Name: Bioenergetische Profil Experiment mit C2C12 Myoblasten Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Lernen Sie die Bioenergetik-Profilierung von C2C12-Myoblasten mit dem XF 96-Extrazellulärflussanalysator. Diese Methode misst mitochondriale Atmung, ATP-Turnover und Protonenleckage für zelluläre Stoffwechselforschung.

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In diesem Experiment werden C2C12 Myoblasten Zellen bei einer gegebenen Dichte in Seahorse Zellkulturplatten ausgesät. Die basale Sauerstoffverbrauch (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung (ECAR) Preise sind gemessen zu den Ausgangswerten Preise zu etablieren. 1. Cells Injection Die Zellen sind metabolisch gestört durch drei Zugänge verschiedener Verbindungen (in Folge), dass die bioenergetische Profil der Zelle zu verschieben. Eine Gruppe wird als Kontrollgruppe dienen, mit fließendem Medien als Kontrolle "Verbindungen" aufgenommen. <ol><li> Die erste Injektion ist Oligomycin. Oligomycin hemmt die ATP-Synthese durch die Blockierung der Protonen-Kanal der F o Teil ATP-Synthase (Komplex V). In mitochondrialen Forschung ist es zum Zustand 3 (Phosphorylierung) Atmung verhindern. Mit Zellen, kann es verwendet werden, um den Prozentsatz der O2-Verbrauch gewidmet ATP-Synthese und der Prozentsatz der O2-Verbrauch benötigt, um die natürlichen Proton Leck in der inneren Mitochondrienmembran überwinden zu unterscheiden. </li><li> Die zweite Injektion ist FCCP. FCCP (Carbonyl Cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) ist ein Ionophor, dass eine mobile Ionen-Träger ist. Es ist eine Entkopplung Agenten, weil es die ATP-Synthese gestört durch den Transport von Wasserstoff-Ionen über die Membran der Mitochondrien statt des Protons Kanal der ATP-Synthase (Komplex V). Dieser Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials führt zu einem schnellen Verbrauch von Energie und Sauerstoff ohne die Erzeugung von ATP. In diesem Fall wird sowohl OCR und ECAR erhöhen, OCR durch Entkopplung und ECAR wie die Zellen auf ihre Energiebilanz durch Glykolyse zu ATP zu erzeugen halten versuchen. FCCP Behandlung kann verwendet werden, um den "Ersatz" respiratory Kapazität von Zellen, die als die quantitative Unterschied zwischen maximaler unkontrollierte OCR und der anfänglichen basalen OCR definiert ist zu berechnen. Es wurde vorgeschlagen, dass die Aufrechterhaltung der einige freie Atemwege Kapazität auch unter den Bedingungen der maximalen physiologischen oder pathophysiologischen Stimulus ein wichtiger Faktor der Definition der Vitalität und / oder das Überleben der Zellen ist. Die Fähigkeit von Zellen auf Stress unter den Bedingungen der erhöhten Energiebedarf reagieren, ist in einem großen Teil von der bioenergetischen Kapazität der Mitochondrien beeinflusst. Diese bioenergetischen Kapazität wird durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Fähigkeit der Zelle an das Substrat zu Mitochondrien und die Funktionsfähigkeit der Enzyme in Elektronentransport beteiligt liefern-vermint abschrecken </li><li> In der dritten Injektion wird Rotenon, ein Komplex I-Inhibitor, zu den Zellen gegeben. Dies wird heruntergefahren mitochondriale Atmung und ermöglichen sowohl die mitochondriale und nicht-mitochondriale Fraktionen beitragen, um die Atmung zu berechnen. Man wird beobachten, eine Abnahme der OCR Folge gestörter Funktion der Mitochondrien, mit einem gleichzeitigen Anstieg der ECAR wie die Zelle verlagert, um eine glykolytischen Staat, um ihre Energiebilanz zu erhalten Rotenon ist ein mitochondrialen Inhibitor, der die Übertragung von Elektronen von der Fe-S-Zentrum in Komplex I zu Ubichinon (Coenzym Q) verhindert. Diese Hemmung der Komplex I verhindert, dass die potentielle Energie in NADH davon entfernt, in nutzbare Energie in Form von ATP umgewandelt. </li></ol> 2. Reagenzien und Materialien <ol><li> Oligomycin, FCCP und Rotenon Solutions (Seahorse Mito Stress Test Kit) </li><li> DMEM Laufen Media (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Destilliertes Wasser (Gibco 15230-170) </li><li> Calibration-Puffer (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. Wachstumsmedium <ol><li> 500 ml DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 mL Penn / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 ml Natriumpyruvat (Sigma S8636) </li><li> 5 mL Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Seeding-Protokoll <ol><li> Die Zellen werden in XF96 Zellkulturen Platten mit 10.000 Zellen / well in 100 ul