Name: Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Stammzellen aus murinen Speicheldrüsen mittels enzymatischer und mechanischer Verdauung. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Salisphären mit Stammzellcharakteristiken für regenerative Medizin.

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1. Regent Vorbereitung <ol><li> Buffer: 1% (w / v) Rinderserumalbumin in balanced salt Hank-Lösung </li><li> Rekonstituieren Enzyme. Hyaluronidase-Enzym: 40 mg / mL, in Puffer gelöst. Collagenase II: 23 mg / mL, in Puffer gelöst. Verwenden Sie frisch zubereitete Enzymlösungen frisch für jede Isolation. Wenn aufgelöst, Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung für die Verdauung. </li><li> 50 mM Calciumchlorid in destilliertem Wasser. Filter durch einen 0,2 uM Filter mit einer Porengröße zu sterilisieren. </li><li> Maus Speicheldrüse (MSG) Kulturmedium: DMEM: F12 mit Penicillin (100 IU / mL), Streptomycin (100 ug / mL), Glutamax (2 mM), epidermal growth factor-2 (20 ng / mL), Fibroblasten-Wachstumsfaktor -2 (20 ng / mL), N2 gegen Aufpreis (1%), Insulin (10 ug / ml) und Dexamethason (1 pM). </li></ol> 2. Mechanische und enzymatische Verdauung Tissue <ol><li> Wiegen Sie die seziert Speicheldrüsen. </li><li> Hacken Drüsen zu einem homogenen Brei mit sterilen gebogenen Dissektion Schere in einer kleinen Petrischale. </li><li> Sammeln Sie zerkleinerten Gewebes in 14 ml-Röhrchen mit 1 ml Puffer pro 80mg submandibularis Gewebe. Spülen Sie die Petrischalen sauber von Gewebe mit einigen der Puffer. </li><li> Add another 1 ml Puffer pro 80 mg Gewebe, von 25 ul Kollagenase II Enzymlösung, 25 ul Hyaluronidase Enzymlösung und 250 ul Calciumchlorid-Lösung pro 80 mg Gewebe gefolgt. Wenn die Arbeit mit großen Mengen von Gewebe, Schritte von 2,4 bis 2,9 in T25 Zellkulturflaschen für die Bequemlichkeit durchgeführt werden kann. </li><li> Inkubieren in einem Schüttel-Wasserbad bei 37 ° C für 20 Minuten. Entfernen Sie Rohre und verreiben mit einer Pipette auf Enzym gründlich mischen durch das Gewebe wieder. </li><li> Ersetzen Sie im Wasserbad für weitere 20 Minuten. </li><li> Sammeln Gewebe durch Zentrifugation bei 400 xg für 8 Minuten. Überstand. </li><li> Resuspendieren in 2 ml Puffer für je 80 mg Gewebe, und wiederholen Enzym und Calciumchlorid zusätzlich wie oben beschrieben. Inkubieren 20 Minuten in Schüttelwasserbad. Entfernen Sie Rohre und verreiben durch eine Pipette, um Enzyme gründlich zu mischen. </li><li> Inkubieren letzten 20 min in Schüttelwasserbad. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wie oben, Überstand verwerfen. </li></ol> 3. Waschschritte <ol><li> Resuspendieren je 80 mg Gewebe in 2 mL Puffer und Pipette, um Gewebe frei von Enzymen zu waschen. </li><li> Centrifuge wie zuvor zu sammeln. Überstand. </li><li> Wiederholen Sie waschen mit 1 mL Puffer pro 80 mg Gewebe. Centrifuge zu sammeln, Überstand verwerfen. </li></ol> 4. Filtering <ol><li> Resuspendieren Gewebe Lösung in 1 mL Puffer pro 80 mg Gewebe. </li><li> Add-Lösung bis 100 um Porengröße Filter über 50 mL Falcon-Röhrchen platziert. Nicht mehr als 3 ml zerkleinerte Gewebe Lösung pro Spalte, die als Filter blockiert werden. Lassen Sie die durchsickern. Entfernen Sie gefilterte Material hängen an der Unterseite des Filters durch eine Pipette, und fügen Sie Filtrat. </li><li> Verwenden Spritze mit 26-Gauge-Nadel, um Filtrat von 50ml Röhrchen nehmen und gelten bis 50 Mikrometer Porengröße Filter auf 5 ml Tuben. Lassen Sie die Filter, durch, unterstützt durch Lösen Deckel, wenn nötig. </li><li> Zentrifugenröhrchen wie zuvor zu sammeln. Überstand. </li></ol> 5. Plating-und Mittelbetriebe <ol><li> Kombinieren Sie alle Pellets in einem Band. Graf mit automatisierten Zelle Zähler oder Hämocytometer. </li><li> Platte Zellen bei einer Dichte von 0,4 x 10 6 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte, oder 2,67 x 10 6 Zellen pro T25 Zellkulturflasche. 1 ml MSG Medium in jede Vertiefung oder 6 ml in jedes T25 Kolben. </li><li> Inkubation bei 37 ° C. Spheres muss deutlich sichtbar von Tag 2. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Nach zwei Minuten vor drei Tagen in Kultur werden kleine Aggregate von Zellen (salispheres) werden in den Kulturen deutlich. Salispheres wird weiterhin in der Größe über einen Zeitraum von zehn Tagen in Kultur zu züchten. Vertreter Phasenkontrast-Mikroskopie-Aufnahmen von salispheres sind in Abbildung 1 dargestellt. Proliferierenden Zellen, die Stammzellen-assoziierte Markerproteine ​​können aus diesen Bereichen isoliert werden, optimal zwischen Tage 3-5 post Isolation und sind in der Lage Differenzierung in funktionale, Speichel produzieren Azinuszellen. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Salisphere Bildung in vitro. Nach der mechanischen und enzymatischen Aufschluss über die vorliegende Protokoll, können Kugeln mit zunehmender Größe in der schwimmenden Kulturen gefunden werden. Panels sind repräsentativ für die Phasenkontrast-Mikroskopie Bilder von Kugeln von Tagen 0 (A), 4 (B), 7 (C) und 10 (D). Balken = 50 um.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

