Name: Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung robuster Immunoassays mit der ViBE-Plattform für reproduzierbare Ergebnisse bei minimalem Zeitaufwand. Diese Methode ermöglicht sensitive Analysen mit benutzerdefinierten Antikörpern.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Mikropartikel-Vorbereitung <ol><li> Label Antikörper mit Biotin NHS Chemie </li><li> Bestimmung des Grades der Biotinylierung </li><li> Konjugat Streptavidin Beads mit biotinylierter Antikörper <ol><li> Resuspendieren der Perlen in der Original-Durchstechflasche durch Vortexen für 1-2 Minuten </li><li> Aliquot die gewünschte Lautstärke aus Perlen in ein Mikrozentrifugenröhrchen </li><li> Waschen Sie die Kugeln 3-mal mit PBST: <ol><li> Das Röhrchen mit den Perlen auf den Magneten für 2 Minuten </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen mit dem Schlauch auf den Magneten. Achten Sie darauf, um die Perlen zu stören </li><li> Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magneten und 1 ml PBST </li><li> Vortex für 20 Sekunden, um die Perlen zu resuspendieren </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 Sekunden, um die Perlen aus der Kappe entfernen </li><li> Wiederholen Sie 2.3.1-2.3.5 noch zweimal </li></ol></li><li> Nach dem dritten Waschen statt der Röhre auf dem Magneten und saugen Sie den PBST </li><li> Add biotinylierten Antikörper an die Beads und resuspendieren </li><li> Bei Bedarf bringen die Lautstärke des biotinylierten Antikörpers bis zu 300 ul mit PBS. Wenn der Antikörper Volumen ist bereits mehr als 300 ul fügen Sie keine PBS </li><li> Inkubieren Sie die Perle / Antikörper-Suspension für 30 Minuten bei RT auf dem Vortex-Schüttler oder Tube Rotator </li><li> 3 x waschen mit PBST wie in Schritt 3. </li><li> Block Perlen mit biotinylierten BSA <ol><li> Nach dem dritten Waschen add 10 ug / mg biotinylierten BSA, die Lautstärke auf 300 ul mit PBS, wenn nötig, und inkubieren unter Rühren für 30 Minuten </li></ol></li><li> 3 x waschen mit PBST wie in Schritt 3 </li><li> Resuspendieren der Beads in 100 ul PBS/0.05% BSA. Natriumazid kann für die langfristige Lagerung hinzugefügt werden </li></ol></li><li> Mit Standard-NHS Fluorescein-Protokolle, fluoresceinate der Detektor-Antikörper </li><li> Bestimmen den Grad der Fluorescination </li></ol> 2. HCP - Entwicklung <ol><li> Bereiten Sie funktionierende Lösungen: <ol><li> Fluorescein-markierten Antikörper (Fl-Ab): Die meisten CHO-HCP-Assays verwenden Fl-Ab bei einer Endkonzentration von 400 ng / mL. Die Fl-Ab als ¼ der endgültigen Assayvolumen hinzugefügt wird, damit die Konzentration der Arbeitslösung beträgt 1,6 pg / mL. Diese Lösung durch Verdünnen Flab Lager mit BioScale Bead / Flab Diluent. </li><li> Perlen: Die meisten CHO-HCP-Assays verwenden Perlen an einer Endkonzentration von 2x10 5 Perlen / mL. Die Bead-Reagenz bildet ¼ der endgültigen Assayvolumen, daher die Konzentration der Arbeitslösung ist 8x10 5 Perlen / mL. Diese Lösung durch Verdünnen bead Lager mit BioScale Bead / Flab Diluent. Vortex die Perle Lager auch um sicherzustellen, dass alle Perlen sind in Suspension vor dem Entfernen eines aliquoten. </li><li> Laufpuffer: Die Zusammensetzung der Laufpuffer Möglicherweise müssen Sie für die Antikörper verwendet, um den Test zu entwickeln optimiert werden jedoch mehrere CHO-HCP-Assays entwickelt worden sind, mit 10 mM HEPES-Puffer, 1% Tween, pH 7,5. BioScale hat ein Additiv für den Laufpuffer (im Lieferumfang des Development Kit), die in den Puffer zu einer Konzentration von 1% vor Gebrauch hinzugefügt wird entwickelt. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Kalibratoren und Proben mit BioScale Probendiluent. </li></ol> 3. ViBE System Set Up <ol><li> Drehen Sie den ViBE Workstation auf </li><li> Schließen Sie das System-und-entsorgung </li><li> Prime das System </li><li> Legen Sie eine ViBE Cartridge </li><li> Verlegen Sie die Rohre </li><li> Bereiten Assay Vorlage, indem Sie das Arbeitsblatt mit der Bezeichnung "Sample Setup". BioScale bietet die Möglichkeit, einen Test Vorlage für jeden ViBE Workstation-Test haben. Dies ermöglicht es dem Benutzer, bearbeiten und speichern Sie bestimmte Noten in den "Notes" Blatt der Vorlage für die verschiedenen Tests, die eine vollständige Aufzeichnung