Wachstumsmedium ausgesät und in 37 ° C-Inkubator mit 10% CO 2. </li><li> Cells wird den XF96 Zellkulturplatte innerhalb von 1 Stunde zu halten. </li><li> Assay-Zellen in XF96 24 Stunden nach der Aussaat. </li></ol> 5. Vorbereitung der Assay-Vorlage <ol><li> Mit dem Assay-Assistenten (Anhang I), erzeugen eine Vorlage mit der folgenden Gruppe Layout: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Nun Grid-Layout zu identifizieren Spalte und Gruppenzugehörigkeiten </li></ol> 6. Compound Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Verbindungen in XF DMEM Assay Medien wie folgt: 10 uM Oligomycin, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM Rotenon, Diese Konzentrationen stellen die 10X Verdünnung vorgenommen, wenn die Verbindungen in den Brunnen eingespritzt wird. Die Arbeitsgruppe Konzentrationen sind: 1 uM Oligomycin, 3,0 uM FCCP, 2,0 uM Rotenone </li></ol> 7. Medien ändern und Cell Preparation <ol> Legen Sie die Zellplatte auf dem XF Prep Station <li> Stellen Sie die letzte Band des Mediums zu 160 ul pro Well. </li><li> Inkubieren in 37 ° C Inkubator ohne CO 2 für 60 Minuten, damit Zellen mit dem Assay-Medium pre-Gleichgewicht zu bringen. </li></ol> 8. Loading Sensor Cartridge <ol><li> Warm-Verbindungen auf 37 ° C vor dem Laden Fühlerpatrone und laden Sie die Verbindungen in den Injektor-Ports wie folgt: <ol><li> Spalten 1-4: Laden 16, 18, und 20 ul des XF Assay Medien (DMEM) in den Anschlüssen A, B und C sind. </li><li> Spalten 5-12: Lade 16 ul der Oligomycin in Häfen A Last 18 ul der FCCP in Häfen B Legen Sie 20 uL Rotenon in Häfen C </li></ol></li></ol> 9. Protokoll-Befehle <table border="1"><tbody><tr><td> Befehl </td><td> Zeit (min) </td><td> Port </td></tr><tr><td> Kalibrieren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Äquilibrieren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mischung </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Messen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Ende </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Protocol-Befehle

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers und David A. Ferrick sind Mitarbeiter von Seahorse Bioscience, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel vorgestellten produziert.

Dieser Assay ist von der klassischen Experiment, um die Funktion der Mitochondrien-Sonde abgeleitet und dient als Rahmen, mit denen bis zu komplexeren Experimenten an Verständnis verschiedene Veränderungen im Zellstoffwechsel, die Funktion der Mitochondrien, und die allgemeine Bioenergetik Ziel zu bauen. Alle Verbindungen in diesem Experiment verwendet werden, sollten für die Konzentration, die maximale Wirkung stellt optimiert werden. Das heißt, man muss getrennte Titration Experimente durchführen, um diese Werte zu ermitteln. Dies ist besonders wichtig mit FCCP, wie die Titrationskurve neigt dazu, ziemlich scharf, und zu viel FCCP kann tatsächlich abnehmen Reaktionen in OCR. Typische Bereiche (Endkonzentrationen) zu testen wäre: <ul><li> 0,1 bis 1,0 ug / ml Oligomycin </li><li> 0,1 bis 5,0 uM FCCP </li><li> 0,1 bis 1,0 uM Rotenone </li></ul> Beachten Sie, dass die Antworten auf jede Verbindung über (vor allem FCCP) von der Assay-Media-Komposition (Basistyp, [Glukose], [Pyruvat], Anwesenheit / Abwesenheit von BSA, usw.) beeinflusst wird. Ferner, wenn die XF-Assay Medien Zusammensetzung geändert wird, wird die Optimierung müssen neu durchgeführt werden. Das Vorhandensein und die Konzentration von Pyruvat ist besonders wichtig bei der Erlangung der maximalen Lungenkapazität durch FCCP. Seahorse Bioscience hat in einer Reihe von Zelllinien beobachtet, dass Unterlassung von Pyruvat die Fähigkeit der Zellen auf maximal reagieren (über dem Ausgangswert) auf FCCP hebt. In der Regel sollte die Konzentration von 1-10 mM Pyruvat getestet, um die optimale Konzentration von Pyruvat zu verstehen, um eine maximale Atmung zu erhalten. Beachten Sie, dass [Pyruvat] UND [Glukose] muss möglicherweise "cross-Titration", die optimal media Bedingungen für das Experiment zu erhalten. Typische Ergebnisse dieses Experiments sind unten in ein Diagramm, das OCR-Zeit und eine andere Darstellung ECAR gegen die Zeit dargestellt: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. OCR gegen die Zeit <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. ECAR gegen die Zeit Hier beobachteten wir die erwarteten Antworten in OCR und ECAR wie die Zellen mit jeder Verbindung behandelt werden. Für Oligomycin, OCR als Folge der Blockierung der