Purifying Plasmid-DNA aus Bakterien-Kolonien mit dem Qiagen Miniprep Kit

Ich komme aus dem Labor von Mike Halen, Abteilung für Physiologie und Biophysik, University of California, Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man mit einem Kollagen-Mini-Präparat DNA aus Bakterien reinigt. Dies führe ich als einen Schritt eines gezielten Mutagenese-Experiments durch.

Nachdem ich das Plasmid erhalten habe, werde ich das Insert sequenzieren, um zu überprüfen, ob die ausgewählten Klone die gewünschten Mutationen enthalten. Bevor wir die Minipräparation durchführen, fassen wir kurz zusammen, was wir gestern gemacht haben. Um Bakterien anzuziehen, muss ich zunächst fünf Milliliter LB-Medium in einzelne Reagenzgläser impfen.

Und wie Sie sehen können, ist das Medium klar, bevor wir Bakterien in das Reagenzglas geben. Dann verwende ich PERS, um eine einzelne Kolonie von einer Airb-Platte zu impfen, und wechsle jedes Mal den Pipettenspitzen, um eine Kontamination auszuschließen. Anschließend stelle ich die Röhrchen in einen Schüttelinkubator und lasse sie bei 300 U/min mindestens acht Stunden lang wachsen, normalerweise über Nacht.

Es gibt drei wichtige Puffer aus dem Kollagen-Mini-Präparationskit. Dies sind P eins, P zwei und N drei. Wir stellen P eins normalerweise bei vier Grad auf, da es RNAs enthält. P zwei lassen wir bei Raumtemperatur stehen, und N drei bereiten wir erst kurz vor dem Experiment nach acht Stunden vor.

Wie Sie sehen, ist das Medium nun trüb, da Bakterien darin wachsen, und ich werde fünf Mikroliter des Mediums auf eine weitere Platte auftragen. Sobald ich die Klone verifiziert habe, kann ich direkt zu den Bakterien zurückgehen, ohne eine erneute Transformation durchführen zu müssen. Nachdem wir das Medium zentrifugiert haben, sehen Sie einen schönen Bakterienpellet am Boden des Röhrchens, und wir werden das Überstand in Bleichmittel abgießen, um jegliche Umweltkontamination zu vermeiden, während der Pellet weiterhin vorhanden ist.

Jetzt füge ich den Puffer P1 zu den Bakterienplatten hinzu. P1 ist ein Resuspensionspuffer zur Re-Suspension der Bakterien. Anschließend pipettiere ich die Lösung mehrmals auf und ab, um die Bakterien gründlich mit dem Puffer zu vermischen.

In diesem Stadium möchten Sie keine Bakterienkolonien in der Lösung sehen. Nun werde ich die resuspendierten Bakterien in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführen. Ich beschrifte meine Röhrchen immer, damit ich sie nachverfolgen und wissen kann, welche Lösung von welchem Klon stammt.

Jetzt gebe ich den Puffer P2 zu jedem Röhrchen hinzu, und Puffer P2 ist ein Lysepuffer zum Lyse von Bakterien. Nachdem ich den Puffer P2 hinzugefügt habe, sehen Sie, dass die Lösung noch nicht klar ist. Nun invertiere ich alle Röhrchen mehrmals, damit sich die Lösung gut vermischt.

Und nun können Sie sehen, dass die Lösung klar wird. Jetzt gebe ich den Puffer N3 zu und in jedes Reagenzglas den Puffer M3, der der Neutralisierungspuffer ist. Sobald ich den Puffer N3 hinzugebe, sehe ich sofort die Proteinfällung, aber ich werde die Reagenzgläser dennoch mehrmals umstülpen, um die Lösung gründlich zu mischen.

Nachdem wir die Lösung gründlich gemischt haben. So sollte es aussehen, nachdem ich Puffer und drei hinzugefügt habe. Nun werde ich das SGE verwenden, um die Proteinpräzipitation während der Zentrifugation für 10 Minuten abzuzentrifugieren. Ich habe eine Cal VAC six s aufgebaut.

