Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, ein Axon zu verlängern und dabei die Kräfte präzise zu messen. Dies wird erreicht, indem eine direkt kalibrierte Drahtreferenznadel hergestellt wird. Anschließend werden kalibrierte, Zwischen- und Arbeitsnadeln im gewünschten Kraftbereich vorbereitet. Danach werden Wachstumskonen mit einer Arbeitsnadel gezogen, um ein Axon zu verlängern.

Die resultierende axonale Verlängerung wird aufgezeichnet, und die Kräfte werden basierend auf der Biegung der kalibrierten Nadel gemessen. Diese Methode kann zentrale Fragen zur Biophysik der Axonverlängerung beantworten. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie mit einem justierbaren Mikronadelzieher und Glas-Kapillarrohren Nadeln mit konisch zulaufenden Spitzen von etwa vier Millimetern Länge herstellen.

Bewahren Sie die Nadeln in einer abgedeckten 160 mm Petrischale auf. Stellen Sie anschließend eine Draht-Kalibrierungsnadel her, indem Sie einen Chromal-Draht mit 0,001 Zoll Durchmesser durch das Innere einer Glasnadel, deren Spitze abgebrochen ist, einführen. Ziehen Sie den Draht an der Spitze auf eine Länge von 26 Millimetern heraus und befestigen Sie ihn mit Sekundenkleber.

Biegen Sie das distale Ende des Drahtes über einen Millimeter zu einem Haken. Anschließend werden Mikro-Gewichte aus einem Meter 0,003-Zoll-Draht mit konstanter Dicke hergestellt. Um den Draht zu vermessen, befestigen Sie ihn mit Klebeband an einem Maßstab.

Um sicherzustellen, dass es so gerade wie möglich ist, wiegen Sie den einen Meter langen Draht und schneiden ihn präzise in ein Zentimeter lange Stücke. Biegen Sie mehrere Stücke des Drahts zu Vasen.

Die Kalibrierung der Drahtnadeln erfordert ein Stereomikroskop mit einer Messskala in vertikaler Ausrichtung und einen Mikromanipulator. Das Mikroskop wird um 90 Grad zur Seite gekippt. Mithilfe eines universellen Stativarms kann so die nach unten gerichtete Auslenkung der Drahtnadel beobachtet werden.

Befestigen Sie die Drahtnadel in einer Werkzeughalterung an einem Mikromanipulator, sodass sie senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops steht. Richten Sie den Haken der Drahtnadel mit einer Strichmarke aus. Hängen Sie das ein Zentimeter große Mikrogewicht an den Haken und notieren Sie die Auslenkung.

Die Biegekonstante des Referenzdrahtes entspricht der Masse des Mikrogewichts geteilt durch die beobachtete Auslenkung. Nach der Kalibrierung bereiten Sie die Nadel für den nächsten Schritt vor, indem Sie den Haken an der Wegmarke mit dem Rasiermesser abschneiden, um die Zwischenglasnadeln zu kalibrieren. Erforderlich ist ein umgekehrtes Mikroskop mit okularem Redle.

Auf einer Seite des Mikroskoptellers befindet sich ein mechanischer Mikromanipulator, der die Drahtnadel hält. Auf der anderen Seite befindet sich ein hydraulischer Mikromanipulator, der die Zwischenglasnadel bewegt. Mithilfe der Mikromanipulatoren werden beide Nadeln im Zentrum des optischen Feldes in einem 45-Grad-Winkel in einer 160 Millimeter mal 30 Millimeter großen Petrischale mit Wasser bei einer 10×-Vergrößerung justiert. Führen Sie anschließend eine Reihe von Auslenkungen für jede dieser Auslenkungen durch.

Notieren Sie die anfängliche Auslenkung und die endgültige Position bei Nullbelastung der Glasnadel nach der Entlastung. Dies ergibt 10 Datensatzpaare. Um die 10 Datensatzpaare für eine lineare Regression vorzubereiten, wird die anfängliche Auslenkung von der zweiten Zahl der aufgezeichneten Paare subtrahiert.

Fügen Sie fünf Kontrollpaare von null null zu den 10 experimentellen Datensätzen hinzu, um die lineare Regression bei null zu verankern, was keiner Auslenkung bei null Kraft entspricht. Berechnen Sie die lineare Regression mit diesen 15 Datensätzen.

