Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen maßgeschneiderten, robusten Immunoassay zu entwickeln, der reproduzierbare Ergebnisse mit minimalem manuellem Arbeitsaufwand ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst geeignete Assay-Bestandteile vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Optimierung des Assays anhand bestimmter Assay-Parameter.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Assay auf der Vibe-Plattform einzurichten, indem einfach die Platten mit Probe und Reagenzien geladen und das Assay-Verfahren definiert werden. Mit der Vibe-Software ist der letzte Schritt des Verfahrens, das Vibe mithilfe des Startassistenten zu starten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die empfindliche und reproduzierbare Immunoassay-Ergebnisse mit kundenspezifischen Antikörpern und geringem manuellem Arbeitsaufwand durch die Nutzung der Vibe-Plattform zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden wie Eli's besteht darin, dass die Vibe-Workstation eine wartefreie Durchführung und reproduzierbarere Daten gemäß den Standardprotokollen ermöglicht. Unter Verwendung von NHS chromogenem Biotin Bio atin wird die Captur-Antikörperbindung an biotinylierte Antikörper an Streptavidin- und magnetische Partikel durch Vortexen des Röhrchens mit Streptavidin- und magnetischen Partikeln für eine bis zwei Minuten zur Resuspension und anschließendes Pipettieren des gewünschten Partikelvolumens in ein Zentrifugenröhrchen sowie Entfernen des Überstandes mithilfe eines Magnetseparators eingeleitet. Die Partikel werden dreimal mit PBST gewaschen, wobei zur Partikelrückgewinnung die magnetische Trennung gemäß dem schriftlichen Protokoll angewendet wird.

Nachdem das PBST aus der letzten Waschung entfernt wurde, die biotinylierte Antikörperlösung zu den Kügelchen geben und diese durch Pipettieren resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass das Antikörpervolumen mindestens 300 Mikroliter beträgt. Falls es geringer ist, mit PBS anpassen.

Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren. Anschließend waschen Sie die Kügelchen wie zuvor mit PBST. Fügen Sie biotinyliertes BSA gemäß dem zuvor durchgeführten Verfahren hinzu.

Wenn bio biotinyliertes Antikörper gewaschen wird, vorher und die Beads in 100 Mikrolitern 0,05 % BSA in PBS zur Langzeitlagerung resuspendiert werden, kann Natriumazid gemäß Standardprotokollen hinzugefügt werden. Mit NHS-Fluorescein das Detektorantikörper fluorieren. Um die Entwicklung des Assays für Wirtszellproteine aus chinesischen Hamstereierstockzellen zu beginnen.

Bereiten Sie zunächst die Arbeitslösungen vor. Der mit HAPTen markierte Antikörper oder HAB wird als vierfache Arbeitslösung mit 1,6 Mikrogramm pro Milliliter in Bio-Scale-Bead-HAB-Verdünnungsmittel hergestellt; die Lösung wird mindestens fünf Minuten lang rotiert. Bereiten Sie anschließend die Kügelchenlösung vor.

Vortexen Sie den Bead-Stock gründlich. Um sicherzustellen, dass alle Beads in Suspension sind, entnehmen Sie eine Aliquotprobe, um ein vierfaches Arbeitsgemisch mit acht mal 10 hoch fünf Beads pro Milliliter herzustellen, das mit Bio-Scale-Bead-HAB-Verdünnungsmittel verdünnt ist. Rühren Sie die Lösung mindestens fünf Minuten lang um.

Dann bereiten Sie den Laufpuffer vor. Mehrere CHO-HCP-Assays wurden unter Verwendung eines 10 Millimolar-HEPES-Puffers mit 1 % Tween bei pH 7,5 entwickelt.

Der Puffer muss jedoch möglicherweise an die Antikörper angepasst werden, die zur Entwicklung Ihres Assays verwendet werden. Es wird empfohlen, für jeden Fünf-Arbeitsplatz-Assay eine Assay-Vorlage vorzubereiten. Die Assay-Vorlage umfasst sieben Tabellenblätter mit den Bezeichnungen Anleitung, Hinweise zur Probeneinrichtung, Berechnungen der Rohdaten, Kalibrierdiagramm und Ergebnisse.

