Name: Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Lernen Sie die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidischen Mesophasen für die Strukturbiologie. Diese Methode nutzt LCP-FRAP zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen und ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Kristalle für die Röntgenkristallographie.

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Diese Arbeit wurde in Teilen durch die NIH gewährt GM073197 und RR025336 finanziert.

Eine typische Gliederung eines in meso Kristallisation Experiment ist in Abb. 1 1,2 dargestellt. Pre-Kristallisation LCP-FRAP-Assays sind optional, aber sie können erheblich beschleunigen den Prozess der Suche nach anfänglichen Kristallisation Bedingungen, insbesondere im Fall der schwer Membran Proteinen 3. 1. Protein Rekonstitution in LCP <ol><li> Purify ein Membranprotein von Interesse in einer Reinigungslösung und konzentrieren das Protein / Detergenz-Komplexen zu ~ 10 bis 20 mg / mL, dabei nicht über-Konzentrat das Waschmittel 1,4. </li><li> Transfer ~ 25 mg eines LCP-Host-Lipid (typischerweise Monoolein) oder einer Lipid-Mischung in eine 1,5 ml Plastikröhrchen und Inkubieren bei 40 ° C für wenige Minuten, bis die Lipid-schmilzt. </li><li> Bringen Sie eine Spritze Kupplung zu 100 ul gasdichte Spritze. </li><li> Legen Sie die Spritze mit dem geschmolzenen Lipid mit einem Volumen einstellbare Pipette. Notieren Sie die Lautstärke des Lipids in der Spritze. </li><li> Legen Sie weitere 100 ul Spritze mit dem Protein-Lösung bei einer Protein-Lösung-to-Lipid-Verhältnis 2 / 3 v / v. </li><li> Verbinden Sie beide Spritzen gemeinsam durch die Spritze Koppler. </li><li> Drücken Sie den Spritzenkolben abwechselnd an die Lipid-und Protein durch die innere Nadel des Kopplers bewegen, hin und her, bis die Lipid-Mesophase homogen wird. LCP bildet sich spontan auf ein mechanisches Mischen, und das Protein wird rekonstituiert in die Lipid-Doppelschicht der LCP. Die Bildung von LCP kann durch seine transparente und gelartige Konsistenz und durch das Fehlen der Doppelbrechung überprüft werden, wenn sie unter einem Mikroskop mit cross-Polarisatoren ausgestattet angesehen, oder, wenn möglich, durch kleine Winkel Röntgenbeugung 1. </li></ol> 2. LCP-FRAP Pre-Kristallisation Assays LCP-FRAP-Assays wurden entwickelt, um die Diffusion Eigenschaften von Membranproteinen rekonstituiert in LCP in einer Vielzahl von Screening-Bedingungen 3 zu messen. Die Langstrecken-Diffusion von Membranproteinen in LCP ist von wesentlicher Bedeutung für eine erfolgreiche Kristallisation, allerdings schränkt die Mikrostruktur von LCP Verbreitung von großen Proteinen oder oligomeren Protein-Aggregaten. Eine häufige Ursache für Ausfall eines in meso Kristallisation Experiment ist eine schnelle Protein-Aggregation führt zu einem Verlust der Diffusion. Es hat sich gezeigt, dass das Aggregationsverhalten des Proteins auf das jeweilige Protein zu konstruieren, die Host-Lipid-und die Zusammensetzung der Screening-Lösung 3 abhängt. <ol><li> Beschriften Sie die Protein mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Cy3 oder ähnlich) an ein Protein / Farbstoff-Verhältnis von ~ 100 / 1, entfernen Sie das nicht umgesetzte Farbstoff und konzentrieren das Protein ~ 1 mg / mL. Label entweder freie Amine oder freie Thiole. Bei der Kennzeichnung freie Amine, verwenden Sie pH-Wert zwischen 7 und 7,5 bis überwiegend Etikett der freien N-Terminus. Seien Sie sich bewusst, dass Aminosäuren Kennzeichnung können auch Label Lipiden mit dem Protein 2,3 co-gereinigt. </li><li> Lösen Sie das markierte Protein in LCP, wie in Abschnitt 1 beschrieben). </li><li> Set up Testplatten, wie in Abschnitt 3 beschrieben) mit LCP-FRAP Screening-Lösungen anstelle von Kristallisation Bildschirme 2. </li><li> Die Inkubation bei 20 ° C im Dunkeln für mindestens 12 Stunden, um einen Gleichgewichtszustand zu erreichen. </li><li> Legen Sie eine der Platten auf dem LCP-FRAP-Station und konzentrieren sich auf die erste Bohrung mit einem 10x-Objektiv. </li><li> Erwerben 5 Leuchtfarben Bilder auf den ersten Pre-gebleichten Zustand zu erfassen. </li><li> Auslöser des Lasers. 