des Experiments. </li><li> Erste Test-Template eingerichtet: Beginnen Sie mit dem Ausfüllen der Tabelle (oben links) der Konzentrationsbereich der Standards in den Test in der "Sample Setup" Blatt. </li><li> Als nächstes geben Sie zusätzliche Informationen in der Tabelle auf der rechten Seite des Standards (Simple Spalte Read Setup, ein Reagenz hinzufügen und Zwei-Reagenz Add-Setups), um die ViBE Workstation, wie lange Proben inkubieren müssen anweisen, wie viel Volumen von Reagenz zu übertragenden , wie lange die Probe Akkumulation zu sein braucht, und ob der Sensor ausgestattet und Dekontamination von Sonden und Patrone sind notwendig, etc </li><li> Füllen Sie die Platte Layout. </li><li> Laden Probe / Reagenzien in Platten. Der Vibe wird die erforderlichen Volumina für das Reagens Platte. Probenvolumen kann variieren, aber in der Hälfte der insgesamt Assay Volumen von 120 ul ist ein guter Ausgangspunkt. </li><li> Bewerben Platte abdeckt. Laden Platten auf Workstation-Deck. </li><li> Führen Sie den Test starten Assistenten durch Assistenten und starten Assay. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: AMMP Sandwich-Immunoassay Auf einer ViBE Workstation, misst ein AMMP Assay Antigen-Konzentration. Signal wird gemessen, wenn der Wulst-Antigen-Hapten-Antikörper auf den Sensor bindet durch das Hapten / Anti-Hapten-Wechselwirkung. Regeneration bringt der Sensor wieder an den Anfang Staat durch die Beseitigung der Immunkomplexe. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: CHO-HCP AMMP Assay Kalibrierkurve Abbildung 2 oben ist ein Beispiel für eine CHO HCP AMMP Assay Kalibrierkurve. Die Analyse kann in Proben aus der ganzen Reinigung Strom einschließlich der Reaktor mit hoher Präzision und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Protein A AMMP Assay Kalibrierkurve Abbildung 3 ist eine Kalibrierkurve für einen Rest-Protein A AMMP Assay, mit einer VIBE Residual Protein A-Assay-Kit durchgeführt. Das gleiche Kit kann für eine schnellere Assay mit einer 30-minütigen Inkubationszeit, oder für empfindlichere Ergebnisse und einen größeren Dynamikbereich mit einer längeren Inkubationszeit ohne Verlust an Präzision und Genauigkeit, die beide in der Regel besser sind als gleichwertig ELISA ist in Benutzern verwendet werden ' Hände <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Produkt-Titer AMMP Assay Der Vibe Workstation kann auch für ein Produkt Titer-Test, Ergebnisse in Abbildung 4 dargestellt verwendet werden. Anders als andere AMMP Assays durchgeführt, hat dieser Test keine Probe einer anderen Behandlung als einfaches Verdünnen oder Perlen, und die Quantifizierung hat in "no spin" Proben mit mehr als 10 Millionen Zellen über einen weiten Bereich von Bewohnbarkeit überprüft worden. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: AMMP Assay Standardkurve für GST-Gadd34 Biomarker Assay In Abbildung 5 ist ein Standard-Kurve des Signals von der Stimmung BioAnalyzer (Panel A) oder AlphaScreen Technologie unter Verwendung von rekombinanten GST-Gadd34 erhalten. Ergebnisse auf der ViBE Plattform wurden rund ein Protokoll empfindlicher mit dem gleichen Antikörper. AMMP nutzt die Messung von weniger größeren Partikeln dennoch Vorteile aus der Lösung Phase Erfassung und Erkennung der Komplexbildung. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6: AMMP Assay Standardkurve für GST-Gadd34 in Tumorprobe In Abbildung 6 wurde die Induktion von Gadd34 aus CWR22 Xenotransplantate in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Boronat Proteasom-Inhibitor, wie entweder durch die ViBE BioAnalyzer (Panel A) oder AlphaScreen (Panel B) analysiert getestet. Der Vibe-Plattform war in der Lage, sensible und reproduzierbare Ergebnisse in der in vivo Tumorxenotransplantaten während die AlphaScreen Signal wurde mit einem erhöhten ug Protein abgeschreckt zu produzieren. Dieses Beispiel zeigt die Macht der AMMP Technologie in komplexen Proben. Aufgrund der empfindlichen Nachweis-Chip und einen hohen Wirkungsgrad des Magneten in der Nähe des Chips kann geringe Anzahl von magnetischen Mikropartikeln effizient und reproduzierbar für niedrige Fülle Ziel mitten in der Komplexität der lysierten Zellen (einschließlich Lyse-Reagenzien) und Blut Schmutz abzufangen.

