Bioenergetische Profil Experiment mit C2C12 Myoblasten Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den funktionellen Status von Mitochondrien in lebenden Zellen und isolierten Mitochondrien zu testen, indem mehrere Parameter des oxidativen Stoffwechsels mit dem extrazellulären Flussanalysator XF 96 gemessen werden. Diese Parameter sind die basale Atmung, der A-TP-Umsatz, das Protonenleck und die maximale Atmung bzw. die freie Atemkapazität. Dies wird erreicht, indem sequenziell spezifische Modulatoren der mitochondrialen Atmung zu C zwei C 12-Myoblastenzellen hinzugefügt und die Änderung der Sauerstoffverbrauchsrate (OAR) gemessen wird, einem Indikator für die Atmung, die Umwandlung von Glukose in Laktat, die durch Glykolyse eine TP erzeugt.

Der andere wichtige Energieweg in Zellen wird ebenfalls als ECAR oder extrazelluläre Ansäuerungsrate gemessen. Es können Ergebnisse des mitochondrialen Profilings erzielt werden, die einen Einblick in die zentrale Rolle geben, die die mitochondriale Funktion bei der Bestimmung der Lebensdauer von Zellen spielt. Hallo, mein Name ist David Nichols.

Ich war meine ganze Karriere lang ein mitochondrialer Künstler und das wichtigste Gerät, das ich in meinem Studium verwendet habe, war die Sauerstoffelektrode. Wenn man die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme unter verschiedenen Bedingungen mit isolierten Mitochondrien messen kann, erhält man eine massiv wichtige Information. Wenn Sie zu Zellen übergehen, insbesondere zu Zellen, die in einer Multi-Well-Platte oder auf einem Deckglas kultiviert werden, funktionieren klassische Methoden nicht.

Dies ist ein großes Problem, das vor einigen Jahren durch die Entwicklung eines Multi-Well-Plattenassays überwunden wurde, der es uns ermöglicht, die Atmung von Zellen parallel in einem Multi-Well-Plattenformat zu untersuchen. Was Sie heute sehen werden, ist ein sehr einfaches, aber informationsreiches Experiment, das wir entwickelt haben, um die grundlegende mitochondriale bioenergetische Funktion in kultivierten Zellen zu überwachen. In XF 96 Zellkulturplatten mit 10.000 Zellen pro Well in 100 Mikrolitern Wachstum, Medium und Platz in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 10% Kohlendioxid.

Die Zellen können im XF 96, 24 Stunden nach der Aussaat, mit dem Assay untersucht werden. Der Assistent generiert eine Vorlage mit dem folgenden Gruppenlayout. Die Spalten eins bis 12 enthalten alle 10.000 C, zwei C 12 Zellen.

Die Gruppe eins in Blau wird als Kontrollzelle verwendet. Gruppe zwei in Rot wird die Medikamente Oligo Mycin, FCCP und Roone verabreicht. Als nächstes bereiten Sie die Verbindungen in einem X-F-D-M-E-M-Testmedium vor, wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben.

Oligo Mycin, FCCP, faul bekannt. Diese Verbindungen sind im XF cell MIT Stresstestkit vordispensiert. Ersetzen Sie mit der XF-Vorbereitungsstation das Wachstumsmedium durch das DMEM-Laufmedium.

Zum Schluss inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator ohne Kohlendioxid für 60 Minuten, damit sich die Zellen mit dem Assay-Medium vorbalancieren können, bevor Sie die injizierbaren Verbindungen in die Sensorkartusche geben und die Verbindungen auf 37 Grad Celsius bringen. Laden Sie sie dann wie folgt in die Injektoranschlüsse. Laden Sie für die Spalten eins bis vier 16, 18 und 20 Mikroliter XF-Assay-Medium oder DMEM in die Ports A, B bzw. C.

Laden Sie für die Spalten fünf bis 12 16 Mikroliter des gesamten Liga-Mycins in Port A, 18 Mikroliter FCCP in Port B und 20 Mikroliter bekanntes Rot in Port C. Definieren Sie als Nächstes das Protokoll Commands set loop to three times. Drei Minuten mixen und drei Minuten messen. Klicken Sie anschließend auf Start.

Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, die den Benutzer anleiten, wann die Patrone eingelegt werden muss, wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist. Befolgen Sie die Eingabeaufforderungen des Benutzers, und fügen Sie die Zellplatte für das Experiment hinzu. Klicken Sie dann auf Weiter und lassen Sie den Assay laufen.

Entfernen Sie die Platte, wenn das Experiment beendet ist. Dieser Assay leitet sich von dem klassischen Experiment zur Profilierung der mitochondrialen Funktion ab und dient als Rahmen für komplexere Experimente, die darauf abzielen, verschiedene zusammengesetzte Effekte auf den Zellstoffwechsel, die mitochondriale Funktion und die gesamten bioenergetischen Aktivitäten zu verstehen. Hier beobachteten wir die erwartete Reaktion auf den Sauerstoffverbrauch, wenn die Zellen mit jedem Erfolg der Verbindung behandelt wurden.

Für liga Mycin nahm Oard infolge der Blockierung einer TP-Synthese am mitochondrialen Komplex fünf ab. Da die Zellen nach einer Liga-Mycin-Behandlung nicht in der Lage waren, ein TP über oxidative Phosphorylierung zu synthetisieren, griffen sie auf die Glykolyse zurück, um ihren Bedarf an einem TP zu decken. So beobachteten wir einen Anstieg der ECAR, der extrazellulären Versauerungsrate, einem Indikator für die Glykolyse, wie zuvor gezeigt. FCCP wirkt als Entkopplungsmittel und hebt die Begrenzung des Protonenwiedereintritts auf.

Die Atmung beschleunigt sich und wird nun durch den Elektronentransport begrenzt. Schließlich hemmt Rote Known den mitochondrialen Komplex eins, wodurch der Elektronenfluss in der Elektronentransportkette zum Stillstand kommt und somit der Sauerstoffverbrauch drastisch reduziert wird. Hier werden Informationen über die basale Atmung der Zellen, den prozentualen Anteil des Sauerstoffverbrauchs, der für eine TP-Produktion aufgewendet wird, sowie die Menge, die für die Aufrechterhaltung des Protonengradienten aufgrund des Protonenlecks aufgewendet wird, erhalten.

Darüber hinaus können wir unter Bedingungen der ungekoppelten Atmung die maximale Atemfrequenz erhalten, die manchmal als freie Atemkapazität bezeichnet wird. Und schließlich können wir die Menge des Sauerstoffverbrauchs bestimmen, die nicht auf mitochondriale Prozesse zurückzuführen ist. Ihr habt es gerade mit dem Seepferdchen gesehen.

XF 96, eine Reihe von Experimenten, die eine enorme Menge an Informationen über die BIE-Energetik der Mitochondrien in der Zelle liefern. Das Basisexperiment, das so wichtig ist, wir nennen es Experiment Nummer eins, gibt Ihnen Informationen über die basale Atmung, den TP-Umsatz, das mitochondriale Protonenleck und die freie Atemkapazität. Diese Parameter geben Ihnen diese grundlegende Information über den bioenergetischen Status der Mitochondrien in der Zelle.