70% des markierten Proteins in der Mitte des gebleichten Fleck - Die Laserleistung und Anzahl der Impulse sollten zu bleichen ~ 30 eingestellt werden. </li><li> Unmittelbar nach dem Auslösen des Lasers, starten Sie die Aufnahme einer schnellen post-Bleichsequenz von ~ 200 Bilder mit der schnellstmöglichen Geschwindigkeit. </li><li> Folgen Sie mit der Aufnahme eines langsamen post-bleach Sequenz von ~ 50 Bilder, die Auswahl der Verzögerung zwischen den Bildern als 1-20 s, abhängig von der Diffusionsrate des Proteins. </li><li> Integrieren Sie die Intensität in der Bleich-Spot in allen Frames und korrigieren Sie zum Bleichen und Lichtintensitätsschwankungen bei der Akquisition, indem die Intensität im gebleichten vor Ort durch die gemittelte Intensität einer Referenz vor Ort außerhalb des Lasers gebleichten Bereich. </li><li> Normalisieren der korrigierten Intensität der Vor-gebleichtem Intensität gleich 1 und die anfängliche gebleichtem Intensität gleich 0 zu machen. </li><li> Fit der Kurve der normierten Intensität gegen die Zeit, F (t), mit der folgenden Gleichung 5: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1) wo M das mobile Bruchteil der diffundierenden Moleküle ist, T die charakteristische Diffusionszeit ist, t die Echtzeit von jedem aufgenommenen Bild, I 0 und I 1 sind die 0-te und 1. Ordnung modifizierten Bessel-Funktionen. </li><li> Berechnen Sie die Diffusionskoeffizienten, D, wie: D = R 2 / 4T, (Gleichung 2) wobei R der Radius des gebleichten Stelle. </li><li> Bewegen to den nächsten gut und wiederholen Sie die Schritte 2,5) - 2,13). </li><li> Vergleichen Sie die mobilen Fraktionen und Diffusionskoeffizienten für die verschiedenen Screening-Bedingungen erhalten. Design neuer Kristallisationspunkt Bildschirme auf Basis der Komponenten, Protein Diffusion und ohne Bedingungen, für die Protein-Diffusion nicht beobachtet wurde erleichtert. Wenn das Protein nicht diffuse in einem der abgeschirmten Bedingungen Erwägung einer Ausweitung des Screening-Raum oder versuchen ein neues Protein zu konstruieren. </li></ol> 3. Einrichten LCP Kristallisation Trials <ol><li> Lösen Sie das Protein in LCP, wie in Abschnitt 1 beschrieben). </li><li> Übertragen Sie die Protein-beladenen LCP in ein 10 l gasdichte Spritze an einem sich wiederholenden Spritzenspender. </li><li> Bringen Sie eine kurze austauschbare Nadel (Spurweite 26, 10 mm Länge), um die 10 l Spritze. </li><li> Geben Sie 200 nL Boli von LCP auf der Oberfläche von vier benachbarten Vertiefungen bilden ein 2x2-Quadrat. </li><li> Overlay jeder der LCP Boli mit 1 ul der entsprechenden Kristallisation Bildschirm-Lösung. </li><li> Cap vier beladene Brunnen mit einem 18 mm im Quadrat Deckglas. Tragen Sie einen sanften Druck auf das Deckglas in die Vertiefungen zu versiegeln. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4) -3,6) mit dem nächsten Satz von 4 Brunnen, bis die ganze Platte gefüllt ist. </li><li> Die Platte mit einer konstanten Temperatur, regelmäßige Überprüfung zur Kristallbildung und Wachstum. </li></ol> 4. Harvesting Kristalle aus LCP <ol><li> Legen Sie eine Platte mit Proteinkristallen unter einem Stereomikroskop mit variablem Zoom, mit einem linearen rotierenden Polarisator und Analysator ausgestattet. