Name: Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Gehirnen für Whole-Cell-Recordings. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Neuronen mittels Patch-Clamp-Technik und GFP-Visualisierung.

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Diese Arbeit wurde durch ein NIH NS27501 zu DKOD unterstützt. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeiten wurde durch eine HHMI Professor Programm Grant DKOD zur Verfügung gestellt.

I. Präparation Gehirne von Erwachsenen fliegen <ol><li> Legen Sie einen kleinen Tropfen (~ 100 ul) zu sezieren Lösung in der Mitte einer 35 mm Petrischale. </li><li> Fangen erwachsenen Weibchen mit Aspirator. Unter Präpariermikroskop, verwenden Sie zwei Spritzen-Nadeln, die Fliege zu enthaupten. </li><li> Place-Kopf in einen kleinen Tropfen zu sezieren Kochsalzlösung (mit Papain hinzugefügt) in einer Petrischale. </li><li> Position Kopf mit Rüssel mit Blick auf Boden der Schale. </li><li> Halten Sie die Nagelhaut Deckung der linken Facettenauge mit Nadel 1. Machen Sie einen diagonalen Schnitt, der aus dem dorsalen erstreckt sich auf die Ventralfläche mit Nadel 2, nur medial Nadel 1. </li><li> Halten Sie die Mundwerkzeuge mit Nadel 1 und die Verwendung Nadel 2 eine horizontale Schnitt, der von der ventralen Fläche des linken Auges erstreckt sich auch auf dem rechten Auge, auf der Ebene der Basis des Rüssels zu machen. </li><li> Halten Sie die Nagelhaut für die richtige Mischung Auge mit Nadel 1. Machen Sie einen diagonalen Schnitt, der aus dem dorsalen erstreckt sich auf die Ventralfläche mit Nadel 2, knapp medial der Nadel 1. </li><li> Drehen Sie den Kopf so, dass der rostral Seite auf der Petrischale Oberfläche ist. Setzen Sie die Nadel 1 zwischen den rostralen Kutikula und Gehirn, und verwenden Sie Nadel 2, den gleichen Weg wie die erste Nadel zu folgen. Im Idealfall wird die Kapsel abziehen aus dem Gehirn mit den beiden optischen Loben, da diese anzubringen sind bei der Stabilisierung des Gehirns für die Aufnahme wichtig. </li><li> Die Luftröhre, Luftsäcke und anderen Bindegeweben sind vorsichtig mit zwei feinen Spitze Pinzette. </li><li> Whole Dissektion sollte 3-10 Minuten </li></ol> II. Montage des ZNS <ol><li> Das Gehirn ist, um die Aufnahme Kammer mit einer gelben Spitze Pipette übertragen. </li><li> In der Aufzeichnung Kammer, ist das Gehirn, indem sie die Platin-Rahmen, so dass zwei feine Fadenkreuz Kontakt mit dem Gewebe an der Kreuzung zwischen der optischen Loben und zentrale Hirnregion stabilisiert. </li><li> Jedes Gehirn ist berechtigt, in der Aufnahme Kammer mit kontinuierlicher Perfusion mit Sauerstoff Kochsalzlösung (95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid) ruhen für mindestens 10 Minuten. Perfusion der Kammer mit Sauerstoff Kochsalzlösung während der Aufzeichnungsdauer fortgesetzt. Die Vorbereitung ist sichtbar mit einem aufrechten Mikroskop (Axioskop 2FS; Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit einer festen Bühne und ein 40x Wasserimmersionsobjektiv (Achroplan; numerische Apertur, 0,8; Zeiss) und Nomarski-Optik. GFP wurde mit einem BP 505-530 Fluoreszenzfilter angesehen. </li></ol> III. Elektrophysiologie <ol><li> Pipetten von 8-14 MOhm sind für die gesamte Zelle Aufnahmen verwendet </li><li> Current-Clamp-und Voltage-Clamp-Aufnahmen werden mit Hilfe einer List EPC7 oder Axopatch 200B Verstärker, ein Digidata 1322a DA-Wandler (Molecular Devices, Foster City, CA), ein Dell Dimension 8200-Computer (Dell Computer, Round Rock, TX), und pClamp 9-Software (Molecular Devices). </li></ol>

<ol><li>Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+synaptic+transmission+in+Adult+Drosophila+Kenyon+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ.</a> Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
</ol>

