Name: Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Lernen Sie die mechanische Manipulation von Neuronen zur Steuerung der Axonentwicklung mit kalibrierten Glasnadeln. Diese Methode ermöglicht präzise Kraftmessungen im Mikrodyne-Bereich während der Axonverlängerung.

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Wir bedanken uns für die wichtigen Beiträge von Dr. Robert E. Buxbaum in der Entwicklung dieser Methode.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Techniken anzuwenden und zu messen zellulärer Kräfte haben eine lange Geschichte 9. Unsere Methode wurde ursprünglich durch die Arbeit von Dennis Bray, der Glas-Nadeln ähnlich wie bei uns zu &quot;schleppen&quot; Neuronen mit einer konstanten Rate über einen motorisierten hydraulische Vorrichtung 10 verwendet motiviert. Es gibt viele alternative Mittel zur Anwendung Kräfte auf Zellen, die zählen: Schrittmotoren 11, magnetische Kügelchen 12, mikrofabrizierten Balken 13</su...

<table><tbody><tr><td>R-6-Kapillar</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>R-6-Glas, Außendurchmesser 0,9 mm, Innendurchmesser 0,6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH-Ziehgerät</td><td>Mecanex S.A., Genf, Schweiz</td><td>BB-CH-Ziehgerät</td><td>Modus 4 Alt verwenden mit CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>0,001&quot; Chromel-Draht</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>ungeschirmt, Thermoelementdraht, 50 ft Spule, jetzt Chromega genannt</td></tr><tr><td>0,003&quot; Konstantan-Draht</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>ungeschirmt, Thermoelementdraht, 50 ft Spule</td></tr><tr><td>feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox Nr. 5</td></tr><tr><td>universeller Mikroskop-Stativarm</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 oder 90430</td><td>die meisten Marken oder Typen von Stativarmen eignen sich für diesen Zweck</td></tr><tr><td>mechanischer Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>dreiachsiges, direktgetriebenes Grobmanipulationssystem</td></tr><tr><td>hydraulischer Mikromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>jetzt als MMO-203 erhältlich, Typ mit drei beweglichen Achsen</td></tr><tr><td>Nadelethalter</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>Satz mit 3 Stück</td></tr><tr><td>Einzelinstrumentenhalter</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>Doppelinstrumentenhalter</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>mechanischer Mikromanipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>Stangenhalterung, 1 Probenträger, RH Modell 430001</td></tr><tr><td>Joystick-Mech.-Mikromanipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Invertiertes Mikroskop</td></tr><tr><td>Vibraplane-Isolationstisch</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200-Serie</td><td>unser Modell ist 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>selbstgebaut (siehe Referenz 19)</td><td></td><td>Referenz 19, benötigt aktualisierten unten aufgeführten Regler</td></tr><tr><td>programmierbarer Temperaturregler</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>ersetzt den ausgemusterten PXV3-Temperaturregler</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Invertiertes Mikroskop, um 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 binokulares Auflichtmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>andere Auflichtmikroskope sind ebenfalls geeignet</td></tr></tbody></table>

mechanische manipulation von neuronen zu axonal entwicklungssteuerung

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Handy-Manipulationen und die Erweiterung der neuronalen Axone können mit kalibrierten Glas Mikro-Fasern für die Messung und Anwendung von Kräften in 10-1000 μdyne Bereich 1,2 erreicht werden. Kraftmessung durch Beobachtung des Hookeschen Biegen des Glases Nadeln, die durch eine direkte und empirische Methode 3 kalibrierten erhalten. Anforderungen an die Ausrüstung und Verfahren für die Herstellung, Eichung, Behandlung und Verwendung der Nadeln auf Zellen sind vollständig beschrieben. Die Kraft Regime bisher verwendeten und verschiedene Zelltypen, zu denen diese Techniken angewendet wurden demonstrieren die Flexibilität der Methode und dienen als Beispiele für zukünftige Untersuchungen 4-6 gegeben. Die technischen Vorteile sind die kontinuierliche &quot;Visualisierung&quot; der Kräfte, die durch die Manipulationen produziert und die Möglichkeit, direkt in eine Vielzahl von zellulären Geschehen einzugreifen. Dazu zählen direkte Stimulation und Regulation des axonalen Wachstums-und Ausfahren 7; sowie Ablösung und mechanische Messungen auf jeder Art von kultivierten Zellen 8.

Anwendungs-und direkte Messungen von Kräften auf Neuronen im 2-1000 Microdyne Bereich sind mit hoher Genauigkeit kalibriert Glasnadeln erreicht. Diese Methode kann verwendet werden zur Steuerung und Messung verschiedene Aspekte der axonalen Entwicklung, einschließlich der axonalen Initiierung, axonale Spannung, Geschwindigkeit der axonalen Dehnung und Kraftvektoren werden.