Die Autoren dieses Artikels sind Bioscale, Inc, dass einige der Instrumente und Reagenzien in diesem Artikel verwendet produziert beschäftigt.

Die vorstehenden Beispiele zeigen, AMMP hochempfindliche quantitative Ergebnisse in komplexen Proben. Diese Leistung, wenn sie mit der Leichtigkeit und Kontrolle der Formatierung Reagenzien in das System geliefert wird, für eine Vielzahl von Anwendungen ermöglicht. Diese Anträge können spezifisch für ein Ziel, wie in Gadd34 in Tumor, oder allgemein für ein Spektrum von Zielen, wie sie in Wirtszellprotein Detektion und Quantifizierung in Proben, die die Reinigung Strom zu überqueren. Der geringe Overhead ViBE Plattform mit hochflexiblen AMMP kombiniert ein leistungsstarkes Tool für die Bereitstellung von kritischen Tests.

<table><tbody><tr><td>NHS-Chromogenes-Biotin oder NHS-Chromogenes-Biotin-Markierungskit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falls NHS-Chromogenes-Biotin als Reagenz gekauft wird, sind die folgenden zusätzlichen Materialien erforderlich</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserlösliches organisches Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder ein anderer aminfreier Puffer (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalting-Säulen oder Dialyseeinheiten zur Pufferaustausch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer, das 354 und 280 nm messen kann &amp;#8211; zur Bestimmung der Protein- und Biotinkonzentration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Antikörper (2–5 Biotine/Ab)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Magnetbeads</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>(10 mg/mL) ~10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; Beads/mg</td></tr><tr><td>Magnet für Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>New England Biolabs</td><td>cat # S1510S</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Rinderserumalbumin (BSA) zum Blockieren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS mit 0,1 % Tween 20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenhalter für Vortex oder Röhrchenrotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zu markierendes Antikörper oder Protein</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Fluorescein oder NHS-Fluorescein-Markierungskit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falls NHS-Fluorescein als Reagenz gekauft wird, sind die folgenden zusätzlichen Materialien erforderlich</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserlösliches organisches Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Boratpuffer, pH 8,5 oder ein anderer aminfreier Puffer (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desalting-Säulen oder Dialyseeinheiten zur Pufferaustausch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die Bestimmung der Protein- und Fluoresceinkonzentration erfordert ein Spektrophotometer, das 493 und 280 nm messen kann.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verdünnungspuffer</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>zur Verdünnung der Beads und des fluoresceinmarkierten Antikörpers (FlAb)</td></tr><tr><td>Probenverdünnungspuffer</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>zur Verdünnung von Proben und Kalibratoren</td></tr><tr><td>Laufpuffer-Zusatz</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

entwickeln von benutzerdefinierten chinesischen hamsters-wirtszellprotein assays mit akustikvlies mikropartikeltechnologie

