Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen maßgeschneiderten, robusten Immunoassay für reproduzierbare Ergebnisse mit begrenzter Hands-on-Zeit zu entwickeln. Dies wird erreicht, indem zunächst geeignete Assay-Komponenten vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Assay auf Basis von Assay-Parametern zu optimieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Assay auf der Vibe-Plattform einzurichten, indem einfach die Platten mit der Probe und den Reagenzien geladen und das Assay-Verfahren definiert wird. Bei der Vibe-Software besteht der letzte Schritt des Verfahrens darin, den Vibe mit dem Startassistenten zu starten. Letztendlich können durch den Einsatz der Vibe-Plattform Ergebnisse erzielt werden, die empfindliche, reproduzierbare Immunoassay-Ergebnisse mit kundenspezifischen Antikörpern und begrenzter Hands-on-Zeit zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden wie der von Eli besteht darin, dass die Vibe Workstation Walkaway-Operationen und mehr reproduzierbare Daten gemäß den Standardprotokollen bietet. Unter Verwendung von NHS Chromogenic, Biotin Bio Atin, dem Fängerantikörper zur Bindung von biotinylierten Antikörpern an Streptokokken an Avid- und Magnetkügelchen, beginnen Sie damit, das Fläschchen mit an Avid- und Magnetkügelchen für ein bis zwei Minuten zu wirbeln, um das gewünschte Volumen der Kügelchen in ein Fugeröhrchen zu resuspendieren und das Sat mit Hilfe eines Magnetseparators zu entfernen. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit PBST und verwenden Sie eine magnetische Trennung, um die Kügelchen gemäß dem schriftlichen Protokoll zurückzugewinnen.

Nachdem das PBST aus der letzten Wäsche entfernt wurde, fügen Sie die biotinylierte Antikörperlösung zu den Kügelchen hinzu und resuspendieren Sie die Kügelchen durch Pipettieren. Stellen Sie sicher, dass das Antikörpervolumen mindestens 300 Mikroliter beträgt. Wenn es weniger ist, passen Sie es mit PBS an.

Die Suspension wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert. Dann die Perlen wie zuvor mit PBST waschen. Fügen Sie biotinyliertes BSA nach dem gleichen Verfahren hinzu, das zuvor durchgeführt wurde.

Wenn biobiotinylierte Antikörper die Kügelchen in 100 Mikrolitern 0,05 % BSA in PBS zur Langzeitlagerung waschen und resuspendieren, kann Natriumazid gemäß Standardprotokollen hinzugefügt werden. Mit NHS-Fluorescein fluorieren Sie den Detektor-Antikörper. Um mit der Entwicklung des Assays für Wirtszellproteine des chinesischen Hamsters zu beginnen.

Bereiten Sie zunächst die Arbeitslösungen vor. Der mit HAPTEN markierte Antikörper oder HAB wird als vierfache Arbeitslösung von 1,6 Mikrogramm pro Milliliter hergestellt, verdünnt mit Bioskala-Beads HAB-Verdünnungsmittel, drehen Sie die Lösung mindestens fünf Minuten lang. Bereiten Sie als Nächstes die Bead-Lösung vor.

Wirbeln Sie die Galle gut aus. Um sicherzustellen, dass alle Kügelchen in Suspension sind, entfernen Sie ein Aliquot, um eine vierfache Arbeitsmischung von acht mal 10 bis fünf Kügelchen pro mil Liter herzustellen, die mit dem Bio-Scale-Kügelchen-HAB-Verdünnungsmittel verdünnt wird. Drehen Sie die Lösung mindestens fünf Minuten lang.

Bereiten Sie dann den laufenden Puffer vor. Es wurden mehrere CHO-HCP-Assays mit 10 Millimolar entwickelt. Der Stückpuffer 1% zwischen pH 7,5.

