Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Biobeschichtungen, die sich auf Zahnoberflächen bilden, sind äußerst komplex und strukturiert. Mikrobielle Gemeinschaften sind in einer extrazellulären Matrix eingebettet und ständigen Umweltbelastungen ausgesetzt. Das übergeordnete Ziel hier ist es, zwei spezifische Bestandteile eines analytischen Werkzeugsatzes vorzustellen, der darauf ausgelegt ist, strukturelle und molekulare Untersuchungen unter Berücksichtigung der komplexen Natur oraler Biofilme zu erleichtern, indem eine neuartige Fluoreszenz-Bildgebungstechnik mit einer maßgeschneiderten Software zur Datenverarbeitung und -analyse kombiniert wird.

Dies wird erreicht, indem zunächst spezifische Assays für die Biofilmanalyse, Transkriptom- und Strukturanalyse ausgewählt werden, einschließlich eines neuen Ansatzes zur konfokalen Bildgebung zur simultanen Visualisierung von EPS und Bakterien. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Rohdaten aus den Bioassays zu sammeln. Der dritte Schritt ist die Verarbeitung der Rohdaten mit spezieller Software, einschließlich des neu entwickelten Programms duo stat für die Kolokalisationsanalyse.

Der letzte Schritt besteht darin, die Prozessdaten zu analysieren, einschließlich der Nutzung von Software zur Datenmining und Organisation von Microarrays, dem Microarray Data Visualizer oder MDV. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie orale Pathogene ihr Transkriptom und die Architektur der Biofilme als Reaktion auf komplexe Ernährung und Wirt-Mikrobiom-Interaktionen verändern, und zwar mithilfe unseres einzigartig integrierten analytischen Werkzeugs, das eine umfassendere Analyse von Biofilmen und eine bessere Dateninterpretation ermöglicht. Hallo, mein Name ist Michelle Kuh, außerordentliche Professorin im Zentrum für orale Biologie am University of Rochester Medical Center.

Heute stellen wir einen analytischen Werkzeugkasten für die Biofilmanalyse vor. Dieser Werkzeugkasten kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biofilmforschung zu beantworten, beispielsweise wie die Biofilmzellen strukturiert sind, wie sie mit der extrazellulären Matrix angeordnet sind und wie sie auf komplexe Umweltreize auf Transkriptom-Ebene reagieren. Mein Name ist Jean, sie, ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. K.

Heute werde ich den Bildgebungsteil unserer Toolbox demonstrieren. Hallo, ich bin Aise Klein. Ich bin wissenschaftliche Assistentin am Labor von Dr. K.

Heute werde ich die MDV-Software zur Analyse von Mikrostrahldaten vorstellen. In diesem Verfahren werden mit Speichel beschichtete Hydroxylapatit-Scheiben als Zahnoberflächenmodelle verwendet, auf denen Biofilme gezüchtet werden. Geben Sie zunächst 2,8 Milliliter Kulturmedium, das mit S. mutans inkubiert wurde, in jedes Loch einer 24-Loch-Platte, schützen Sie die Platte vor Licht, geben Sie den dextrin-konjugierten LOR 6 47-Farbstoff in jedes Loch bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um den Farbstoff gleichmäßig im Kulturmedium zu verteilen.

Danach die sterilen, mit Speichel beschichteten Hydroxylapatitscheiben mithilfe steriler Pinzette zweimal in steriler AB-Pufferlösung spülen, um überschüssigen Speichel oder nicht gebundene Speichelbestandteile zu entfernen. Anschließend die Scheiben senkrecht in das mit Farbstoff angereicherte Kulturmedium geben und sicherstellen, dass jede Scheibe vollständig untergetaucht ist. Die Platte mit Aluminiumfolie abdecken und 20 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator inkubieren, damit sich Biofilme bilden und die konjugierte Textur in die von den Bakterienzellen produzierten exopolysaccharidischen Substanzen eingebaut werden kann.

Um die Bakterienzellen zunächst zu markieren, bereiten Sie eine 24-Loch-Platte mit jeweils 2,8 Milliliter sterilen Milli-Q-Wasser pro Loch vor. Geben Sie 1,5 Mikroliter Cyto-Nine-Farbstoff zu jedem Loch, um eine Endkonzentration von einem Mikromolar zu erreichen, und schützen Sie die Platte vor Licht. Sobald der Biofilm gebildet ist, nehmen Sie die Platte mit den Scheiben aus dem Inkubator und tauchen Sie sie ein.

