Ein analytisches Werkzeug-Box für umfassende biochemische, strukturelle und Transkriptom Evaluation of Oral Biofilme von Mutans Streptokokken Mediated

Biofilme, die sich auf Zahnoberflächen bilden, sind hochkomplex und strukturiert. Mikrobielle Gemeinschaften, die in einer extrazellulären Matrix verstrickt sind und ständigen Umwelteinflüssen ausgesetzt sind. Das übergeordnete Ziel ist es, zwei spezifische Komponenten eines analytischen Werkzeugkastens zu zeigen, der strukturelle und molekulare Studien unter Berücksichtigung der komplexen Natur oraler Biofilme erleichtern soll, indem eine neuartige Fluoreszenzbildgebungstechnik mit einer maßgeschneiderten Software zur Datenverarbeitung und -analyse kombiniert wird.

Dies wird durch die Auswahl spezifischer Assays für die Biofilm-, Transkriptom- und Strukturanalyse erreicht, einschließlich eines neuen konfokalen Bildgebungsansatzes zur gleichzeitigen Visualisierung von EPS und Bakterien. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Rohdaten aus den Bioassays zu sammeln. Der dritte Schritt besteht darin, die Rohdaten mit einer speziellen Software zu verarbeiten, einschließlich des neu entwickelten Duo Stat für die Colokalisierungsanalyse.

Der letzte Schritt besteht in der Analyse der Prozessdaten, einschließlich der Verwendung von Microarray-Data-Mining und Organisationssoftware Microarray, Data Visualizer oder MDV. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie orale Krankheitserreger ihr Transkriptom und die Architektur der Biofilme als Reaktion auf komplexe Ernährungs- und Wirtsmikrobieninteraktionen verändern, indem wir unsere einzigartig integrierte Analyse-Toolbox verwenden, die eine umfassendere Biofilmanalyse und Dateninterpretation ermöglicht. Hallo, mein Name ist Michelle Kuh, außerordentliche Professorin am Zentrum für Foralbiologie hier am Universal of Rochester Medical Center.

Heute stellen wir einen analytischen Werkzeugkasten für die Biofilmanalyse vor. Diese Toolbox kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Biofilmforschung zu beantworten, wie z.B. wie die Biofilmzellen strukturiert und mit extrazellulärer Matrix angeordnet sind und wie sie auf komplexe Umweltherausforderungen auf transkriptomischer Ebene reagieren. Mein Name ist Jean, sie, ich bin Postdoc-Stipendiatin in Dr.Ks Labor.

Heute werde ich den Imaging-Teil unseres Werkzeugkastens demonstrieren. Hallo, ich bin Aise Klein. Ich bin wissenschaftlicher Assistenzprofessor im Labor von Dr.K.

Heute stelle ich Ihnen die MDV-Software für die Mikrostrahlen-Datenanalyse vor. Bei diesem Verfahren werden speichelbeschichtete Hydroxy-Appetit-Scheiben als Zahnoberflächen-Surrogate verwendet, auf denen Biofilme gezüchtet werden. Zuerst werden 2,8 Milliliter Kulturmedium, das mit S-Mutanten inokuliert ist, in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, die die Platte vor Licht schützt, mit Dextrin-konjugiertem LOR 6 47-Farbstoff in jede Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar gegeben und mehrmals auf und ab pipettiert, um den Farbstoff in das Kulturmedium zu mischen.

Waschen Sie anschließend die sterilen, mit Speichel überzogenen Hydroxylapatitscheiben mit einer sterilen Pinzette zweimal in sterilem AB-Puffer, um überschüssigen Speichel oder ungebundene Speichelbestandteile zu entfernen. Legen Sie dann die Scheiben senkrecht in das mit Farbstoff versetzte Nährmedium und stellen Sie sicher, dass jede Scheibe vollständig untergetaucht ist. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator für 20 Stunden, damit sich die Biofilme bilden und die konjugierte Textur in die von den Bakterienzellen produzierten Exo-Polysaccharide eingebaut werden kann.

Um die Bakterienzellen zuerst zu markieren, bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 2,8 Millilitern sterilem Milli Q-Wasser pro Well vor. Geben Sie 1,5 Mikroliter Cytoneun-Farbstoff in jede Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar und schützen Sie die Platte vor Licht. Sobald sich der Biofilm gebildet hat, nehmen Sie die Platte mit den Scheiben aus dem Inkubator-Dip.

