassen wir kurz zusammen, was wir gestern gemacht haben. Um Bakterien anzuziehen, muss ich zunächst fünf Milliliter LB-Medium in einzelne Reagenzgläser impfen.Und wie Sie sehen können, ist das Medium klar, bevor wir Bakterien in das Reagenzglas geben. Dann verwende ich PERS, um eine einzelne Kolonie von einer Airb-Platte zu impfen, und wechsle jedes Mal den Pipettenspitzen, um eine Kontamination auszuschließen. Anschließend stelle ich die Röhrchen in einen Schüttelinkubator und lasse sie bei 300 U/min mindestens acht Stunden lang wachsen, normalerweise über Nacht.Es gibt drei wichtige Puffer aus dem Kollagen-Mini-Präparationskit. Dies sind P eins, P zwei und N drei. Wir stellen P eins normalerweise bei vier

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für eine effiziente parallele Klärung und Plasmid-DNA Aufreinigung...

Optimierte Reinigung von Plasmid-DNA aus prokaryontischen Kulturen

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Eine neuartige halbautomatische Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für den Einsatz mit umweltbedingten Geflügelproduktionsproben wurde entwickelt und zeigte Verbesserungen gegenüber einer herkömmlichen mechanischen und enzymatischen Extraktionsmethode in Bezug auf die quantitativen und qualitativen Schätzungen der gesamten Bakteriengemeinschaften.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

Der linear kovalent geschlossene (LCC) DNA-Minivektor (DNA-Ministring) ist ein nicht-viraler Gentransfervektor mit hoher Transfektionseffizienz und ist für jede DNA-Verabreichungsanwendung relevant. Das Produktionssystem ist einfach, schnell und in vivo skalierbar. Das folgende Protokoll enthält eine visuelle Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Herstellung von DNA-Ministrings.

Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings

Dieser Artikel stellt eine empfindliche Methode namens Circle-Seq zur Reinigung extrachromosomaler zirkulärer DNA (eccDNA) vor. Die Methode umfasst die Aufreinigung von Säulen, die Entfernung verbleibender linearer chromosomaler DNA, die Rolling-Circle-Amplifikation und die Hochdurchsatz-Sequenzierung. Circle-Seq ist anwendbar für das genomskalige Screening von eukaryotischer eccDNA und die Untersuchung von Genominstabilität und Variation der Kopienzahl.

Genomweite Reinigung von extrachromosomale zirkuläre DNA aus eukaryotischen Zellen

Hier präsentieren wir die Chimären-Assemblierung durch Plasmid-Wiedergewinnung und Restriktionsenzym-Insertion (CAPRRESI), ein Protokoll, das auf der Insertion von Restriktionsenzymstellen in Synonym-DNA-Sequenzen und funktionelle Plasmid-Recovery basiert. Dieses Protokoll ist eine schnelle und kostengünstige Methode zum Fixieren von Protein-kodierenden Genen.

CAPRRESI: Chimären Assembly durch Plasmid Recovery und Restriktion Enzym Site Insertion

Dieses Protokoll beschreibt die Durchsatz-Plasmidtransfektion von Säugetierzellen in einer 384-Well-Platte mit akustischer Tröpfchenauswurftechnologie. Die zeitaufwändige, fehleranfällige DNA-Dosierung und Multiplexing, aber auch die Transfektionsreagenz-Dosierung, sind softwaregesteuert und werden von einem Nanospenderdurchgeführt ausgeführt. Die Zellen werden dann in diesen vorgefüllten Brunnen gesät.

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Hier stellen wir Protokolle für die Arbeit mit Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vor, die das Wachstum, die Plasmidtransformation, die Kolonie-PCR, die fluoreszierende Reporterproteinmessung und die begrenzte Plasmid-Minivorbereitung detailliert beschreiben, sowie häufige Probleme und Fehlerbehebung. Diese Protokolle ermöglichen die Messung von Reporterproteinen in DSM20016 oder die Bestätigung durch Kolonie-PCR, wenn kein Reporter beteiligt ist.

Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) wird häufig für die klinische und präklinische Genverabreichung eingesetzt. Eine unterschätzte Anwendung für rAAVs ist die robuste Transduktion von kultivierten Zellen, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Für Forscher, die neu in der rAAV sind, stellen wir ein Protokoll für das Klonen von Transgenkassetten, die Produktion von Rohvektoren und die Transduktion von Zellkulturen zur Verfügung.

Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Die aktuelle Studie beschreibt einen Workflow für die Nanoporensequenzierung von Plasmiden, wenn die chromosomale Sequenz bereits bekannt oder von Interesse ist. Ein anfänglicher Plasmid-DNA-Anreicherungsschritt sorgt für eine optimale Plasmidsequenztiefe und maximiert die Anzahl der pro Flusszelle sequenzierbaren Proben.

Langlesen-Plasmid-Sequenzierung und -Montage mit Workflows auf Basis von Nanoporensequenzierungen

Lernen Sie die Plasmid-DNA-Aufreinigung aus Bakterien mit dem Qiagen Miniprep Kit für die gerichtete Mutagenese. Diese Methode ermöglicht Forschern die Sequenzierung zur Verifizierung genetischer Modifikationen.

Purifying Plasmid-DNA aus Bakterien-Kolonien mit dem Qiagen Miniprep Kit

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