Jedes Plättchen in einer Lösung von 0,89 % Natriumchlorid waschen. Anschließend in die neue Platte mit der Cytokinin-Farbstofflösung überführen. Die Platte mit Aluminiumfolie abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nachdem die Zellen angefärbt wurden, spülen Sie die Biofilme und das Natriumchlorid wie zuvor ab. Lösen Sie dann mithilfe einer Pinzette die Biofilme vom Draht in eine Petrischale, die Natriumchlorid enthält. Wickeln Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie ein.

Die Biofilme sind nun bereit zur Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie unter Verwendung eines Laser-Scanning-Konfokalmikroskops. Scannen Sie jeden Biofilm an fünf bis zehn zufällig ausgewählten Positionen und erzeugen Sie an jeder Position eine Z-Serie. Öffnen Sie die konfokalen Bilder und verarbeiten Sie sie mit einer Spiegel-Software, um 3D-Rekonstruktionen zu ermöglichen.

Diese dreidimensionale Darstellung von konfokalen Aufnahmen, die mit dem Programm Amira erstellt wurde, zeigt einen Biofilm von S-Mutanten, der auf der apathetischen Oberfläche mithilfe des demonstrierten Verfahrens gebildet wurde. Bakterienzellen und Mikrokolonien sind in Grün sichtbar und in der Biofilmmatrix eingebettet, die Exopolysaccharide enthält. In Rot kann eine vergrößerte Ansicht eines ausgewählten Bereichs erzeugt werden, die die spezifische räumliche Beziehung zwischen Bakterien und EPS auf mikroskopischer Ebene veranschaulicht.

Verwenden Sie das Duos-Stat-Programm, um die Menge der Kolokalisation separater Biofilmkomponenten wie Bakterien und exopolysaccharide zu quantifizieren. Legen Sie zunächst den Pfad des neu entwickelten Duo-Stat in MATLAB-Version 5.1 fest und öffnen Sie die Bilddateien, die die Z-Serienbilder der beiden Biofilmkomponenten enthalten. Wählen Sie anschließend zwei Kanäle aus, die korreliert und analysiert werden sollen.

Die beiden Bildstapel müssen in allen Dimensionen identische Pixelgrößen und die gleiche Anzahl von Bildern in jedem Stapel aufweisen. Legen Sie die Schwellenwerte für jeden Kanal fest und befolgen Sie die Anweisungen in der Software-Oberfläche. Geben Sie die Daten zur Analyse in die Datenauswertungsdatei ein. Diese Abbildung zeigt, wie der Duo-Stapel die räumliche Beziehung zwischen Bakterien und DBS quantitativ interpretiert.

Innerhalb des Biofilms berechnet Duo Stack die vertikale Verteilung von Bakterien und EPS von der Scheibenoberfläche bis zur flüssigen Phase, wie hier durch die grüne Linie für Bakterien und die rote Linie für EPS dargestellt. Es berechnet außerdem die Kolokalisation von Bakterien und EPS über die gesamte Biofilmdicke. Wie durch die gelbe Linie gezeigt, weisen die Daten über die gesamte Biofilmtiefe hinweg höhere Anteile an EPS im Vergleich zu Bakterien auf, und die meisten Bakterienzellen sind mit EPS assoziiert, insbesondere aus den mittleren Schichten und darüber. Duo Stat mit 3D-Darstellung ermöglicht ein vertieftes Verständnis der strukturellen Organisation und der Wechselwirkungen zwischen Bakterien und EPS in Biofilmen.

Um sicherzustellen, dass hochwertige RNA aus Biofilmen gewonnen wird, empfehlen wir, die RNA-Extraktion gemäß dem biofilmspezifischen Protokoll durchzuführen, das von Curian KU im Jahr 2007 in einem Artikel beschrieben wurde. In der Zeitschrift werden standardisierte Protokolle der analytischen Biochemie für die cDNA-Mikroarray-Präparation und quantitative Echtzeit-PCR-Assays verwendet. Um die Analyse der großen Datensätze, die durch Mikroarray-Experimente generiert werden, zu erleichtern, haben wir eine Software zur Datenanalyse und -organisation entwickelt, den Mikroarray-Datenvisualisierer oder MDV, der online unter www.oralgen.anl.gov verfügbar ist.

Bevor die Daten an MDV übermittelt werden, statistische Analysen wie einen gepaarten T-Test mit einem Modell für zufällige Varianz unter Verwendung der online verfügbaren BRB-Array-Tool-Software durchführen, wobei ein Grenzwert für den P-Wert von 0,001 für den Klassenvergleich verwendet wird. In diesem Beispiel wurden Analysen von S. muttons Biofilmen durchgeführt, die bei drei unterschiedlichen Zuckerkonzentrationen und an vier Zeitpunkten gezüchtet wurden. Es wurden gepaarte Vergleiche durchgeführt, die zu drei BRB-Dateien führten: Bedingung A: 0,5 % Saccharose plus 1 % Stärke im Vergleich zu 1 % Saccharose; Bedingung B: 0,5 % Saccharose plus 1 % Stärke im Vergleich zu 0,5 % Saccharose; und Bedingung C: 0,5 % Saccharose im Vergleich zu 1 % Saccharose.