Die Federkonstante der Zwischenglasnadel entspricht der bekannten Biegekonstante der Drahtnadel, dividiert durch die Steigung der Regressionsgeraden. Kalibrieren Sie anschließend die Arbeitsglasnadeln wie eben beschrieben anhand der Zwischenglasnadel. Glasnadeln mit weniger als zwei Mikrometern pro Mikrometer können leicht verkürzt werden, um sie in einen geeigneten Steifigkeitsbereich zu bringen.

Drücken Sie die zu beschichtenden Nadeln in die Seite eines Klumpens Ton, der über einem 10-Milliliter-Becherglas mit der Anhaftungsfaktor-Lösung gehalten wird, sodass die Nadelspitze nacheinander sequenziell in die Lösung eingetaucht wird. Tauchen Sie die Nadeln 30 Minuten lang in eine 0,1 %ige Polylysin-Lösung ein. Anschließend tauchen Sie die Nadeln 30 Minuten lang in Conval und a ein, während Sie die Nadeln mit Anhaftungsfaktoren behandeln.

Schalten Sie das Inkubatorsystem oder die Heizung der Mikroskopbühne ein, damit die Bühne den thermischen Gleichgewichtszustand erreicht. Die Arbeitsstation für das Ziehen, die auf einem vibrationsgedämpften Tisch steht, besteht aus einem umgekehrten Mikroskop, das mit einem hydraulischen Manipulator ausgestattet ist, der eine ausbalancierte, maßgeschneiderte Verlängerung hält, in die der Doppelwerkzeughalter eingefügt wird.

Setzen Sie eine nicht kalibrierte Referenznadel in einen Nadelhalter ein, sodass sie so weit wie möglich herausragt. Platzieren Sie diese Vorrichtung auf der rechten Seite des Doppelwerkzeughalters. Stecken Sie anschließend die behandelte Arbeitsnadel in einen Nadelhalter, sodass sie halb so weit herausragt wie die Referenznadel, und platzieren Sie sie auf der linken Seite des Doppelwerkzeughalters.

Stellen Sie den hydraulischen Mikromanipulator so ein, dass die vertikale Steuerung vollständig nach oben gefahren ist. Bringen Sie dann die beiden Nadelspitzen mithilfe der seitlichen Verstellschraube zusammen. Positionieren Sie die Nadel.

Überprüfen Sie also die Spitzenpaare seitlich mit dem Auge und verwenden Sie die richtige Oben-unten-Schraube, um die Spitzen in eine gemeinsame Ebene zu bringen. Schwenken Sie den Werkzeughalter und platzieren Sie die Nadelspitzen in den Lichtweg oberhalb der Medienoberfläche. Neigen Sie sie steil nach unten.

Ziehen Sie die Kugelgelenkschraube an der Basis fest. Fokussieren Sie über den Zellen nach oben auf den Boden der Petrischale mit dem 10x-Objektiv. Senken Sie die Nadeln in das Medium ab, um die Nadelspitzen im Sichtfeld des Mikroskops zu finden.

Bevor Sie die Nadeln zu weit in die Kulturschale hineinbewegen. Bewegen Sie die Nadel hin und her, vorwärts oder rückwärts, und suchen Sie nach ihrem Schatten. Sobald eine Nadel sichtbar ist, drehen Sie die Seitenschraube, um festzustellen, welche Nadel gefunden wurde.

Wenn es sich mit der Schraube bewegt, handelt es sich um die Referenznadel. Wenn nicht, ist es die kalibrierte Nadel. Sobald beide Nadeln positioniert sind, richten Sie sie mithilfe der Feinjustierung des Doppelwerkzeughalters aus.

Das Ziel besteht darin, dass die Nadelspitzen etwa 50 Mikrometer voneinander entfernt sind oder etwa einen Zoll auf dem Monitor. Der Referenzpunkt sollte weiter oberhalb der Kulturschale liegen und daher etwas unscharf sein. Wenn die Zugnadel scharf auf der Schale liegt, nehmen Sie ein Bild dieser endgültig justierten Position auf.

Der Abstand der Nadeln ist die Null-Referenzdistanz. Heben Sie die Nadeln über die Probenebene an und parken Sie sie am Rand des Sichtfelds. Wählen Sie ein experimentelles Axon unter Beachtung der Anleitungen im schriftlichen Protokoll aus.

Bewegen Sie die Nadeln nahe an das Wachstumskegel des Axons heran und nehmen Sie den Nullabstand erneut auf. Danach pumpen Sie Luft in den vibrationsgedämpften Tisch, um ein Wachstumskegel auf die Nadel zu bringen. Platzieren Sie die Zugnadel neben dem Wachstumskegel darunter und senken Sie anschließend die Nadel gegen den Boden der Schale ab.