Waschen Sie jede Scheibe in einer Lösung von 0,89 % Natriumchlorid. Übertragen Sie sie dann auf die neue Platte, die den Farbstoff Cyto Neun enthält. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Sobald die Zellen getaucht sind, waschen Sie die Biofilme und das Natriumchlorid wie zuvor. Geben Sie dann mit einer Pinzette die Biofilme aus dem Draht in eine Petrischale mit Natriumchlorid ab. Wickeln Sie die Petrischale mit Alufolie ein.

Die Biofilme sind nun bereit für die Visualisierung durch konfokale Mikroskopie mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop. Scannen Sie jeden Biofilm an fünf bis 10 zufällig ausgewählten Positionen und generieren Sie an jeder Position Z-Serien. Um 3D-Rekonstruktionen zu ermöglichen, öffnen Sie die konfokalen Bilder und bearbeiten Sie sie mit einer Spiegelsoftware.

Diese dreidimensionale Wiedergabe von konfokalen Bildern, die mit dem Programm Amira erstellt wurden, zeigt einen S-Mutanten-Biofilm, der mit dem demonstrierten Verfahren auf der apathischen Oberfläche gebildet wurde. Bakterienzellen und Mikrokolonien sind grün sichtbar und in die Biofilmmatrix eingebettet, die Exopolysaccharide enthält. In Rot kann eine Nahaufnahme eines ausgewählten Bereichs erzeugt werden, die die spezifische EPS-Strukturbeziehung zwischen Bakterien und Bakterien auf der Mikroskala veranschaulicht.

Verwenden Sie das Duos-Stat-Programm, um das Ausmaß der Kolokalisation einzelner Biofilmkomponenten wie der Bakterien und der Exo-Polysaccharide zu quantifizieren. Richten Sie zunächst den Pfad der neu entwickelten Duo-Statistik in MATLAB Version 5.1 ein und öffnen Sie die Bildordner mit den Bildern der Z-Serie der beiden Biofilmkomponenten. Wählen Sie als Nächstes zwei Kanäle aus, die korreliert und analysiert werden sollen.

Die beiden Bildstapel müssen in allen Dimensionen identische Pixelgrößen und die gleiche Anzahl von Bildern in jedem Stapel aufweisen. Legen Sie die Schwellenwerte für jeden Kanal fest, befolgen Sie die Anweisungen in der Softwareoberfläche und geben Sie die Daten zur Analyse in die Datenverarbeitungsdatei ein. Diese Abbildung zeigt, wie duo stack die räumliche Beziehung zwischen Bakterien und DBS quantitativ interpretiert.

Innerhalb des Biofilms berechnet der Duo-Stack die vertikale Verteilung von Bakterien und DPS von der Scheibenoberfläche bis zur flüssigen Phase, wie hier in der grünen Linie für Bakterien und der roten Linie für EPS zu sehen. Es berechnet auch die Kolokalisation von Bakterien und DPS über die Biofilmdicke. Wie in der gelben Linie gezeigt, zeigen die Daten einen höheren Anteil von EPS als von Bakterien in der gesamten Biofilmtiefe, und die meisten Bakterienzellen sind mit EPS assoziiert, insbesondere aus den mittleren Schichten und aufwärts. Duo-Stat mit 3D-Rendering bietet ein verbessertes Verständnis der strukturellen Organisation und Interaktion von Bakterien und DPS in Biofilmen.

Um sicherzustellen, dass qualitativ hochwertige RNA aus Biofilmen gewonnen wird, empfehlen wir, die RNA-Extraktion nach dem biofilmspezifischen Protokoll durchzuführen, das in dem 2007 veröffentlichten Artikel von Curian KU beschrieben ist. In der Fachzeitschrift werden analytische biochemische Standardprotokolle für die Vorbereitung von CD-NA-Microarrays und quantitative Realtime-PCR-Assays verwendet. Um die Analyse der großen Datensätze, die durch Microarray-Experimente erzeugt werden, zu erleichtern, haben wir eine Data-Mining- und Organisationssoftware entwickelt, den Microarray Data Visualizer oder MDV, der online unter www.oralgen.anl.gov verfügbar ist.

Bevor Sie die Daten an MDV senden, führen Sie statistische Analysen wie einen gepaarten T-Test mit einem Zufallsvarianzmodell mit der online verfügbaren BRB-Array-Tool-Software mit einem Cutoff-P-Wert von 0,001 für den Klassenvergleich durch. In dieser Beispielanalyse von Hammelfleisch wurden Biofilme durchgeführt, die in drei verschiedenen Zuckerkonzentrationen und zu vier Zeitpunkten gezüchtet wurden. Es wurden paarweise Vergleiche durchgeführt, die von drei BRB-Dateien ausgingen: Bedingung a 0,5 % Saccharose plus 1 % Stärke versus 1 % Saccharose, Bedingung B 0,5 % Saccharose plus 1 % Stärke versus 0,5 % Saccharose und Bedingung C 0,5 % Saccharose versus 1 % Saccharose.

