Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Atemwegs-Epithelzellen zu isolieren, um die toxischen Wirkungen einer Exposition gegenüber Zigarettenrauch zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Tracheen von Mäusen präpariert und anschließend in einer Pronase-Lösung verdaut werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Epithelzellen zu gewinnen und die Flüssigkultur zu vermehren.

Der dritte Schritt besteht darin, die Kulturen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu differenzieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Exposition der epithelialen Zellen gegenüber apikalem Zigarettenrauch an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie eine vollständig differenzierte monolayerartige Anordnung epithelialer Zellen zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung zu beantworten, beispielsweise die Auswirkungen einer Exposition gegenüber Zigarettenrauch auf die Morphologie der CLIA sowie auf zelluläre Verletzungsmarker, die durch Zigarettenrauch induziert werden. Beginnen Sie einen Tag vor der Sektur mit den Vorbereitungen für dieses Verfahren, indem Sie Hams herstellen. F 12-Medien mit Antibiotika Hams F 12-Medien mit Antibiotika und 20% F-B-S-M-T-E-C, Basalmedium mit Antibiotika.

MTEC-Medium mit 5 % FBS, DNA-Einlösung und Retinsäure-Stammlösungen sowie MTEC-Proliferationsmedium gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll herstellen. Alle chirurgischen Instrumente, die am Tag der Dissektion für die Dissektion verwendet werden sollen, sterilisieren. Sicherstellen, dass der Dissektionsbereich sauber ist und alle Dissektionsinstrumente griffbereit liegen.

Begrenzen Sie die Gewebekulturhaube steril. Bereiten Sie dann in der Gewebekulturhaube eine Lösung von 0,15 % Pronase vor.

Geben Sie 15 Milligramm Pronase in 10 Milliliter Hams F12-Medien mit Antibiotika in eine 50-Milliliter-Kegelrohrflasche. Bewahren Sie die Lösung bis zur Verwendung auf Eis.

Mäuse-Tracheen werden unter Verwendung standardmäßiger chirurgischer Verfahren aus Mäusen präpariert, das Röhrchen mit den Tracheen desinfiziert und in die Gewebekulturhaube gebracht. Die Tracheengewebe in eine 100 Millimeter große Petrischale mit Ham's F12-Medium, das Antibiotika enthält, überführen. Mit sterilen chirurgischen Pinzetten das Bindegewebe von den Tracheen entfernen.

Überführen Sie dann die gereinigten Luftröhren in die zweite 100 Millimeter Petrischale, die Hams F 12 Medium mit Antibiotika enthält. Schneiden Sie die Luftröhren mit einer Präzisionsschere entlang der vertikalen Achse auf, um das Lumen freizulegen.

Überführen Sie die Tracheen in das 50-Milliliter-Konusrohr, das 10 Milliliter Pronase-Lösung enthält, und stellen Sie es über Nacht zur Inkubation bei vier Grad Celsius in den Kühlschrank. Bereiten Sie abschließend Transwell-Platten vor, die mit Kollagen Typ I beschichtet wurden. Am folgenden Tag geben Sie 50 Milligramm Kollagen pro Milliliter 0,02 N Essigsäure hinzu und pipettieren Sie je einen Milliliter dieser Lösung in jedes Brunnen einer 12er-Platte.

Gut trans guter Platte. Wickeln Sie die Platte in Parafilm ein und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur im Zellkulturwerk stehen. Am nächsten Tag.

Invertieren Sie das Röhrchen mit den Maus-Tracheen vorsichtig 10 bis 12 Mal. Anschließend lassen Sie den Inhalt des Röhrchens weitere 30 bis 60 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Arbeiten Sie im Gewebekulturwerk und pipettieren Sie 10 Milliliter Hams F12-Medium mit Antibiotika in 20 % FBS in das kegelförmige Röhrchen mit dem verdauten Trachealgewebe und invertieren Sie es 12 Mal.

Übertragen Sie anschließend 10 Milliliter Hams F12-Medium, das Antibiotika in 20 % FBS enthält, mit einer Pipette in jeweils drei 15-Milliliter-Kegelrohre. Mit einer sterilen Pasteurpipette das Trachealgewebe aus der Pronaselösung in das erste der mit supplementiertem Hams F12-Medium gefüllten Röhrchen überführen.

Stellen Sie die Pronase-Lösung auf Eis, verschließen Sie das Röhrchen mit dem Trachealgewebe und mischen Sie vorsichtig durch 12-maliges Invertieren. Übertragen Sie anschließend mit der Pasteurpipette das Trachealgewebe in das zweite konische 15-Milliliter-Röhrchen und invertieren Sie dieses Röhrchen ebenfalls 12-mal. Wiederholen Sie den Übertragungs- und Invertiervorgang unter Verwendung des letzten konischen 15-Milliliter-Röhrchens.