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf das Wohl von Interesse mit einem Low-Power-Zoom, so dass das ganze auch im Blickfeld platziert. </li><li> Ergebnis der Deckglas Glas in vier Schläge, einen Platz innerhalb der Grenzen und mit einem scharfen Ecke eines Keramikkapillare Schneiden von Stein. </li><li> Drücken Sie rund um die erzielte Umfang mit starken scharfen Punkt einer Pinzette die Kratzer, die durch die Dicke des Deckglases Glas ausbreiten. </li><li> Punch zwei kleine Löcher an gegenüberliegenden Ecken des Platzes erzielt. </li><li> Inject wenigen ul Fällungslösung durch eines der Löcher, um eine Dehydratation während der nachfolgenden Schritte zu reduzieren. </li><li> Mit einer abgewinkelten spitzen Nadel Fühlerbruch das Glas entlang einer oder zwei Seiten, die cut-out Platz frei. </li><li> Heben Sie das Glas Platz gerade für die kubische Phase Bolus. Wenn der Bolus den Deckglas geklebt wird, dann drehen Sie das Glas Platz über und auf dem Grund des Brunnens. </li><li> Fügen Sie ein zusätzliches paar ul Fällungslösung, ergänzt mit einem Kryo-Schutzmittel, falls erforderlich, auf der exponierten kubischen Phase Bolus in den Brunnen. </li><li> Erhöhung des Mikroskops und konzentrieren sich auf einen Kristall. </li><li> Passen Sie den Winkel zwischen dem Polarisator und den Analysator, um den Kontrast zwischen dem doppelbrechenden Kristall und dem Hintergrund zu erhöhen, und dabei genug Licht, um die Ernte Schleife zu sehen. </li><li> Wählen Sie einen MiTeGen MicroMount mit einem Durchmesser passenden Größe des Kristalls und dann ernten den Kristall direkt aus dem LCP mit einer Schöpfkelle in die MicroMount. </li><li> Flash-Freeze der MicroMount mit den geernteten Kristalle in flüssigem Stickstoff, und verschicken Sie es zu einem Synchrotron Source Beamline für X-ray-Daten Sammlung 6. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Eine manipulierte menschliche beta 2-adrenerge G-Protein-gekoppelten Rezeptor (β 2 AR-T4L) wurde in Baculovirus infizierten Sf9-Insektenzellen und gereinigt in Dodecylmaltosid (DDM) / Cholesteryl hemisuccinat (CHS) Reinigungslösung gebunden an eine partielle inverse Agonisten Carazolol 7 ausgedrückt. Das Protein wurde mit Cy3-NHS-Ester markiert und in LCP-FRAP Vorkristallisation Assays (Abbildung 2). Grobes Raster-Bildschirme von mehreren Bedingungen aus den Ergebnissen der LCP-FRAP-Assays ausgewählt wurden produziert erste Kristall-like hits (Abbildung 3). Weitere Optimierung der Fällungsmittel Bedingungen ergab Beugung Qualität Kristalle (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Flow-Diagramm eines typischen LCP Kristallisation Experiment. Schritte in den grauen Kästen sind nicht in der aktuellen Protokollen beschrieben. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. LCP-FRAP-Assay mit β 2 AR-T4L/carazolol in Monoolein Basis LCP. A) Ergebnisse einer LCP-FRAP-Assay in einer automatischen Hochdurchsatz-Modus durchgeführt, in denen jede Probe einer 96-Well-Platte sequentiell und gebleicht Fluoreszenz Erholung ist nach einer 30 min Inkubation gemessen. Die erhaltenen Fluoreszenz Erholungen, die den mobilen Teil in jeder Probe stellen, sind für alle 96 Proben aufgetragen. Die Screening-Lösungen enthalten 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 mit 48 verschiedene Salze in zwei verschiedenen Konzentrationen kombiniert. B) Fluorescence Recovery-Profile für mehrere reptreter Bedingungen. Die durchgezogene Linie Kurven stellen passt durch Gl. 1.Die mobilen Fraktionen und die Diffusionskoeffizienten werden anhand Gl. 1 und 2. Schnelle Wiederherstellung von weniger als 10% in der Probe mit Na-Chlorid ist darauf zurückzuführen, fluoreszenzmarkierten Lipiden mit dem Protein co-gereinigt. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Initial Kristall Hits von β 2 AR-T4L/carazolol durch ein grobes Raster-Screening rund vielversprechendsten Bedingungen durch LCP-FRAP identifiziert erhalten, mit Na-Sulfat (Panel A) und Na Formate (Panel B). Das Protein wird mit Cy3-NHS-Ester markiert und die Fluoreszenz-Bilder sind aufgenommen mit einer Anregung bei 543 nm und Emission bei 605 nm. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Optimized Kristalle von β 2 AR-T4L/carazolol. Die Bilder der Kristalle in Gegenwart von Na-Sulfat gewachsen (Abb. A und B) und K Formate (Panels C und D) sind in der Hellfeld-Modus (Abb. A und C) entnommen und mittels Cross-Polarisatoren (Platten B und D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