Die isolierte ganze Gehirn Vorbereitung illustrieren wir in diesem Video ermöglicht die Beurteilung der zellulären Mechanismen, die Erregbarkeit und synaptische Übertragung in identifizierten Neuronen, einschließlich derjenigen in den olfaktorischen Verarbeitung Wege, in der erwachsenen Drosophila Gehirn (Gu und O Dowd, 2006). Dieser Ansatz ist komplementär zu der neuronalen Aktivität im Gehirn der intakten, erwachsenen Drosophila (Wilson et all 2004) Studie, in der gleichen Weise Aufnahmen von Neuronen im Gehirn von Säugetieren Scheibe sin...

<table><tbody><tr><td>#5 Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>No. 11251-10</td><td>Vorsicht, die feinen Spitzen der Pinzette niemals beschädigen</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Reagenz</td><td>Worthington Biochemical</td><td>3126</td><td>20 U/ml, aktiviert durch 1 mM L-Cystein</td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Modell SMZ-2B: C-PS</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Ausgestattet mit flexiblen Glasfaserleuchten in flachem Winkel positioniert</td></tr><tr><td>Nadel &amp;amp; Spritze </td><td></td><td>PrecisionGlide&amp;#174;?, Becton Dickinson Co</td><td>305175 &amp;amp; 309602</td><td>Preisgünstig und langlebig</td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Ausgestattet mit feststehendem Objekttisch, 40X-Wasserimmersionsobjektiv, Nomarski-Optik und Fluoreszenzlampe</td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker</td><td>200 B</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata D-A-Wandler </td><td>1322A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole cell recordings von brain of adult drosophila

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In diesem Video zeigen wir, das Verfahren zur Isolierung von ganzen Gehirnen von adulten Drosophila in Vorbereitung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen. Wir beginnen mit einer Beschreibung der Anatomie-Lösung und der Einnahme der erwachsenen Frauen in unseren Studien verwendet. Das Verfahren für das Entfernen der gesamten Gehirns intakt, sowohl Sehlappen, dargestellt. Dissection der darüberliegenden Luftröhre wird ebenfalls angezeigt. Das isolierte Gehirn ist nicht nur klein, sondern braucht besondere Pflege im Umgang mit in dieser Phase, um Schäden an den Nervenzellen zu verhindern, von denen viele in der Nähe der äußeren Oberfläche des Gewebes. Wir zeigen, wie eine spezielle Halterung haben wir benutzt, um das Gehirn in der Aufnahme Kammer zu stabilisieren. Ein Standard-Elektrophysiologie Einrichtung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen oder Paaren von Neuronen verwendet wird. Ein fluoreszierendes Bild, durch die Aufnahme Mikroskop betrachtet, aus einer GAL4 Linie fahren GFP-Expression (GH146) zeigt, wie Projektion Neuronen (PNs) in der Live-Gehirn identifiziert. Eine hohe Leistung Nomarski Bild zeigt eine Ansicht eines einzelnen Neurons, die für ganze Zelle Aufnahme wird angestrebt. Wenn das Gehirn erfolgreich ist ohne Beschädigung entfernt werden, sind die Mehrheit der Neuronen spontan aktiv, feuern Aktionspotentiale und / oder ausstellen spontane synaptische Eingang. Diese in-situ-Herstellung, in der ganzen Zelle die Aufnahme von identifizierten Neuronen in das gesamte Gehirn mit genetischen und pharmakologischen Manipulationen kombiniert werden können, ist ein nützliches Modell für die Erkundung zellulären Physiologie und Plastizität im adulten ZNS.

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Isolierung von ganzen Gehirnen von adulten Drosophila in Vorbereitung für die Aufnahme von einzelnen Neuronen mit Standard ganzen Zelle-Technologie. Es enthält Bilder von GFP-markierten Zellen und Neuronen während der Aufnahme angesehen.

Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Isolierung ganzer Gehirne von adulten Drosophila zur Vorbereitung für Ableitungen von einzelnen Neuronen. Wir beginnen mit ...