Ich bringe alle Teile der Reihe nach zusammen und verbinde sie anschließend mit einem Vakuumsystem. Nun befestige ich die Cal-Prep-Hilfsvorrichtung, den Bügel, am Verteiler. Heute führen wir nur eine Durchführung durch, daher blockiere ich die anderen Schächte.

Wir haben also ein gutes Vakuum. Wie Sie sehen können, habe ich den Bügel entsprechend meinen Röhrchen beschriftet, und sobald ich das Vakuum einschalte, liegt ein gutes Vakuum vor. Okay, nach dem Zentrifugieren des Röhrchens sehen Sie das Protein-Pellet am Boden, während die DNA weiterhin im Überstand gelöst sein sollte.

Jetzt übertragen wir das überstehende Flüssigkeitsvolumen, das DNA enthält, auf die Cow-Prep-Streifen. Ich sollte erwähnen, dass wir immer die Pipettenspitzen wechseln müssen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Nun schalte ich das Vakuum ein. Jetzt schalte ich das Vakuum aus und gebe Puffer PB hinzu, um den Streifen zu waschen, auf dem sich die DNA derzeit in dem Filter befindet.

Jetzt gebe ich die Lösung PB auf den Streifen, um ihn zu waschen, und die Streifen enthalten weiterhin DNA in der Membran. Dieses Mal muss ich die Pipettenspitzen nicht wechseln, solange ich den Streifen nicht berühre. Nun gebe ich den Puffer P auf den Streifen, genauso wie zuvor den Puffer PB.

Und ich werde dies zweimal durchführen, nachdem ich das Vakuum eingeschaltet habe. Wie Sie sehen, läuft die P-Lösung gerade durch den Streifen, und wir lassen das Vakuum weitere fünf Minuten lang eingeschaltet, um sicherzustellen, dass der Filter gut getrocknet ist. Nach fünfminütigem Vakuum entnehmen Sie den Streifen aus der Box und wickeln ihn in Kim-Wipes ein. Schlagen Sie ihn gegen den Tisch, um den restlichen P-Puffer zu entfernen.

Und nun können Sie sehen, dass nur wenige Tropfen des P-Puffers vorhanden sind und die DNA sollte weiterhin in der Säule enthalten sein. Hier sind die Sammelmikroröhrchen. Ich habe sie entsprechend dem Streifen beschriftet.

Jetzt öffne ich den Auto-Vakuumextraktor und setze ihn mit den Sammel-Mikroröhrchen wieder zusammen, wobei ich sicherstelle, dass die Halterung mit den Mikroröhrchen übereinstimmt. So sollte das Manifold derzeit aussehen. Hier sehen Sie das Vakuum-Manifold, das für die Elution von DNA vom Streifen in das Mikroröhrchen vorbereitet ist.

Der Streifen befindet sich oben und darunter direkt die Röhre, die auf dieselbe Weise beschriftet ist. Nun entweder sterilem Wasser ohne Vakuum zum Streifen hinzufügen und eine Minute stehen lassen. Dieses Mal, wenn das Vakuum längere Zeit anliegt, wie Sie sehen können, fließt das Wasser durch den Streifen und gelangt in die Sammel-Mikroröhrchen.

Das Wasser enthält die DNA. Ich lasse außerdem das Vakuum für eine Weile eingeschaltet, um sicherzustellen, dass das gesamte Wasser gesammelt wird. Hier sind die Sammelmikroröhrchen mit der DNA-Lösung nach diesem Schritt.

Hallo, ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Calcium-Mini-Präp-Kit verwendet, um NA aus Bakterien zu reinigen. Nun habe ich das Insert sequenziert, um die richtigen Klone zu verifizieren, und ich sollte erwähnen, dass diese Methode verwendet wird. Die Menge an DNA liegt gewöhnlich im Mikrogramm-Bereich.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten. Vielen Dank fürs Zuschauen.