Dieses Panel stellt die Anzahl der Gene dar, die in jeder Bedingung und jedem Zeitpunkt als differentiell exprimiert nachgewiesen wurden, die durch einen Standardklassenvergleich mit dem BRB-Array-Tool ausgewertet wurden, was zu einer großen Anzahl von Genen mit dem Namen BRB-Rohdaten führt. Für die Demonstration von MDV konzentrieren wir uns auf den Zeitpunkt 30 Stunden mit Excel. Konvertieren Sie die BRB-Rohdaten in MDV-Tab-begrenzte Textdateien.

Achten Sie darauf, alle Buchstaben zu entfernen, die mit der Registerkartennummer des Genlokus einhergehen, z. B. im Namen SMU dot 1432 C.Löschen Sie den Buchstaben C, öffnen Sie MDV. Öffnen Sie das Dateimenü und wählen Sie Anmerkungsquelle auswählen. Wählen Sie die Option Flatfile aus, wenn ein Dialogfeld angezeigt wird.

Verwenden Sie die Schaltflächen zum Durchsuchen, um die Dateien auszuwählen, die Anmerkungen für die Genontologie, die Nummer, den Signalweg, die funktionelle Klassifikation, die Daten und den Gennamen enthalten. Gehen Sie zu Datei und importieren Sie jede der Dateien, die in das MDV-Format konvertiert wurden. Jede Datei stellt eine experimentelle Bedingung dar.

Vergleichen Sie die Gene, die in jeder Versuchsbedingung A mit B und C.In diesem Beispiel exprimiert werden, mithilfe der Venn-Diagrammfunktion. Für diese Demonstration konzentrieren wir uns auf differentiell exprimierte Gene, die in einzigartiger Weise mit Einflüssen von Saccharose und Stärke in Kombination verbunden sind. Die auf dem Venn-Diagramm basierende Funktion wird verwendet, um die Anzahl der einzigartigen und gemeinsam genutzten Gene zu visualisieren, die unter diesen verschiedenen Bedingungen exprimiert werden, und hilft uns bei der Identifizierung derjenigen, die für die weitere Analyse ausgewählt werden sollen.

Hier wählen wir nur die unterschiedlich exprimierten Gene aus, die in Bedingung A und/oder B einzigartig sind, aber nicht diejenigen, die in C nachgewiesen wurden, wie hier grau dargestellt. MDV reduzierte die Gesamtzahl der zu analysierenden Gene stark und filterte gleichzeitig die für den Versuchsfall nicht relevanten Gene heraus. Wählen Sie im Dateimenü die Option "Exportieren" aus, um die Daten zu speichern.

Als tab-begrenzte Dateien können die Dateien dann in Excel geöffnet werden, wo die Datenausgabe organisiert und in die gewünschten grafischen Darstellungen umgewandelt werden kann. Die Datenorganisation in Excel ermöglicht die grafische Darstellung der MDV-Ausgabe. Diese Grafik zeigt einen Überblick über die differentielle Expression einzigartiger funktioneller Untergruppen von Genen, die von der Kombination von Stärke und Saccharose in verschiedenen Stadien der Biofilmentwicklung beeinflusst werden.

Die Einflüsse auf das Transkriptom der S-Mutanten sind nach 30 Stunden Biofilmentwicklung ausgeprägter als zu anderen Zeitpunkten. Die Ergebnisse halfen uns, genau spezifische funktionelle Untergruppen von Genen zu identifizieren, die für unsere Arbeitshypothese relevant sind, unter Berücksichtigung der zeitlichen Effekte, die die Genauswahl und den weiteren Validierungsprozess erleichterten. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch biochemische und proteomische Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die spezifischen physiologischen und metabolischen Reaktionen der Organismen innerhalb von Biofilmen.

Eine solch umfassende und integrierte Analyse würde sicherlich dazu beitragen, besser zu verstehen, wie die Biofilme die Pathogenität in Innenräumen, einer hochdynamischen und komplexen Umgebung, modulieren. Weitere Informationen finden Sie in der PDF-Datei, die diesem Videoartikel beigefügt ist.