Die Protokolle bieten eine grundlegende visuelle Orientierung für die wichtigsten Schritte bei der Durchführung in meso Kristallisation Experimenten beteiligt. Weitere ausführliche Informationen im Zusammenhang mit diesen Protokollen, betont mögliche Fallstricke sind Mängel oder alternative Routen an anderer Stelle 1,2. Optional LCP-FRAP-Untersuchungen können in früheren Phasen helfen, die vielversprechendsten Protein zu konstruieren, LCP Host Lipid-und Lipid-Additive sowie das Spektrum der möglichen Fällungs-und Pufferbedingungen 3 zu wählen. Nach einer ersten Kristallisation Hit gefunden wird, sollte sie optimiert, um bessere Qualität Kristalle zu erhalten. Optimierung in meso Kristallisationsbedingungen ist im Wesentlichen ähnlich Optimierung der Bedingungen für lösliche Proteine ​​mit der Zugabe von zusätzlichen Parametern mit der Zusammensetzung des LCP 1 zugeordnet. Membrane Protein-Kristalle in Lipid-Mesophase gewachsen sind typischerweise kleiner als Kristalle in Wasch-Lösung erhalten, aber mehr bestellt, so profitiert stark von der Nutzung Mikrofokus Strahlrohre am modernen Synchrotron-Quellen 6 zur Verfügung. Viele der Verfahren im Zusammenhang mit in meso Kristallisation, einschließlich der Einrichtung Kristallisation oder Testplatten, die Durchführung von LCP-FRAP-Assays und Detektion Kristalle, wurden halb-oder vollautomatische 1,2,8,9, so dass Screening einer großen Reihe von Bedingungen und verbrauchen dabei kleine Mengen von Protein-und Lipid. Auf der anderen Seite bleiben Protein Rekonstruktionen in LCP und Kristall Ernte manuelle und langwierige Operationen und damit eine Notwendigkeit für Verbesserungen.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L gasdichte Spritze</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>Es werden 2 Spritzen benötigt</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L gasdichte Spritze</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenkupplung</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>Die Kupplung kann aus verfügbaren Bauteilen hergestellt werden, wie in den Referenzen 10 beschrieben</td></tr><tr><td>Wiederholende Spritzen-Dosiereinheit</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>Die wiederholende Spritzen-Dosiereinheit kann modifiziert werden, um das Dosierungsvolumen um etwa das 3-Fache zu reduzieren&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Kurze (0,375&amp;#8221;) abgeflachte, abnehmbare Nadel (Punktstil 3, Maß 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>96-Loch-Glas-Sandwichplatte</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>Für manuelle Operationen ist es praktischer, die Glas-Sandwichplatte aus Standard-Mikroskop-Glasobjektträgern und doppelseitigem Klebeband mit gestanzten Löchern zusammenzubauen&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Glas-Deckglas</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>Monoolein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisationsscreens</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>Die meisten verfügbaren kommerziellen Screens können für die anfängliche Screening-Phase verwendet werden. Bedingungen, die den LCP regelmäßig stören, können 2-fach verdünnt werden, um eine bessere Verträglichkeit zu erzielen&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Schneidstein für Kapillaren</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>Feinspitzzange</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Winklige spitze Sonde</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Wählen Sie den MicroMount-Durchmesser entsprechend der Kristallgröße aus</td></tr></tbody></table>