Es kann jedoch sein, dass der Puffer für die Antikörper optimiert werden muss, die zur Entwicklung Ihres Assays verwendet werden. Es wird empfohlen, für jeden Assay an fünf Arbeitsplätzen eine Assay-Vorlage zu erstellen. Die Assay-Vorlage besteht aus sieben Blättern, beschrifteten Anweisungen, Hinweisen zur Probeneinrichtung, Rohdatenberechnungen, einer Kalibrierungstabelle und Ergebnissen.

Um mit der Einrichtung der Vorlage zu beginnen, wählen Sie das Probeneinrichtungsblatt aus und geben Sie den Konzentrationsbereich der Standards in der Tabelle ein. Geben Sie in der oberen linken Ecke des Blattes zusätzliche Informationen in die Tabelle rechts neben den Standards ein, um die Vibe-Workstation anzuweisen, wie lange die Proben inkubiert werden müssen, wie viel Reagenzvolumen übertragen werden soll, wie lange die Probenakkumulation dauert und ob eine Sensorkonditionierung und Dekontamination von Sonden und Kartuschen erforderlich ist. Füllen Sie dann das Plattenlayout aus, verdünnen Sie die Kalibratoren und Proben mit biologischem Probenverdünnungsmittel und laden Sie die Proben in die Platten.

Laden Sie die Reagenzien in die dritte 96er Wandplatte. Verschließen Sie die Platten. Platzieren Sie die Platten auf den Deckschüttlern der Arbeitsstation und richten Sie das System mit Waschpuffer und Regenerationslösung ein.

Schalten Sie die vibe-Workstation ein und verbinden Sie die Zu- und Abluft des Systems. Beginnen Sie, das System vorzubereiten. Setzen Sie die Vibe-Cartridge ein.

Führen Sie abschließend den Assay-Startassistenten aus. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm und beginnen Sie Mit dem Assay-Signal wird die A MMP-Technologie gemessen. Wenn der Bead-Antigen-HAPTEN-Antikörper durch die Hapten-Anti-Hapten-Interaktion an den Sensor bindet, bringt die Regeneration den Sensor zurück in den Ausgangszustand, indem die Immunkomplexe entfernt werden. Gezeigt.

Hier ist ein Beispiel für einen CHO H-C-P-A-M-M-P Assay. Die Analyse der Kalibrierkurve kann in Bioreaktorproben mit reproduzierbaren Ergebnissen durchgeführt werden. Diese Kalibrierkurve gilt für ein Restprotein.

A-A-M-M-P-Assay, der mit einem Vibe-Restprotein, einem Assay-Kit, durchgeführt wurde. Das gleiche Kit kann für einen schnelleren Assay mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten oder für empfindlichere Ergebnisse und einen größeren Dynamikbereich mit einer längeren Inkubationszeit verwendet werden. Die Vibe Workstation kann auch für einen Produkttiter-Assay verwendet werden, der anders durchgeführt wird als andere A-MMP-Assays.

Dieser Assay erfordert keine Probenbehandlung oder Beads, und die Quantifizierung wurde in No-Spin-Proben mit mehr als 10 Millionen Zellen verifiziert. Hier ist eine Standardkurve des Signals dargestellt, die mit dem Vibe Bioanalyzer oder der Alpha Screen Technology unter Verwendung rekombinanter GST GAD 34-Ergebnisse auf der Vibe-Plattform erhalten wurde. Wäre hier ein Baumstamm empfindlicher.

Die Induktion von GAD 34 aus CWR 22-Xenotransplantaten wurde in Gegenwart oder Abwesenheit eines Bate-Proteasom-Inhibitors getestet, wie entweder mit dem Vibe-, Bioanalyzer- oder Alpha-Screen analysiert. Die Vibe-Plattform war in der Lage, in den in vivo Tumor-Xenotransplantaten empfindliche reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, während das Alpha-Screen-Signal nach seiner Entwicklung mit erhöhten Mikrogramm Protein gelöscht wurde. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der onkologischen Wirkstoffforschung den Weg geebnet, um die Wirkstoffhemmung in Tumorproben zu erforschen, und hat effizientere Abläufe in Bioprozessanwendungen ermöglicht.