Dieses Panel zeigt die Anzahl der Gene an, die mittels Standard-Klassenvergleich mit dem BRB-Array-Tool als differentiell exprimiert in jeder Bedingung und zu jedem Zeitpunkt erfasst wurden, wodurch eine große Anzahl von Genen entsteht, die als BRB-Rohdaten bezeichnet werden. Zur Demonstration von MDV konzentrieren wir uns auf den Zeitpunkt 30 Stunden mithilfe von Excel. Konvertieren Sie die BRB-Rohdaten in tabulatorgetrennte MDV-Textdateien.

Entfernen Sie unbedingt alle Buchstaben, die mit der Gen-Locus-Tab-Nummer einhergehen, beispielsweise im Namen SMU dot 1432 C. Löschen Sie den Buchstaben C, öffnen Sie MDV. Öffnen Sie das Dateimenü und wählen Sie „Annotationquelle auswählen“. Wählen Sie die Option „Flat-File“, wenn ein Dialogfeld erscheint.

Verwenden Sie die Durchsuchen-Schaltflächen, um die Dateien auszuwählen, die Anmerkungen zur funktionellen Klassifizierung nach Gen-Ontologie-Nummern, Wegen und Genbezeichnungen enthalten. Gehen Sie zu Datei und importieren Sie jeweils alle in das MDV-Format konvertierten Dateien. Jede Datei repräsentiert eine experimentelle Bedingung.

Vergleichen Sie die Gene, die in den jeweiligen experimentellen Bedingungen A, B und C exprimiert werden. In diesem Beispiel verwenden wir die Venn-Diagramm-Funktion. Für diese Demonstration konzentrieren wir uns auf differenziell exprimierte Gene, die spezifisch mit den kombinierten Einflüssen von Saccharose und Stärke assoziiert sind. Die Venn-Diagramm-basierte Funktion dient dazu, die Anzahl der einzigartigen und gemeinsam exprimierten Gene unter diesen unterschiedlichen Bedingungen zu visualisieren, und hilft uns dabei, diejenigen Gene zu identifizieren, die für eine weitere Analyse ausgewählt werden sollen.

Hier wählen wir nur die differentiell exprimierten Gene aus, die eindeutig in Bedingung A und/oder B sind, jedoch nicht diejenigen, die in C nachgewiesen wurden, wie hier in Grau dargestellt. MDV verringerte die Gesamtanzahl der zu analysierenden Gene erheblich und filterte gleichzeitig die für den experimentellen Fall nicht relevanten Gene heraus. Wählen Sie im Dateimenü die Exportoption, um die Daten zu speichern.

Da es sich um tabulatorgetrennte Dateien handelt, können diese anschließend in Excel geöffnet werden, wo die Datenausgabe organisiert und in die gewünschten grafischen Darstellungen umgewandelt werden kann. Die Datenaufbereitung in Excel ermöglicht die grafische Darstellung der MDV-Ausgabe. Diese Grafik zeigt einen Überblick über die differentielle Expression eindeutiger funktioneller Gen-Teilgruppen, die durch die Kombination von Stärke und Saccharose in verschiedenen Stadien der Biofilmbildung beeinflusst werden.

Die Einflüsse auf das Transkriptom der S-Mutanten sind nach 30 Stunden Biofilmbildung stärker ausgeprägt als zu anderen Zeitpunkten. Die Ergebnisse halfen uns, spezifische funktionelle Genuntergruppen genau zu identifizieren, die für unsere Arbeitshypothese relevant sind, unter Berücksichtigung der zeitlichen Effekte, die die Genauswahl und anschließende Validierung erleichterten. Mithilfe dieses Vorgehens können auch biochemische und proteomische Methoden angewendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise welche spezifischen physiologischen und metabolischen Reaktionen die Organismen innerhalb von Biofilmen zeigen.

Eine solch umfassende und integrierte Analyse würde sicherlich dazu beitragen, besser zu verstehen, wie Biofilme die Pathogenität in der inneren Höhle, einer hochdynamischen und komplexen Umgebung, modulieren. Weitere Einzelheiten finden Sie in der PDF-Datei, die diesem Video-Artikel beigefügt ist.