die kristallisation von membranproteinen in lipidische mesophasen

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membranproteine ​​erfüllen wichtige Funktionen in lebenden Zellen in Bezug auf Transduktion, Verkehr und Energie Transformationen und als solche sind in einer Vielzahl von Störungen und Erkrankungen beteiligt Signal. Jedoch ist eine strukturelle und funktionelle Verständnis von Membranproteinen stark hinterherhinken, dass ihrer löslichen Partnern, vor allem wegen Schwierigkeiten mit ihrer Solubilisierung und Generation der Beugung Qualität Kristalle verbunden. Kristallisation in Lipid-Mesophasen (auch in meso-oder LCP Kristallisation bekannt) ist eine vielversprechende Technik, die erfolgreich angewendet wurde, um hochauflösende Strukturen mikrobieller Rhodopsine, photosynthetischen Proteinen der äußeren Membran beta Fässer und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu erhalten. In meso Kristallisation nutzt eine native-like-Membran-Umgebung und in der Regel produziert Kristalle mit niedriger Lösemittelgehalt und besseren Ordnung zu herkömmlichen Kristallisation aus Wasch-Lösungen. Die Methode ist nicht schwierig, erfordert aber ein Verständnis der Lipidphase Verhalten und Praxis im Umgang mit viskosen Mesophase Materialien. Hier zeigen wir eine einfache und effiziente Art und Weise zu machen LCP und Wiederherstellung einer Membran-Protein in die Lipid-Doppelschicht der LCP mit einer Spritze Mischer, durch den Verzicht Nanoliter Teile des LCP in einem Test oder Kristallisation Platte, die Durchführung von Vor-Kristallisation Assays und Ernte Kristalle aus, gefolgt die LCP-Matrix. Diese Protokolle stellen ein grundlegender Leitfaden für die Annäherung in meso Kristallisation Studien, aber wie bei jeder Kristallisation Experiment umfangreichen Screening und Optimierung erforderlich sind, und ein erfolgreiches Ergebnis ist nicht unbedingt gewährleistet.

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membranproteine erfüllen kritische Funktionen in lebenden Zellen im Zusammenhang mit der Signaltransduktion, dem Transport und Energieumwandlungen und sind daher ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, hochwertige Kristalle eines Membranproteins für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie zu erhalten. Dies wird erreicht, indem das Protein in die Membran einer lipidischen kubischen Phase rekonstituiert und mit einer Fällungslösung inkubiert wird, wodurch aufgrund des großen Kristallisationsraums und der begrenzten Rückkopplung aus Kristallisationsexperimenten die Keimbildung und das Kristallwachstum induziert werden. Der Lipidkubische-Phase-Fluoreszenz-Wiederherstellungs-Test nach PHOTOBLEICHUNG oder der LCP-Frap-Prec-Kristallisationsassay wurde entwickelt, um die aussichtsreichsten Kristallisationsbedingungen auszuwählen.Dieser Assay verringert den Aufwand für das Screening und erhöht die Wahrscheinlichkeit, erste Kristallisationsansätze zu erhalten. Sobald erste Ansätze gefunden wurden, werden Optimierungsversuche durchgeführt, um das Kristallwachstum zu verbessern. Schließlich werden optimierte Kristalle gewonnen und zur Datensammlung an einer Synchrotronquelle in flüssigem Stickstoff eingefroren.Die Ergebnisse zeigen den effektiven Einsatz des LCP-FRA-Assays zur Gewinnung erster Kristalle des β2-Adrenozeptors in LCP, deren weitere Optimierung zu diffraktionsfähigen Kristallen führte. Diese Technik nutzt ein naturnahes Membranmilieu, das durch die wiederholte kubische Phase bereitgestellt wird, und führt typischerweise zu Kristallen mit geringem Lösungsgehalt und verbesserter Ordnung im Vergleich zur Kristallisation in Detergenzlösungen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die hohe Viskosität und die haitianischen Eigenschaften der lipidbasierten Mesophasen diese Materialien schwer handhabbar machen.Jedoch ist dieses Verfahren, sobald die richtigen Werkzeuge verwendet werden und die Technik beherrscht ist, nicht schwieriger als jede andere Protein-Kristallisationstechnik und eignet sich für Automatisierung und Hochdurchsatzanalyse. Beginnen wir also. Reinigen Sie das Membranprotein der Wahl in einer Detergenzlösung und konzentrieren Sie die Protein-Detergens-Komplexe auf etwa 10 bis 20 Milligramm pro Milliliter.