Mein Name ist, ich bin wissenschaftliche Assistentin in der Abteilung für Anatomie und Neurobiologie an der UC R one. Heute werde ich Ihnen das Verfahren erklären, wie man eine Ganzpräparataufnahme am PHA-Gehirn durchführt. Der entscheidende Schritt dieser Vorbereitung besteht darin, wie man den Kopf entkappt, das Gehirn entfernt und das TRICARE-System sowie das G-klare Gewebe von der Oberfläche des Gehirns ablöst. Heute werde ich Ihnen zeigen, wie man eine Schnittlösung für die Ganzzellableitung eines adulten Soft-Lab-Gehirns herstellt.Der erste Schritt besteht darin, die zweite Lösung herzustellen, die wirklich wichtig ist, um eine gute Vorbereitung für das erwachsene Gehirn zu gewährleisten. Zunächst gebe ich fünf Milliliter der Aufzeichnungslösung in dieses Zentrifugenröhrchen. Und dann habe ich hier ein weiteres kleines Röhrchen.Ich werde einen Mill der aufgezeichneten Lösung in dieses Reagenzglas geben, etwas Sing hinzufügen und dann diese Sing-Lösung herstellen. Ich werde sie mehrmals auf- und abpipettieren, um eine gute Sing-Lösung zu erhalten. Danach entnehme ich 100 Einheiten Pepane aus dieser Flasche.Dann gebe ich dieses Pepan in ein Zentrifugenröhrchen. Wie Sie hier seh

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

Dieses Video beschreibt, wie man das erwachsene Drosophila-Gehirn präpariert und isoliert – ein Verfahren, das notwendig ist, um das Organ sichtbar zu machen, das sonst von der Nagelhaut, dem Auge und dem Luftröhrengewebe verdeckt wird. Das Beispielprotokoll zeigt eine detaillierte Demonstration, die zu hochwertigen Präparaten führt, die für Immunfärbungen und bildgebende Verfahren in der Neurobiologie von Drosophila verwendet werden können.

Drosophila Dissektion des Gehirns von Erwachsenen: Eine Methode der Fliegenneurobiologie

Das Video zeigt die extrazelluläre Aufzeichnung der neuronalen Aktivität aus dem Zentralnervensystem (ZNS) von Drosophila-Larven. Das durchtrennte ZNS wird in einer Aufzeichnungskammer positioniert, und die elektrische Aktivität eines absteigenden Nervs wird aufgezeichnet, um die Ausgangsfeuerfrequenz zu bestimmen. Dann wird ein Prüfmittel eingeführt, und die Änderung der Brennhäufigkeit wird aufgezeichnet, um die erregende oder hemmende Wirkung des Mittels zu bestimmen.

Extrazelluläre Aufzeichnung der elektrischen Aktivität im zentralen Nervensystem der Drosophila

Scharfe Mikroelektroden ermöglichen eine genaue elektrophysiologische Charakterisierung der Photorezeptor- und visuellen Interneuronenleistung in lebenden Drosophila. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode qualitativ hochwertige Spannungsreaktionen einzelner Zellen auf kontrollierte Lichtstimulation aufzeichnen kann. Diese Methode ist ideal, um die neuronale Informationsverarbeitung in Facettenaugen von Insekten zu untersuchen.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Wir präsentieren eine Methode, die speziell auf das Bild des gesamten Gehirns von erwachsenen Drosophila während des Verhaltens und als Reaktion auf Reize zugeschnitten ist. Der Kopf ist positioniert, um den optischen Zugang zum gesamten Gehirn zu ermöglichen, während die Fliege ihre Beine und die Antennen, die Spitze des Proboscis bewegen kann, und die Augen sensorische Reize empfangen können.

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

Ein wesentliches Hindernis für die Untersuchung der zellulären Aktivität während kognitiver Prozesse wie Lernen und Gedächtnis ist die Verwendung von Anästhetika für die Vorbereitung von In-vivo-Bildgebung . Die Anästhesie beeinträchtigt das Kurzzeitgedächtnis und die Kognition in mehreren Modellen, einschließlich Drosophila. Diese Studie stellt eine einzigartige Methode zur Vorbereitung adulter Drosophila für die In-vivo-Bildgebung ohne Anästhesie vor.

Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

Lernen Sie die Präparation von Drosophila-Gehirnen für Whole-Cell-Recordings. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung einzelner Neuronen mittels Patch-Clamp-Technik und GFP-Visualisierung.

Whole Cell Recordings von Brain of Adult Drosophila

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