ATP-Synthese in Mitochondrien Complex V. Da die Zellen nicht in der Lage ATP über OXPHOS synthetisieren, sie Glykolyse zurückgreifen, um ihre Forderung nach ATP erfüllen abnimmt, so beobachten wir eine Zunahme in ECAR. Wie zuvor gezeigt, wirkt FCCP als Entkopplung Agenten. Da die Zellen nun überwunden werden muss das Proton Leck über die innere Membran der Mitochondrien erhöht OCR signifikant mehr O2 verbraucht wird, um die überschüssige Protonen wieder Pumpe über den mitochondrialen Membran. Schließlich hemmt Rotenon mitochondrialen Komplex I und Komplex III verbunden, die bewirkt, dass der Fluss der Elektronen in der Elektronen-Transportkette einzustellen und damit den Verbrauch von O2 wird drastisch reduziert. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Respiration Parameter Über die zu erwartenden Veränderungen in Atmung und ECAR, kann eine Reihe von respiratorischen Parameter aus diesen Daten gewonnen werden. Dies ist in der obigen Abbildung zusammengefasst: Hier sehen wir, dass wir Informationen über die basale Atmung der Zellen, der prozentuale Anteil der O2-Verbrauch gewidmet ATP-Produktion sowie die Höhe gewidmet Aufrechterhaltung des Protonengradienten (durch H + Leck) zu erhalten. Ferner können wir die maximale Atemfrequenz unter den Bedingungen der entkoppelten Atmung (manchmal auch als Ersatz Atemkapazität genannt) zu erhalten und schließlich können wir die Menge der O2-Verbrauch nicht durch mitochondriale Prozesse zu bestimmen. Eine rasch wachsende Zahl von Studien beschäftigen diese mitochondriale Profil zellulären Bioenergetik bewerten, mitochondriale Dysfunktion und die Fähigkeit von Zellen, um Stress und / oder Beleidigungen reagieren vorherzusagen. Für weitere Informationen und Details zu diesem experimentellen Methode und die Idee der freien Atemkapazität finden Sie beziehen sich auf die folgenden Veröffentlichungen 1-8.

<table><tbody><tr><td>Lösungen aus Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin A</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Seahorse Mito-Stress-Test-Kit</td></tr><tr><td>DMEM-Laufmedium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrierpuffer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioenergetische profil experiment mit c2c12 myoblasten cells

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel zu messen und zu verstehen, mitochondriale Dysfunktion, hat Wissenschaftler aus aller Welt ihre Forschungsergebnisse zum Verständnis der Rolle der mitochondrialen Funktion in Fettleibigkeit, Diabetes, Alterung, Krebs, Herz-Kreislauf-Funktion und Sicherheit Toxizität vorab aktiviert. Der Zellstoffwechsel wird der Prozess der Substrat-Aufnahme, wie Sauerstoff, Glukose, Fettsäuren und Glutamin, und der anschließenden energetischen Umwandlung durch eine Reihe von enzymatisch gesteuerten Oxidations-und Reduktions-Reaktionen. Diese intrazellulären biochemischen Reaktionen führen in der Produktion von ATP, der Freisetzung von Wärme und chemische Nebenprodukte, wie Laktat und CO 2 in die extrazelluläre Umgebung. Der Sauerstoffverbrauch Rate - - oder OCR wertvolle Einblicke in den physiologischen Zustand der Zellen und die Veränderung des Status dieser Zellen kann durch Messung der Geschwindigkeit der Sauerstoff durch die Zellen, ein Indikator für die mitochondriale Atmung verbraucht gewonnen werden. Cells auch erzeugen ATP durch Glykolyse, dh: die Umwandlung von Glukose zu Laktat, unabhängig von Sauerstoff. In kultivierten Brunnen, wird Laktat die primäre Quelle von Protonen. Die Messung der Milchsäure indirekt über Protonen in den extrazellulären die Zellen umgebende Medium freigesetzt, die Ansäuerung des Mediums bietet die Extra-Cellular Ansäuerungsrate Ursachen hervorgerufen - oder ECAR. In diesem Experiment werden C2C12 Myoblasten Zellen bei einer gegebenen Dichte in Seahorse Zellkulturplatten ausgesät. Die basale Sauerstoffverbrauch (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung (ECAR) Preise sind gemessen zu den Ausgangswerten Preise zu etablieren. Die Zellen werden dann metabolisch gestört durch drei Zugänge verschiedener Verbindungen (in Folge), dass die bioenergetische Profil der Zelle zu verschieben. Dieser Assay ist von einem klassischen Experiment, um zu beurteilen Mitochondrien abgeleitet und dient als Rahmen, mit denen komplexere Experimente an Verständnis sowohl physiologische und pathophysiologische Funktion der Mitochondrien Ziel zu bauen und auf die Fähigkeit von Zellen, um Stress und / oder Beleidigungen reagieren vorherzusagen.