Die Gewebekultur hier beschriebene Methode stellt eine reproduzierbare Protokoll für die Isolierung von Stammzellen mit salispheres aus den Speicheldrüsen der Mäuse. Studien unter Verwendung von Zellen auf diese Weise isoliert wurden, die Regenerationsfähigkeit der Speicheldrüse Stammzellen Zellen 9 hervorgehoben. Die Transplantation von hundert von c-Kit +-Zellen aus dem salispheres abgeleitet induzierte funktionelle Erholung von bestrahlten Maus Speicheldrüsen. Diese Daten sind spannend und bieten einen Ausgangspunkt für die Untersuchung von Stammzell-Therapie für Xerostomie. Viele Wege bleiben jedoch untersucht werden, einschließlich der vollständigen Markerprotein Expressionsprofil der Stammzellen, die Fähigkeit der submandibularis, um die Funktion der bestrahlten Parotis Speicheldrüsen und umgekehrt zu retten, und die Charakterisierung der putativen in vivo Stammzellnische der der Zellen. Letztlich ist die Übersetzung dieses Protokoll für die menschliche Gewebeproben und die anschließende Potenzial für die Therapie der Xerostomie bei menschlichen Patienten unter Verwendung der isolierten Zellen der aufregendsten Anwendung der beschriebenen Methode.