Dadurch wird die Nadel nach oben ausgelenkt, verbiegt sich und gleitet entlang der Schale in das Wachstumskonus hinein, löst anschließend das Wachstumskonus ab und bewegt es nach oben. Drücken Sie die Nadel gerade fest genug gegen den Boden der Schale, sodass das Wachstumskonus sich um die Nadelspitze hakt, jedoch nicht so stark, dass es über die Nadel rutscht und rückwärts gleitet. Warten Sie 20 Minuten, damit sich der Halt festigen kann.

Wenn das Wachstumskegel auf der Nadel liegt, erzeugen Sie eine leichte Spannung, indem Sie die Nadel nach rechts bewegen und leicht anheben. Kompensieren Sie die Abwärtsbewegung der Nadel, indem Sie sie beim Anheben etwas nach vorne bewegen. Heben Sie die Nadel stufenweise an, bis der angeheftete Fortsatz senkrecht zur Nadel und über der Oberfläche der Petrischale verläuft. Das Ziehen erfolgt, indem die Nadeln vom Zellkörper weg bewegt werden.

In kleinen Schritten werden Kräfte als zunehmender Abstand zwischen den Nadeln beobachtet, während die Spannung allmählich erhöht wird. Achten Sie sorgfältig auf Anzeichen einer Ablösung des Wachstumskonus von der Nadel. Halten Sie den Mediumspiegel in der Petrischale durch stündliches Hinzufügen von Wasser aufrecht, um die Verdunstung auszugleichen.

Verwenden Sie eine Markierung an der Seite der Schale, um die anfängliche Tiefe anzuzeigen, und fügen Sie mit einer langen Pipette langsam Wasser an der Seite der Schale hinzu, weg von den Nadeln, am Ende eines Experiments. Überprüfen Sie vor dem Herausheben der Nadeln aus der Schale erneut den Nullabstand. Lesen Sie die Positionen der Nadeln entlang der horizontalen Achse auf dem Bildschirm ab.

Notieren Sie außerdem die Position des Zellkörpers und die Zeitpunkte, zu denen der Abstand zwischen den Nadeln abzüglich des unbelasteten Nullabstands, multipliziert mit der Biegekonstante der Nadel, den angewendeten Kraftmikrometern entspricht. Dargestellt ist hier ein Beispiel für ein Zellfeld mit mehreren möglichen Ansatzpunkten zur Steuerung der axonalen Entwicklung. Der horizontale Axon mit großem Wachstumskonus ist eine geeignete Auswahl.

Der Zellkörper wird nahe am Bildschirmrand positioniert, und die Nadeln werden nahe an das Wachstumskegel herangeführt. Es wird ein Bild der unbelasteten Nadeltrennung aufgenommen, die der Nullabstand ist. Bevor das Experiment beginnt, wird die Zugnadel gegen das Wachstumskegel gestellt, um zu überprüfen, ob eine spontane Anheftung erreicht werden kann.

Dann wird die Nadel etwas weiter in das Wachstumskonus hineingeschoben. Der Hochdruckmanöver erfolgt, indem die Nadel gegen den Boden der Petrischale abgesenkt wird, wodurch sich die Nadel verbiegt und in das Wachstumskonus hineingleitet, wodurch dieses gelöst wird. Ein kleiner Zuwachs an Vorwärtszugkraft wurde ebenfalls hinzugefügt.

Nach 15 Minuten scheint das Axon sich mit der Vorwärtsbewegung der Nadel verlängert zu haben. Anschließend wird die Zugkraft auf die ziehende Nadel erhöht, und das Anheben der Nadel beginnt. Weitere Zugkraft wird hinzugefügt, was sich in einer vergrößerten Distanz zwischen den Nadeln zeigt.

An diesem Punkt verlängert sich das Axon deutlich. Die Referenznadel hat sich nicht weiter vorgeschoben, aber das Axon ist in ihre Richtung gewachsen, wodurch die Spannung abnimmt. Außerdem wurden die Nadeln leicht angehoben.

Hier wird weiterhin mehr Zugspannung auf die Zugnadel ausgeübt. In Reaktion auf die Belastung durch die gebogene Zugnadel ist ein signifikantes Wachstum eingetreten. Am Ende des Experiments wird eine abschließende Nullabgleichprüfung durchgeführt.

Der gesamte Prozess wird in dieser Zeitrafferaufnahme gezeigt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nadeln kalibriert, das Wachstumskegel auf eine Nadel überträgt und die Kräfte während der Ausdehnung eines Axons misst.