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Zellmanipulationen und die Verlängerung neuronaler Axone können mit kalibrierten Glasmikrofasern durchgeführt werden, die in der Lage sind, Kräfte im Bereich von ... zu messen und auszuüben.

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, ein Axon zu verlängern und dabei die Kräfte präzise zu messen. Dies wird erreicht, indem eine direkt kalibrierte Drahtreferenznadel hergestellt wird. Anschließend werden kalibrierte, Zwischen- und Arbeitsnadeln im gewünschten Kraftbereich vorbereitet. Danach werden Wachstumskonen mit einer Arbeitsnadel gezogen, um ein Axon zu verlängern.Die resultierende axonale Verlängerung wird aufgezeichnet, und die Kräfte werden basierend auf der Biegung der kalibrierten Nadel gemessen. Diese Methode kann zentrale Fragen zur Biophysik der Axonverlängerung beantworten. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie mit einem justierbaren Mikronadelzieher und Glas-Kapillarrohren Nadeln mit konisch zulaufenden Spitzen von etwa vier Millimetern Länge herstellen.Bewahren Sie die Nadeln in einer abgedeckten 160 mm Petrischale auf. Stellen Sie anschließend eine Draht-Kalibrierungsnadel her, indem Sie einen Chromal-Draht mit 0,001 Zoll Durchmesser durch das Innere einer Glasnadel, deren Spitze abgebrochen ist, einführen. Ziehen Sie den Draht an der Spitze auf eine Länge von 26 Millimetern heraus und befestigen Sie ihn mit Sekundenkleber.Biegen Sie das distale Ende des

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine einzigartige Tissue Engineering-Methode wurde entwickelt, um zahlreiche Nervenfasern in Kultur durch Rekapitulation Axon Stretch-Growth-länglich, eine Form des Nervensystems Wachstum, wobei die Nerven in Verbindung mit dem Wachstum der sich erweiternden Körper zu verlängern.

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduktion des neuronalen Wachstums

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Neuronale Morphogenese und Migration sind entscheidende Ereignisse zugrunde liegenden richtige Entwicklung des Gehirns. Hier beschreiben wir Verfahren zur genetischen Manipulation kultivierten zerebellären Körnerzellen und die Entwicklung von Kleinhirn für die Beurteilung der Morphologie und der Migrationseigenschaften von Neuronen.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Zwei-Photonen-Imaging, Laser Nanodissektions gekoppelt ist, sind nützliche Tools, degenerativen und regenerativen Prozessen im zentralen Nervensystem mit subzellulärer Auflösung zu studieren. Dieses Protokoll zeigt, wie beschriften, Bild-und sezieren einzigen Kletterfasern in der Kleinhirnrinde in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen: dreidimensionale mikrometergroße Konstrukte, die aus lang ausgerichteten axonalen Traktaten bestehen, die aggregierte neuronale Populationen umfassen, die in einem tubulären Hydrogel umhüllt sind. Diese lebenden Gerüste können als funktionelle Relais dienen, um neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren oder zu modulieren oder als biofidelische Testbetten, die grau-weiße Materie Neuroanatomie nachahmen.

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Dieses Verfahren beschreibt, wie man schnell Neuriten initiiert, verlängert und verbindet, die in mikrofluidischen Kammern organisiert sind, wobei Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen an Mikropipetten befestigt sind, die die Neuritendehnung begleiten.

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Neurit-Outgrowth-Assays liefern einen quantitativen Wert über regenerative neuronale Prozesse. Der Vorteil dieser halbautomatischen Software besteht darin, dass sie Zellkörper und Neuriten getrennt segmentiert, indem sie eine Maske erstellt und verschiedene Parameter wie Neuritenlänge, Anzahl der Verzweigungspunkte, Zell-Körper-Clusterfläche und Anzahl der Zellcluster misst.

Standardisierung einer neuartigen halbautomatischen Software zur Messung des Neuritenwachstums 

Dieses Protokoll beschreibt ein mikrofluidisches System, das die neuronale Stoffwechseldynamik nach axonaler Verletzung modelliert und Bildgebung, Multi-Omics-Analysen und mechanistische Studien des intrinsischen metabolischen Umbaus ermöglicht.

Mikrofluidischer Chip für axonale Verletzungsmodelle, Aufbau und Ermöglichung von Multi-Omics-Analysen

Lernen Sie die mechanische Manipulation von Neuronen zur Steuerung der Axonentwicklung mit kalibrierten Glasnadeln. Diese Methode ermöglicht präzise Kraftmessungen im Mikrodyne-Bereich während der Axonverlängerung.

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

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