<table><tbody><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Bewahren Sie bei &amp;#8211;20 &amp;#x00B0;C auf</td></tr><tr><td>Kollagenase II</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>Bewahren Sie bei 4 &amp;#x00B0;C auf</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>Stellen Sie einen Vorratsansatz von 10 &amp;#x03BC;g/mL in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) her. Lagern Sie bei &amp;#8211;20 &amp;#x00B0;C in Einweg-Aliquots.</td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>Stellen Sie einen Vorratsansatz von 25 &amp;#x03BC;g/mL in PBS her. Lagern Sie bei &amp;#8211;20 &amp;#x00B0;C in Einweg-Aliquots.</td></tr><tr><td>N2-Zusatz</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Gemäß Herstelleranweisungen.</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Stellen Sie einen Vorratsansatz von 2 mg/mL in Leitungswasser her. Stellen Sie den pH-Wert des Wassers mithilfe von Essigsäure auf pH 2–3 ein, bevor Sie das Insulin lösen.</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Zellfilter mit 100 &amp;mu;m Porengröße</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Rundboden-Polystryrol-Röhrchen mit Zellfilterverschluss (50 &amp;mu;m Porengröße)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von maus speicheldrüsen stem cells

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Ältere Speicheldrüsen von Mensch und Maus Herkunft aus einem Minimum von fünf Zelltypen, von denen jede die Produktion und Ausschüttung von Speichel erleichtert in die Mundhöhle. Serösen und Schleimhäuten Azinuszellen sind die Protein-und Schleim produzieren Fabriken der Drüse bzw. und stellen den Ursprung der Speichelproduktion. Sobald synthetisiert werden die verschiedenen enzymatischen und anderen proteinhaltigen Komponenten des Speichels durch eine Reihe von duktalen Zellen, die epithelial-Art-Morphologie abgesondert wird, bis die eventuellen Ausweisung der Speichel durch einen großen Kanal in der Mundhöhle. Die Zusammensetzung des Speichels wird auch durch den duktalen Zellen während dieses Prozesses verändert. In der Manifestation von Krankheiten wie Sjögren-Syndrom, und in einigen klinischen Situationen wie Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren, die Speichelproduktion durch die Drüsen ist dramatisch 1,2 reduziert. Die daraus resultierenden Xerostomie, ein subjektives Gefühl der Mundtrockenheit, betrifft nicht nur die Fähigkeit des Patienten zu schlucken und sprechen, sondern fördert auch die Entwicklung von Karies und kann sozial schwächenden für den Erkrankten. Die Wiederherstellung der Speichel-Produktion in den oben genannten klinischen Bedingungen stellt daher einen ungedeckten klinischen Bedarf, und als solche haben mehrere Studien die Regenerationsfähigkeit der Speicheldrüsen 3-5 gezeigt. Im Anschluss an die Isolierung von Stammzellen, wie Populationen von Zellen aus verschiedenen Geweben innerhalb der Maus und menschlichen Körpern 6-8, haben wir gezeigt, mit dem beschriebenen Verfahren, dass Stammzellen aus der Maus Speicheldrüsen isoliert verwendet werden, um die Speichelproduktion in bestrahlten Speicheldrüsen zu retten Drüsen 9,10. Diese Entdeckung ebnet den Weg für die Entwicklung von Stammzell-basierten Therapien für die Behandlung von Xerostomie Verhältnisse beim Menschen, aber auch für die Erforschung der Speicheldrüse als Mikroumgebung enthaltenden Zellen mit multipotenten selbst erneuernde Fähigkeiten.

Ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Stammzellen aus der Maus Speicheldrüse beschrieben. Die Methode nutzt enzymatische und mechanische Verdauung, und erlaubt Isolierung salispheres enthaltenden Zellen mit Eigenschaften von Stammzellen.