Um mit dem Einrichten der Vorlage zu beginnen, wählen Sie das Probenvorblatt aus und tragen Sie den Konzentrationsbereich der Standards in die Tabelle ein. Geben Sie in der oberen linken Ecke des Blatts zusätzliche Informationen in die Tabelle rechts neben den Standards ein, um die Vibe-Arbeitsstation darüber zu informieren, wie lange die Proben inkubieren müssen, wie viel Reagenzvolumen übertragen werden soll, wie lange die Probensammlung dauert und ob eine Sensorvorbehandlung sowie eine Entkontamination von Sonden und Kartusche erforderlich ist. Füllen Sie anschließend den Plattenlayout aus, verdünnen Sie Kalibratoren und Proben mit Bio-Scale-Probenverdünnungsmittel und geben Sie die Proben in die Platten ein.

Reagenzien in die dritte 96er-Platte einfüllen. Die Platten versiegeln. Die Platten auf die Schüttler der Workstation-Bank stellen und das System mit Waschpuffer und Regenerationslösung vorbereiten.

Schalten Sie die Vibe-Arbeitsstation ein und schließen Sie die Systemzufuhr und -entsorgung an. Beginnen Sie mit dem Vorfüllen des Systems. Setzen Sie die Vibe-Kartusche ein.

Führen Sie abschließend den Assay-Startassistenten aus. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm und beginnen Sie. Das Assaysignal wird mit der A MMP-Technologie gemessen. Wenn der Bead-Antigen-Hapten-Antikörper über die Hapten-Anti-Hapten-Wechselwirkung an den Sensor bindet, kehrt der Sensor durch Regeneration in den Ausgangszustand zurück, indem die immunologischen Komplexe entfernt werden. Dargestellt.

Hier sehen Sie ein Beispiel für einen CHO H-C-P-A-M-M-P-Assay. Die Kalibrierungskurvenanalyse kann an Bioreaktorproben mit reproduzierbaren Ergebnissen durchgeführt werden. Diese Kalibrierungskurve gilt für ein Restprotein.

Der A-A-M-M-P-Assay wird mit einem Vibe-Restprotein und einem Assay-Kit durchgeführt. Derselbe Kit kann für einen schnelleren Assay mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten oder für empfindlichere Ergebnisse und einen breiteren dynamischen Bereich mit einer längeren Inkubationszeit verwendet werden. Die Vibe-Workstation kann ebenfalls für einen Produkt-Titer-Assay eingesetzt werden, der sich von anderen A-MMP-Assays unterscheidet.

Dieser Test erfordert keine Probenvorbehandlung oder Kügelchen, und die Quantifizierung wurde bei Proben ohne Zentrifugation mit mehr als 10 Millionen Zellen verifiziert. Dargestellt ist hier eine Standardkurve des Signals, das mit dem Vibe-Bioanalyzer oder der Alpha-Screen-Technologie unter Verwendung rekombinanter GST-GAD-34-Ergebnisse auf der Vibe-Plattform erhalten wurde. Die Empfindlichkeit war hier um eine Größenordnung höher.

Die Induktion von GAD 34 aus CWR 22-Xenotransplantaten wurde in Gegenwart oder Abwesenheit eines Bate-Proteasom-Inhibitors getestet, analysiert mittels Vibe, Bioanalyzer oder Alpha-Screen. Die Vibe-Plattform konnte empfindliche und reproduzierbare Ergebnisse in den in-vivo-Tumor-Xenotransplantaten liefern, während das Alpha-Screen-Signal mit zunehmenden Mikrogramm Protein nach der Entwicklung abgeschwächt wurde. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der onkologischen Wirkstoffentwicklung den Weg geebnet, um Wirkstoffinhibition in Tumorproben zu untersuchen, und hat effizientere Abläufe in biotechnologischen Anwendungen ermöglicht.