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Benutzerdefinierte Assays für einzigartige Proteine ​​werden oft zeitraubende manuelle Erfassung und Quantifizierung Techniken wie ELISA oder Western Blots auf Grund der Komplexität der Entwicklung auf alternative Plattformen beschränkt. BioScale proprietären Acoustic Membrane Mikropartikel (AMMP)-Technologie ermöglicht Sandwich-Immunoassays zu leicht für die Verwendung auf dem ViBE Plattform entwickelt werden, was eine bessere Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und automatisierten Betrieb. Vorausgesetzt, als Beispiel, werden in diesem Protokoll das Verfahren für die Entwicklung eines benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Host Cell Protein (CHO-HCP)-Assay. Die allgemeinen Grundsätze hier skizzierten kann für die Entwicklung einer breiten Palette von Immunoassays verfolgt werden. Ein AMMP Assay misst Antigen-Konzentration durch die Messung von Veränderungen in Schwingfrequenz durch die Bindung von Mikropartikeln verursacht, die Sensorfläche zu berechnen. Es besteht aus vier Hauptkomponenten: (1) eine Patrone, die eine funktionalisierte acht Sensor-Chip enthält (2) Antikörper markiert magnetische Mikropartikel, (3) Hapten markierten Antikörper an die Oberfläche der funktionalisierten Chip (4) Proben, die das Antigen bindet Interesse. BioScale der Biosensor ist ein Resonanz-Gerät, das acht einzelnen Membranen mit separatem fluidische Pfade enthält. Die Membranen ändern Schwingungsfrequenz in Reaktion auf Masse ansammeln auf der Oberfläche und diese Frequenz ändern wird verwendet, um die Menge des zugegebenen Masse zu quantifizieren. Für die Verwendung in einer Vielzahl von Immunoassays der Sensor mit einem Anti-Hapten-Antikörper funktionalisierten erleichtern. Assay spezifische Antikörper werden durch die kovalente Konjugation von Hapten-Tag, um einen Antikörper und Biotin auf die andere geändert. Die Biotin-Markierung verwendet wird, um den Antikörper binden an gekoppelten magnetischen Beads, die in Kombination mit dem Hapten-markierten Antikörper, verwendet werden, um den Analyten in einer Sandwich-Abscheidung Streptavidin. Der Komplex bindet an den Chip durch die anti-hapten/hapten Interaktion. Am Ende eines jeden Testlauf werden die Sensoren mit einer verdünnten Säure ermöglicht die sequentielle Analyse von Spalten aus einer 96-Well-Platte gereinigt. Hier präsentieren wir die Methode zur Entwicklung eines benutzerdefinierten CHO-HCP AMMP Assay für Bioprozess-Entwicklung. Die Entwicklung AMMP Assays oder die Änderung bestehender Assays in AMMP Assays können eine bessere Leistung (Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit) in komplexen Proben und reduzierte Arbeitszeit. Das Protokoll zeigt die Schritte für die Entwicklung und die Diskussion der Bewertungen repräsentative Ergebnisse. Für eine ausführliche Erläuterung der Assay-Optimierung und Anpassung Parameter Kontakt BioScale. Dieses Kit bietet generische Bioprozessentwicklung Assays wie Residual Protein A, Produkt-Titer und CHO-HCP.