Übertragen Sie etwa 25 Milligramm eines LCP-Wirtslipids oder einer Lipidmischung in ein Plastikröhrchen und inkubieren Sie es bei 40 Grad Celsius für einige Minuten, bis das Lipid geschmolzen ist. Befestigen Sie anschließend einen Spritzenkupplung an einer 100-Mikroliter-Gasspritzdichtung. Füllen Sie die Spritze mit dem geschmolzenen Lipid unter Verwendung einer Pipette mit einstellbarem Volumen.Notieren Sie das Volumen des Lipids in der Spritze. Befüllen Sie eine weitere 100-Mikroliter-Spritze mit ausreichend Proteingelösung, um ein volumetrisches Verhältnis von Proteingelösung zu Lipid von zwei zu drei zu erreichen. Verbinden Sie beide Spritzen über den Spritzenkoppler. Drücken Sie abwechselnd die Spritzenstößel, um das Lipid und das Protein durch die innere Nadel des Kopplers hin und her zu bewegen, bis die lipidische Mesophase homogen wird.LCP bildet sich spontan beim mechanischen Mischen, und das Protein wird in der Lipiddoppelschicht des LCP rekonstituiert. Die Bildung von LCP kann anhand seiner transparenten, gelartigen Konsistenz sowie durch das Fehlen von Doppelbrechung unter dem Mikroskop mit gekreuzten Polarisatoren oder, falls möglich, mittels Röntgen-Kleinwinkelstreuung verifiziert werden. Um LCP-FRAP-Assays zu beginnen, markieren Sie das Protein mit einem fluoreszenten Farbstoff im Verhältnis von etwa 100 Proteinmolekülen pro Farbstoffmolekül, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.Entfernen Sie den nicht reagierenden Farbstoff und konzentrieren Sie das Protein auf etwa ein Milligramm pro Milliliter. Rekonstituieren Sie das markierte Protein anschließend in LCP auf die gleiche Weise wie das nicht markierte Protein. Bereiten Sie die Assay-Platten vor.Unter Verwendung von LCP-Umhüllungs-Screening-Lösungen. Zunächst wird das proteinhaltige LCP in eine 10-Mikroliter-Gasspritze überführt, die an einen repetitiven Spritzenverteiler angeschlossen ist; anschließend wird eine kurze, abnehmbare Nadel an der 10-Mikroliter-Spritze befestigt. Geben Sie 200-Nanoliter-Portionen von LCP auf die Oberfläche von vier benachbarten Vertiefungen ab und überdecken Sie jede der LCP-Portionen mit einem Mikroliter der entsprechenden LCP-FRA-Screening-Lösung, sodass ein zwei mal zwei großes Quadrat entsteht.Nachdem die Screening-Lösung dispensiert wurde, verschließen Sie die vier beladenen Vertiefungen mit einem quadratischen Deckglas mit einer Kantenlänge von 18 Millimetern. Üben Sie sanften Druck auf das Deckglas aus, um die Vertiefungen abzudichten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den nächsten Satz von vier Vertiefungen, bis die gesamte Platte befüllt ist.Nach dem Befüllen die Platte mit Folie abdecken. Die Platten mindestens 12 Stunden bei 20 Grad Celsius inkubieren. Um einen Gleichgewichtszustand zu erreichen, eine der Platten auf die LCP-Frap-Station stellen und mit einem 10-fachen Objektiv auf das erste Loch fokussieren.Die FRAP-Datenaufnahme erfolgt automatisch mithilfe eines Image-Pro-Skripts, bei dem der Benutzer zunächst alle Aufnahmeparameter eingibt und anschließend den Startknopf drückt. Eine typische Aufnahmesequenz beginnt mit der Aufnahme von fünf vor der Bleiche aufgenommenen Bildern, danach wird der Bleichlaser ausgelöst, synchronisiert mit der Aufnahme einer schnellen Wiederherstellungssequenz von etwa 200 Bildern mit der