Isolierung von Maus Speicheldrüsen Stem Cells

Reife Speicheldrüsen sowohl menschlichen als auch mausoriginären Ursprungs bestehen aus mindestens fünf Zelltypen, von denen jeder die Produktion und Exkretion von ... unterstützt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Isolierung von vermuteten Stammzellen aus den Speicheldrüsen von Neuron-SIV-Tieren zu demonstrieren. Dies wird zunächst erreicht, indem submandibuläre Speicheldrüsen von adulten Mäusen entnommen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gewebe mit gebogenen Scheren zu einem homogenen Brei zu verarbeiten.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gewebe mithilfe von Kollagenase und höherer Liase weiter aufzuspalten. Es ist darauf zu achten, das Gewebe nicht übermäßig zu verdauen. Da eine vollständige Zellsuspension nur wenige Sphäroide liefert, sind Zellverbände aus zwei bis drei Zellen optimal.Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Filtration des Homogenats durch 100-Mikron- und 50-Mikron-Filter. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Kultur und Isolierung von SIV-Drüsen-Stammzellen durch die kombinierte Anwendung mechanischer und enzymatischer Verdauung ganzer SIV-Drüsen zeigen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Therapie der Xerostomie, auch bekannt als Mundtrockenheit, die als Folge einer Strahlentherapie auftreten kann.Speicheldrüsen-Stammzellen können zur Behandlung von Xerostomie bei Patienten mit Kopf- und Halskrebs eingesetzt werden. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie Puffer, Maus, Speicheldrüsenkultur, Medien und Enzymlösungen vor. Gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll sollten alle Sektions- und Gewebekulturschritte in einer sterilen Gewebekulturschutzhaube durchgeführt werden.Nach der Isolierung und Dissektion der Speicheldrüsen der Maus das Speicheldrüsengewebe auf einer Waage wiegen und das Gewicht notieren. Mit einem Spatel die Speicheldrüsen in eine kleine Petrischale überführen und mithilfe gebogener Dissektionscheren zu einer homogenen Masse zerkleinern. Die Spitze eines P-1000-Pipettenspitzen abschneiden, um eine größere Öffnung zu erhalten.Pipettieren Sie je ein Milliliter Puffer pro 80 Milligramm Gewebe in die Petrischale und überführen Sie das Homogenat in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie weitere ein Milliliter Puffer pro 80 Milligramm Gewebe auf die Petrischale. Um eventuell verbliebene kleine Gewebestücke zu sammeln, fügen Sie diese Lösung dem Zentrifugenröhrchen hinzu.Dann schnell 250 Mikroliter Calciumchloridlösung, 25 Mikroliter Hyaluronidaselösung und 25 Mikroliter Kollagenase-Lösung hinzufügen, und zwar zwei Enzymlösungen pro 80 Milligramm Gewebe. Das Röhrchen mit dem Gewebe und der Enzymmischung in ein schüttelndes Wasserbad bei 37 Grad Celsius geben und 20 Minuten lang inkubieren.Nach der Inkubation die Röhrchen entnehmen. Die Gewebe-Enzym-Lösung wie zuvor etwa 10-mal gründlich mischen, indem eine P-1000-Spitze mit abgeschnittenem Ende verwendet wird. Das Röhrchen anschließend für weitere 20 Minuten in das Wasserbad bei 37 Grad Celsius zurückstellen.Nach der zweiten Inkubationszeit die Probe bei 400 × g für acht Minuten zentrifugieren, danach den Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig in zwei Millilitern Puffer pro 80 Milligramm Ausgangsgewebe resuspendieren. Anschließend weitere 250 Mikroliter Calciumchloridlösung, 25 Mikroliter Hyaluronidase-Lösung und 25 Mikroliter Kollagenase zugeben, jeweils zwei Enzymlösungen pro 80 Milligramm Gewebe.Und stellen Sie das Röhrchen für 20 Minuten zurück in das schüttelnde Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Gewebe aus dem Wasserbad und wiederholen Sie den Vorgang wie bei den vorherigen Inkubationen nach der Inkubation. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 × g für acht Minuten.Noch einmal und dann den Überstand verwerfen. Das Gewebe ist nun bereit, vor der anschließenden Filtration nach der vorherigen Zentrifugation gewaschen zu werden. Pipettieren Sie zwei Milliliter Puffer in das Röhrchen und pipettieren Sie auf und ab.Suspendieren Sie das Pellet nach der Resuspendierung. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 × g für acht Minuten. Danach entsorgen Sie das Überstandspipett. Ein Milliliter Puffer pro 80 Milligramm Gewebe in das Röhrchen geben und erneut pipettieren, um das Pellet erneut aufzuschießen. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Schritt bei 400 × g für acht Minuten. Während der Zentrifugation die Filtration vorbereiten, indem ein Filter mit einer Porengröße von 100 Mikrometern über ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gestellt wird. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und abschließend ein Milliliter Puffer pro 80 Milligramm Gewebe in das Röhrchen pipettieren. Mit einer P-1000-Spitze, deren Ende zuvor abgeschnitten wurde, mehrmals auf- und abpipettieren, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist.Überführen Sie dann das Homogenat in den Filter mit einer Porengröße von 100 Mikrometern und lassen Sie es durch den Filter in das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen sickern. Es ist wichtig, nicht mehr als drei Milliliter Homogenat aufzutragen, da der Filter sonst verstopfen könnte. Falls dieses Volumen überschritten wird, verwenden Sie eine P-1000-Pipette, um jegliches Gewebe, das sich an der Unterseite des Filters angesammelt hat, zu entfernen, und überführen Sie dieses Gewebe in das 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das das Filtrat enthält.Unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel das Homogenat aus dem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aufziehen und auf die mit einer 50-Mikrometer-Filterkappe versehene Fünf-Milliliter-Röhrchen auftragen. Das Homogenat durch den Filter sickern lassen. Falls die Filtration langsam verläuft, die Filterkappe lockern, da sie zu fest sitzen könnte.Ein Verschluss kann die Filtration verhindern, wenn die gesamte Homogenatprobe durch den Filter in das Röhrchen geflossen ist. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 × g für acht Minuten. Nach der Zentrifugation sind die pelletierten Zellen bereit, auf eine Platte ausgestrichen zu werden.Die Speicheldrüsenzellen werden zunächst durch Resuspendierung in einem Milliliter MSG-Medium pro 80 Milligramm Gewebe vorbereitet. Zählen Sie die Zellen gemäß Standardprotokollen. Hier wird ein automatischer Zellzähler verwendet, um die Zellanzahl zu bestimmen.Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das für 0,4 mal 10 hoch sechs Zellen erforderlich ist, und daraus die Anzahl der Wells, die beimpft werden können. Geben Sie je ein Milliliter MSG-Medium pro Well in eine 12-Well-Kulturplatte. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension gut gemischt ist, und geben Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension für 0,4 mal 10 hoch sechs Zellen in jedes der Wells.Überführen Sie die Platten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Untersuchen Sie nach zwei Tagen Inkubation die Kulturen auf das Vorhandensein von SLOs-Sphären und auf das Fehlen von ace in unseren Zellen. Dies ist ein Beispiel für Maus-Speicheldrüsengewebe, das wie beschrieben verarbeitet und mittels Phasenkontrastmikroskopie von Tag null bis Tag 10 in Kultur dargestellt wurde; die kleinen Zellaggregate sind SLOs-Sphären, die im Verlauf dieses Zeitraums an Größe zunehmen.Hier ist die Immunfärbung einer repräsentativen Kugelkultur von SLOs nach drei bis fünf Tagen für den Stammzellmarker dargestellt. Protein C Kit. Wie durch Durchflusszytometrie analysiert, bestätigt die Expression von Sea Kit das Vorhandensein putativer Stammzellen in den SLOs-Kulturen. Drei bis fünf Tage alte SLOs-Kugeln können zudem differenziert werden, um Sinus- und duktausartige Strukturen zu bilden, die eine ähnliche Morphologie wie in der nativen Speicheldrüse aufweisen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Speicheldrüsen und Stammzellen aus murinen Speicheldrüsen isoliert.

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Forschung

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Biologie

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