Entwicklung von kundenspezifischen Assays auf der ViBE Plattform für empfindlichere, reproduzierbare, automatisierte Ergebnisse in komplexen Matrices beschrieben ist. Die Universal-Kassette ermöglicht Assays zu leicht für die Verwendung mit benutzerdefinierten Tests angepasst werden. Diese Vielseitigkeit ermöglicht die schnelle Entwicklung und Validierung neuer Tests oder automatisierte Versionen bestehender manueller Tests, in diesem Video veranschaulicht.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Maßgeschneiderte Assays für einzigartige Proteine sind aufgrund von ... häufig auf zeitaufwendige manuelle Detektions- und Quantifizierungsmethoden wie ELISA oder Western Blots beschränkt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen maßgeschneiderten, robusten Immunoassay zu entwickeln, der reproduzierbare Ergebnisse mit minimalem manuellem Arbeitsaufwand ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst geeignete Assay-Bestandteile vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Optimierung des Assays anhand bestimmter Assay-Parameter. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Assay auf der Vibe-Plattform einzurichten, indem einfach die Platten mit Probe und Reagenzien geladen und das Assay-Verfahren definiert werden. Mit der Vibe-Software ist der letzte Schritt des Verfahrens, das Vibe mithilfe des Startassistenten zu starten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die empfindliche und reproduzierbare Immunoassay-Ergebnisse mit kundenspezifischen Antikörpern und geringem manuellem Arbeitsaufwand durch die Nutzung der Vibe-Plattform zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden wie Eli's besteht darin, dass die Vibe-Workstation eine wartefreie Durchführung und reproduzierbarere Daten gemäß den Standardprotokollen ermöglicht. Unter Verwendung von NHS chromogenem Biotin Bio atin wird die Captur-Antikörperbindung an biotinylierte Antikörper an Streptavidin- und magnetische Partikel durch Vortexen des Röhrchens mit Streptavidin- und magnetischen Partikeln für eine bis zwei Minuten zur Resuspension und anschließendes Pipettieren des gewünschten Partikelvolumens in ein Zentrifugenröhrchen sowie Entfernen des Überstandes mithilfe eines Magnetseparators eingeleitet. Die Partikel werden dreimal mit PBST gewaschen, wobei zur Partikelrückgewinnung die magnetische Trennung gemäß dem schriftlichen Protokoll angewendet wird.Nachdem das PBST aus der letzten Waschung entfernt wurde, die biotinylierte Antikörperlösung zu den Kügelchen geben und diese durch Pipettieren resuspendieren. Stellen Sie sicher, dass das Antikörpervolumen mindestens 300 Mikroliter beträgt. Falls es geringer ist, mit PBS anpassen.Inkubieren Sie die Suspension 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren. Anschließend waschen Sie die Kügelchen wie zuvor mit PBST. Fügen Sie biotinyliertes BSA gemäß dem zuvor durchgeführten Verfahren hinzu.Wenn bio biotinyliertes Antikörper gewaschen wird, vorher und die Beads in 100 Mikrolitern 0,05 % BSA in PBS zur Langzeitlagerung resuspendiert werden, kann Natriumazid gemäß Standardprotokollen hinzugefügt werden. Mit NHS-Fluorescein das Detektorantikörper fluorieren. Um die Entwicklung des Assays für Wirtszellproteine aus chinesischen Hamstereierstockzellen zu beginnen.Bereiten Sie zunächst die Arbeitslösungen vor. Der mit HAPTen markierte Antikörper oder HAB wird als vierfache Arbeitslösung mit 1,6 Mikrogramm pro Milliliter in Bio-Scale-Bead-HAB-Verdünnungsmittel hergestellt; die Lösung wird mindestens fünf Minuten lang rotiert. Bereiten Sie anschließend die Kügelchenlösung vor.Vortexen Sie den Bead-Stock gründlich. Um sicherzustellen, dass alle Beads in Suspension sind, entnehmen Sie eine Aliquotprobe, um ein vierfaches Arbeitsgemisch mit acht mal 10 hoch fünf Beads pro Milliliter herzustellen, das mit Bio-Scale-Bead-HAB-Verdünnungsmittel