maximal möglichen Geschwindigkeit, gefolgt von einer langsamen Wiederherstellungssequenz mit 50 Bildern und Zeitabständen von einer bis 20 Sekunden zwischen den Bildern, abhängig von der Proteindiffusionsrate. Nach Abschluss der Datensammlung wird die Intensität innerhalb der Bleichstelle sowie der Referenzstellen außerhalb des laserbleichen Bereichs in allen Bildern integriert und korrigiert.Die integrierte Intensitätskurve für Abweichungen, die durch Lichtfluktuationen und Ausbleichen während der Datenaufnahme verursacht werden, normalisiert die korrigierte Intensität, sodass die Intensität vor dem Ausbleichen gleich eins und die anfängliche Intensität nach dem Ausbleichen gleich null ist. Passen Sie die Kurve der normalisierten Intensität über der Zeit wie im schriftlichen Protokoll beschrieben an, um den mobilen Anteil und den Diffusionskoeffizienten zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das nächste Feld und vergleichen Sie die für die verschiedenen Screening-Bedingungen erhaltenen mobilen Anteile und Diffusionskoeffizienten. Entwerfen Sie neue Kristallisationsscreens basierend auf den Komponenten, die die Proteindiffusion förderten, und schließen Sie Bedingungen aus, bei denen keine Proteindiffusion beobachtet wurde, um LCP-Kristallisationsexperimente einzurichten.Rekonstituieren Sie das Protein wie zuvor in LCP, bereiten Sie dann Kristallisationsplatten wie für LCP-FRAP vor, jedoch mit Kristallisations-Screening-Lösungen. Alternativ können Kristallisationsversuche robotisch durchgeführt werden, sobald die Kristallisationsplatten vorbereitet sind; inkubieren Sie diese bei konstanter Temperatur und überprüfen Sie regelmäßig die Kristallbildung und das Kristallwachstum. Sobald die Protein-Kristalle gewachsen sind, stellen Sie eine Platte mit den Kristallen unter ein Stereomikroskop mit variabler Vergrößerung, das mit einem linearen rotierenden Polarisator und Analysator ausgestattet ist.Konzentrieren Sie sich auf das gewünschte Objektträgerloch, indem Sie einen niedrigen Vergrößerungszoom verwenden, sodass das gesamte Loch innerhalb des Sichtfeldes liegt. Ritzen Sie die Deckglasplatte in vier Strichen an, wobei ein Quadrat innerhalb der Grenzen des Lochs mit einer scharfen Ecke eines keramischen Kapillarschneidsteins erzeugt wird. Drücken Sie mit einer spitzen Pinzette mit scharfer Spitze entlang des angeritzten Umfangs, um die Kratzer durch die gesamte Dicke des Deckglases fortzupflanzen.Stechen Sie mit einem Glasstichel zwei kleine Löcher in gegenüberliegende Ecken des markierten Quadrats. Injizieren Sie einige Mikroliter der Präzipitationslösung durch eines der Löcher, um eine Austrocknung während der nachfolgenden Schritte zu vermindern. Zerbrechen Sie das Glas mithilfe einer scharfen Nadel mit abgewinkelter Spitze entlang einer oder zwei Seiten, um das ausgeschnittene Quadrat zu lösen.Heben Sie vorsichtig das Glasquadrat an und achten Sie dabei auf den kubischen Phasenbolus. Geben Sie gegebenenfalls einige zusätzliche Mikroliter Präzipitatorlösung, angereichert mit einem Kryoschutzmittel, auf den freigelegten kubischen Phasenbolus im Probennapf. Erhöhen Sie die Vergrößerung des Mikroskops und fokussieren Sie auf einen Kristall. Stellen Sie den Winkel zwischen Polarisator und Analysator so ein, dass der Kontrast zwischen dem Kristall und dem Hintergrund erhöht wird, wobei genügend Licht erhalten bleiben muss, um die Entnahmeschleife zu erkennen.Entfernen Sie anschließend überschüssiges Lipid und gewinnen Sie den Kristall direkt aus der LCP-Matrix, indem Sie ihn mit einer Mighty-Gen-Mikromontur abstechen, deren Durchmesser auf die Kristallgröße abgestimmt ist. Gefrieren Sie die Mikromontur mit dem gewonnenen Kristall in flüssigem Stickstoff ein und transportieren Sie sie zur Röntgenbeugungsdatenaufnahme an eine Synchrotron-Strahllinie. Der engineeringmodifizierte