Eine Beschreibung eines Verfahrens zur Profilierung die Funktion der Mitochondrien in den Zellen ist. Die Mitochondrien-Profil generiert bietet vier Parameter der mitochondrialen Funktion, die in einem Experiment gemessen werden kann: basale Atemfrequenz, ATP-linked Atmung, Proton auslaufen und Reservekapazität.

Bioenergetische Profil Experiment mit C2C12 Myoblasten Cells

Die Fähigkeit, den Zellstoffwechsel zu messen und mitochondriale Dysfunktionen zu verstehen, hat Wissenschaftler weltweit ermöglicht, ihre Forschung in ... voranzutreiben.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den funktionellen Zustand von Mitochondrien in lebenden Zellen und isolierten Mitochondrien zu überprüfen, indem mehrere Parameter des oxidativen Stoffwechsels mit dem XF 96 Extrazellulären Fluss-Analysator gemessen werden. Diese Parameter sind die basale Atmung, die ATP-Umsatzrate, der Protonenleckfluss sowie die maximale Atmung oder die verfügbare respiratorische Kapazität. Dies wird erreicht, indem spezifische Modulatoren der mitochondrialen Atmung nacheinander zu C2C12-Myoblastenzellen hinzugefügt werden, und anschließend die Änderung der Sauerstoffverbrauchsrate, also der OAR, als Indikator der Atmung, sowie die Umwandlung von Glukose zu Lactat, die über die Glykolyse ATP erzeugt, gemessen wird.Der andere wichtige Energiepfad in Zellen wird ebenfalls als ECAR oder extrazelluläre Säurebildungsrate gemessen. Es können mitochondriale Profilierungsresultate erhalten werden, die Einblicke in die zentrale Rolle geben, die die mitochondriale Funktion bei der Bestimmung der Lebensdauer von Zellen spielt. Hallo, mein Name ist David Nichols.Ich bin schon mein ganzes Berufsleben lang ein „mitochondrialer Künstler“ gewesen, und das wichtigste Gerät, das ich in meinen Studien verwendet habe, war die Sauerstoffelektrode. Wenn man die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme unter verschiedenen Bedingungen mit isolierten Mitochondrien messen kann, erhält man äußerst wichtige Informationen. Wenn man jedoch zu Zellen übergeht, insbesondere zu Zellen, die in einer Mehrfachbrunnenplatte oder auf einem Deckglas kultiviert werden, versagen die klassischen Methoden.Dies ist ein großes Problem, das vor einigen Jahren durch die Entwicklung eines Mehrmuldenplatten-Assays gelöst wurde, der es uns ermöglicht, die Atmung von Zellen parallel im Format einer Mehrmuldenplatte zu untersuchen. Was Sie heute sehen werden, ist ein sehr einfaches, aber informationsreiches Experiment, das wir entwickelt haben, um die grundlegende mitochondriale bioenergetische Funktion in kultivierten Zellen zu überwachen. Zunächst säen Sie Zellen in XF 96-Zellkulturschalen mit 10.000 Zellen pro Mulde in 100 Mikrolitern Wachstumsmedium und stellen sie in einen 37 °C warmen Inkubator mit 10 % Kohlendioxid.Die Zellen können 24 Stunden nach der Aussaat im XF 96 analysiert werden, wobei der Assay verwendet wird. Der Assistent erstellt eine Vorlage mit der folgenden Gruppenanordnung. In den Spalten eins bis zwölf befinden sich jeweils 10.000 C zwei C 12-Zellen.Gruppe eins in Blau dient als Kontrollzellen. Gruppe zwei in Rot erh&auml;lt die Wirkstoffe Oligo Mycin, FCCP und Roone. Bereiten Sie anschlie&szlig;end die Verbindungen in X-F-D-M-E-M-Assaymedium gem&auml;&szlig; des schriftlichen Teils des Protokolls vor.Oligomycin, FCCP, Rotenon. Diese Verbindungen sind im XF Cell Mito Stress Test Kit vorportioniert enthalten. Ersetzen Sie mit der XF-Probenvorbereitungsstation das Wachstumsmedium durch DMEM-Laufmedium.Incubieren Sie die Zellen abschließend 60 Minuten lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator ohne Kohlendioxid, um die Zellen mit dem Assay-Medium vorab zu equilibrieren, bevor die injizierbaren Verbindungen in die Sensorpatrone gegeben werden. Erwärmen Sie die Verbindungen auf 37 Grad Celsius und laden Sie sie anschließend wie folgt in die Injektorports. Für die Spalten eins bis vier geben Sie jeweils 16, 18 und 20 Mikroliter XF-Assay-Medium oder DMEM in die Ports A, B und C.Für die Spalten fünf bis zwölf pipettieren Sie 16 Mikroliter aller Liga-Mycin in Port A, 18 Mikroliter FCCP in Port B und 20 Mikroliter Rotenon in Port C. Definieren Sie als Nächstes den Protokollbefehl: Schleife auf drei Wiederholungen setzen. Mischen für drei Minuten und Messung für drei Minuten. Klicken Sie danach auf Start.Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, die den Benutzer darüber informieren, wann die Kartusche geladen werden muss, nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist. Befolgen Sie die Benutzerhinweise und fügen Sie die Zellplatte für das Experiment hinzu. Klicken Sie anschließend auf „Weiter“ und lassen Sie den Assay laufen.Entfernen Sie die Platte, wenn das Experiment beendet ist. Dieser Assay leitet sich vom klassischen Experiment zur Charakterisierung der mitochondrialen Funktion ab und dient als Grundlage, um komplexere Experimente aufzubauen, die darauf abzielen, die unterschiedlichen Wirkungen von Verbindungen auf den Zellstoffwechsel, die mitochondriale Funktion und die gesamten bioenergetischen Aktivitäten zu verstehen. Hier beobachteten wir die erwartete Reaktion der Sauerstoffverbrauchsrate, während die Zellen nacheinander mit jeder Verbindung behandelt wurden.Die ATP-Synthese sank infolge der Blockade der mitochondrialen Komplex-V-Aktivität durch Oligomycin. Da die Zellen nach der Oligomycinbehandlung kein ATP mehr durch oxidative Phosphorylierung synthetisieren konnten, kehrten sie zur Glykolyse zurück, um ihren ATP-Bedarf zu decken. Daher beobachteten wir einen Anstieg der ECAR, der extrazellulären Säuerungsrate, einem Indikator für die Glykolyse, wie zuvor gezeigt. FCCP wirkt als Entkopplungsmittel und beseitigt die Begrenzung des Protonenrückstroms.Die Atmung beschleunigt sich und ist nun durch den Elektronentransport begrenzt. Schließlich hemmt Rote bekannt Komplex I der Mitochondrien, wodurch der Elektronenfluss in der Atmungskette zum Erliegen kommt und somit der Sauerstoffverbrauch drastisch vermindert wird. Hier erhält man Informationen über die basale Atmung der Zellen, den Prozentsatz des Sauerstoffverbrauchs, der der ATP-Produktion dient, sowie die Menge, die zur Aufrechterhaltung des Protonengradienten aufgrund von Protonenleckage benötigt wird.Außerdem können wir die maximale respiratorische Rate unter Bedingungen entkoppelter Atmung erhalten, manchmal auch als spare respiratorische Kapazität bezeichnet. Und schließlich können wir die Menge des Sauerstoffverbrauchs bestimmen, die nicht auf mitochondriale Prozesse zurückzuführen ist. Sie haben dies gerade mit dem Seahorse gesehen.XF 96, eine Versuchsreihe, die umfangreiche Informationen über die bioenergetischen Vorgänge in den Mitochondrien der Zelle liefert. Der grundlegende Versuch, der von so großer Bedeutung ist, den wir Versuch Nummer eins nennen, liefert Daten zur basalen Atmung, zum ATP-Umsatz, zum mitochondrialen Protonenleck und zur verfügbaren respiratorischen Kapazität. Diese Parameter liefern grundlegende Informationen über den bioenergetischen Zustand der Mitochondrien in der Zelle.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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