verdünnt ist. Rühren Sie die Lösung mindestens fünf Minuten lang um.Dann bereiten Sie den Laufpuffer vor. Mehrere CHO-HCP-Assays wurden unter Verwendung eines 10 Millimolar-HEPES-Puffers mit 1 % Tween bei pH 7,5 entwickelt.Der Puffer muss jedoch möglicherweise an die Antikörper angepasst werden, die zur Entwicklung Ihres Assays verwendet werden. Es wird empfohlen, für jeden Fünf-Arbeitsplatz-Assay eine Assay-Vorlage vorzubereiten. Die Assay-Vorlage umfasst sieben Tabellenblätter mit den Bezeichnungen Anleitung, Hinweise zur Probeneinrichtung, Berechnungen der Rohdaten, Kalibrierdiagramm und Ergebnisse.Um mit dem Einrichten der Vorlage zu beginnen, wählen Sie das Probenvorblatt aus und tragen Sie den Konzentrationsbereich der Standards in die Tabelle ein. Geben Sie in der oberen linken Ecke des Blatts zusätzliche Informationen in die Tabelle rechts neben den Standards ein, um die Vibe-Arbeitsstation darüber zu informieren, wie lange die Proben inkubieren müssen, wie viel Reagenzvolumen übertragen werden soll, wie lange die Probensammlung dauert und ob eine Sensorvorbehandlung sowie eine Entkontamination von Sonden und Kartusche erforderlich ist. Füllen Sie anschließend den Plattenlayout aus, verdünnen Sie Kalibratoren und Proben mit Bio-Scale-Probenverdünnungsmittel und geben Sie die Proben in die Platten ein.Reagenzien in die dritte 96er-Platte einfüllen. Die Platten versiegeln. Die Platten auf die Schüttler der Workstation-Bank stellen und das System mit Waschpuffer und Regenerationslösung vorbereiten.Schalten Sie die Vibe-Arbeitsstation ein und schließen Sie die Systemzufuhr und -entsorgung an. Beginnen Sie mit dem Vorfüllen des Systems. Setzen Sie die Vibe-Kartusche ein.Führen Sie abschließend den Assay-Startassistenten aus. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm und beginnen Sie. Das Assaysignal wird mit der A MMP-Technologie gemessen. Wenn der Bead-Antigen-Hapten-Antikörper über die Hapten-Anti-Hapten-Wechselwirkung an den Sensor bindet, kehrt der Sensor durch Regeneration in den Ausgangszustand zurück, indem die immunologischen Komplexe entfernt werden. Dargestellt.Hier sehen Sie ein Beispiel für einen CHO H-C-P-A-M-M-P-Assay. Die Kalibrierungskurvenanalyse kann an Bioreaktorproben mit reproduzierbaren Ergebnissen durchgeführt werden. Diese Kalibrierungskurve gilt für ein Restprotein.Der A-A-M-M-P-Assay wird mit einem Vibe-Restprotein und einem Assay-Kit durchgeführt. Derselbe Kit kann für einen schnelleren Assay mit einer Inkubationszeit von 30 Minuten oder für empfindlichere Ergebnisse und einen breiteren dynamischen Bereich mit einer längeren Inkubationszeit verwendet werden. Die Vibe-Workstation kann ebenfalls für einen Produkt-Titer-Assay eingesetzt werden, der sich von anderen A-MMP-Assays unterscheidet.Dieser Test erfordert keine Probenvorbehandlung oder Kügelchen, und die Quantifizierung wurde bei Proben ohne Zentrifugation mit mehr als 10 Millionen Zellen verifiziert. Dargestellt ist hier eine Standardkurve des Signals, das mit dem Vibe-Bioanalyzer oder der Alpha-Screen-Technologie unter Verwendung rekombinanter GST-GAD-34-Ergebnisse auf der Vibe-Plattform erhalten wurde. Die Empfindlichkeit war hier um eine Größenordnung höher.Die Induktion von GAD 34 aus CWR 22-Xenotransplantaten wurde in Gegenwart oder Abwesenheit eines Bate-Proteasom-Inhibitors getestet, analysiert mittels Vibe, Bioanalyzer oder Alpha-Screen. Die Vibe-Plattform konnte empfindliche und reproduzierbare Ergebnisse in den in-vivo-Tumor-Xenotransplantaten liefern, während das Alpha-Screen-Signal mit zunehmenden Mikrogramm Protein nach der Entwicklung abgeschwächt wurde. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der onkologischen Wirkstoffentwicklung den Weg geebnet, um Wirkstoffinhibition in Tumorproben zu untersuchen, und hat effizientere Abläufe in biotechnologischen Anwendungen ermöglicht.