Beta-2-Adrenozeptor wurde mit dem S-SI-3-NHS-Ester markiert und in LCP-FREP-Kristallisationsassays im automatischen Hochdurchsatzmodus eingesetzt, wobei jede Probe einer 96-Loch-Platte nacheinander gebleicht wurde und die Fluoreszenzwiederherstellung nach einer 30-minütigen Inkubation gemessen wurde. Die ermittelten Fluoreszenzwiederherstellungen, die den mobilen Anteil in jeder Probe darstellen, werden für alle 96 Proben aufgetragen.Die Screening-Lösungen enthalten 0,1 molares Tris pH 8, 30 % Volumen pro Volumen PEG 400, kombiniert mit 48 verschiedenen Salzen in zwei unterschiedlichen Konzentrationen. Fluoreszenz-Recovery-Profile für mehrere repräsentative Bedingungen werden gezeigt. Die durchgezogenen Kurven stellen Anpassungen der normalisierten Intensität über die Zeit dar. Die schnelle Recovery von weniger als 10 % in der Probe mit Natriumchlorid ist auf fluoreszenzmarkierte Lipide zurückzuführen.Co-purifizierte mit dem Protein wurden anfängliche Kristallansätze des Beta-2-Adrenozeptors im Komplex mit Olol durch ein grobes Rasterscreening um die aussichtsreichsten Bedingungen herum erhalten, die mittels LCP-Frap mit Natriumsulfat und Natriumformiat identifiziert worden waren. Eine weitere Optimierung der Fällungsmittelbedingungen führte zu kristallographischer Qualität der Kristalle. Hier wurden die Bilder der Kristalle, die in Gegenwart von Natriumsulfat und Kaliumformiat gezüchtet wurden, im Hellfeldmodus aufgenommen.Dieselben Kristalle können auch mit gekreuzten Polarisatoren betrachtet werden. Nachdem die Rekonstitution von Proteinen in lipidischen kubischen Phasen beherrscht ist, kann diese innerhalb von 10 bis 15 Minuten abgeschlossen werden, und der manuelle Aufbau einer 96-Loch-Kristallisationsplatte erfolgt innerhalb einer Stunde. Ein L-three-B-wrap-Assay im Hochdurchsatzmodus benötigt etwa zwei Stunden pro 96-Loch-Platte, und die H-Kristallisation dauert ungefähr 10 bis 20 Minuten pro Vertiefung. Die in diesem Video gezeigten Verfahren bieten eine grundlegende Anleitung für die Durchführung von Membranproteinkristallisationsexperimenten.Jedoch ist, wie bei jedem Kristallisationsexperiment, ein umfangreicher Screen und eine Optimierung erforderlich, und ein erfolgreicher Ausgang ist nicht zwangsläufig garantiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

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Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

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Wir beschreiben Verfahren zur Herstellung und Abgabe von Membranprotein-Mikrokristallen in lipidischer kubischer Phase für die serielle Kristallographie an Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern und Synchrotronquellen. Diese Protokolle können auch für die Einarbeitung und Abgabe von löslichen Proteinmikrokristallen verwendet werden, was zu einem erheblich reduzierten Probenverbrauch im Vergleich zur Flüssiginjektion führt.

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Dieses Protokoll beschreibt einen Aufbau für die Kristallisation des Steroltransporters ABCG5/G8. ABCG5/G8 wird für die Hängetropfenkristallisation in Bizellen rekonstituiert. Das Protokoll erfordert keine speziellen Materialien oder Substrate, so dass es in jedem Labor zur Bestimmung der Proteinstruktur durch Röntgenkristallographie zugänglich und einfach angepasst werden kann.

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Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Lernen Sie die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidischen Mesophasen für die Strukturbiologie. Diese Methode nutzt LCP-FRAP zur Optimierung der Kristallisationsbedingungen und ermöglicht die Gewinnung hochwertiger Kristalle für die Röntgenkristallographie.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

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