developing-custom-chinese-hamster-ovary-host-cell-protein-assays

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt einen Assay zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern aus Zellkulturflüssigkeit, die aus Eierstockzellen des chinesischen Hamsters gewonnen wurde. Es verwendet ein poröses Glasharz mit immobilisiertem Protein A, das an die Fc-Region der Antikörper in der Probe bindet und sie so effektiv von Verunreinigungen trennt. Die Verwendung eines Elutionspuffers mit niedrigem pH-Wert schwächt die Wechselwirkung und erleichtert die Gewinnung von gereinigten Antikörpern.

Eine Technik zur Aufreinigung monoklonaler Antikörper, die von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters produziert werden

Hier beschreiben wir einen chromatographischen Assay, gekoppelt mit der Ionen-Mobilität Trennung von Peptid-Vorstufen, gefolgt von den hochauflösenden (~ 30.000) MS-Detektion von Peptid-Fragmente für die Quantifizierung der Spike Peptid Standards in ein monoklonaler Antikörper Digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

Ein detailliertes Protokoll zur Reinigung und anschließenden Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF) automatisierter Mikrobioreaktoren wurde beschrieben. Die Verwendung von Analysen zur Bestimmung kritischer Qualitätsattribute (CQAs) und zur Maximierung des begrenzten Stichprobenvolumens zum Extrahieren wichtiger Informationen wird ebenfalls vorgestellt.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.

Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins

Das Protokoll stellt eine Methode zur Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus sezierten Gesichtsbehandlungen von Mausembryonen oder kultivierten embryonalen palatalen Mesenchymzellen der Maus und zur Durchführung eines anschließenden Western Blotting zur Beurteilung des phosphorylierten Proteinspiegels vor.

Isolierung von Ganzzellproteinlysaten aus Gesichtsprozessen der Maus und kultivierten palatalen Mesenchymzellen für die Phosphoproteinanalyse

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Es wird ein Protokoll zur Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCPs) aus Arzneimitteln (DP) und zum Nachweis von Peptiden mit Hilfe von Proteom-Anreicherungskügelchen vorgestellt. Die Methode wird anhand eines selbst hergestellten monoklonalen Antikörpers (mAb) Drug Substance (DS) demonstriert, der ein gut charakterisiertes Referenzmaterial für die Bewertung und den Vergleich verschiedener Methoden in Bezug auf die Leistung darstellt.

Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und funktionellen Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen vor. Dieses Protokoll stellt die Lentivirus-basierte Generierung von Hypoxie-sensitiven CAR-T-Zellen und deren Charakterisierung vor, einschließlich der Validierung der Hypoxie-abhängigen CAR-Expression und der selektiven Zytotoxizität.

Generierung und funktionelle Verifizierung von Hypoxie-sensitiven chimären Antigenrezeptor-T-Zellen

Exosomen besitzen ein erhebliches klinisches Potenzial, aber ihre praktische Anwendung ist aufgrund der einfachen In-vivo-Clearance und der schlechten Stabilität begrenzt. Mikronadeln stellen eine Lösung dar, indem sie eine lokalisierte Verabreichung ermöglichen, indem sie physiologische Barrieren durchstechen und den Trockenzustand konservieren, wodurch die Einschränkungen der Exosomenverabreichung behoben und ihr klinischer Nutzen erweitert wird.

Herstellung und Charakterisierung von Mikronadelpflastern für das Laden und Verabreichen von Exosomen

Erfahren Sie die Entwicklung robuster Immunoassays mit der ViBE-Plattform für reproduzierbare Ergebnisse bei minimalem Zeitaufwand. Diese Methode ermöglicht sensitive Analysen mit benutzerdefinierten Antikörpern.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Weitere Videos entdecken