Entfernen Sie abschließend mit der Pasteurpipette das Trachealgewebe und entsorgen Sie es. Danach holen Sie die Pronase-Lösung aus dem Eis und mischen die drei 15-Milliliter-Volumina des supplementierten Ham's F12-Mediums mit der Pronase-Lösung. Zentrifugieren Sie die Probe in der gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 1.400 Umdrehungen pro Minute. Nach der Zentrifugation wird das Überstand verwerfen. Pipettieren Sie anschließend etwa 100 bis 200 Mikroliter der DNAse-I-Lösung pro Trachea auf das Pellet und resuspendieren Sie es.

Suspendieren Sie durch vorsichtiges Antippen. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 1.400 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand.

Danach acht Milliliter MTEC-Medium mit 10 % FBS auf das Pellet pipettieren und die Platte resuspendieren. Die Zellsuspension auf einer Paria-Platte bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid fünf bis sechs Stunden lang inkubieren. Dies ist ein Negativselektionsschritt zur Entfernung von Fibroblasten.

Nach der Inkubation sammeln Sie die Zellsuspension von der Platte und pipettieren Sie in ein 50-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie die Platte anschließend zweimal mit je vier Millilitern MTEC-Medium, das 10 % FBS enthält. Überführen Sie beide Waschungen in das 50-Milliliter-Konischglas mit der Zellsuspension.

Pipettieren Sie ein Milliliter der Zellsuspension in ein Eppendorf-Röhrchen. Heben Sie diesen Aliquot für die Zytospin-Analyse und die Zellzählungszentrifugation auf. Das 50-Milliliter-Konischglas mit den verbleibenden 15 Millilitern Zellsuspension wird bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 1.400 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.

Während der Zentrifugation die Kollagenlösung aus der zuvor vorbereiteten Transwell-Platte entfernen und verwerfen. Die Platte fünf Minuten lang unter dem Abzug trocknen lassen und danach nach dem letzten Waschschritt zweimal mit PBS waschen. Den gesamten PBS abziehen und 1,5 Milliliter Proliferationsmedium in das basale Kompartiment des Transwells nach der Zentrifugation pipettieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen an Proliferationsmedium, um das Ansäen von 7,5 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ Zellen in 500 µL Suspension pro Vertiefung zu ermöglichen. Pipettieren Sie 500 µL Zellsuspension auf die apikale Oberfläche des Transwell-Polycarbonatmembran-Inserts. Inkubieren Sie die untergetauchten MTEC-Kulturen 7 bis 10 Tage bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid, wobei alle zwei Tage das Medium gewechselt wird.

Messen Sie den trans-epithelialen Zellwiderstand unter Verwendung eines Intervallographen. Wenn der epitheliale Widerstand 1000 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht hat und die Kulturen konfluent erscheinen, wechseln Sie zu einer LI-Kultur, indem Sie das apikale Medium entfernen.

Ersetzen Sie das Basalmedium außerdem durch MTEC-Grundmedium, das 2 % neues Serum und Retinsäure enthält. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 10 bis 14 Tage, um eine Differenzierung unter Medienwechsel alle zwei Tage zu ermöglichen. Richten Sie zunächst die Rauchmaschine gemäß den Herstelleranweisungen ein.

Notieren Sie das Gewicht eines unbenutzten Pole-Flex-Filters. Anschließend setzen Sie den Filter in den eingespritzten Edelstahlhalter am Probenahmeschlauch ein, der vom Probenahmeanschluss an der Rauchkammer zur Konstantstrom-Pumpe führt. Verbinden Sie die Probenahmeeinheit unter Verwendung eines Ablaufschlauchs mit dem Gaszähler, und zwar im Rahmen eines CS-Zell-Expositionssystems.

Exponieren Sie die apikale Seite der Transwell-Kulturen gegenüber Hauptstromrauch aus drei R4F-Forschungsreferenzfilterzigaretten. Exponieren Sie die Zellen gegenüber dem Rauch von einer bis zwei Zigaretten. Exponieren Sie Kontrollkulturen für eine äquivalente Expositionszeit gegenüber Raumluft nach der Gasprobennahme, bei der Gewichtszunahme auftritt.

Die Pool-Flex-Filter werden normalisiert auf die gesamte in Milligramm abgeschiedene Materialmenge. Für das gesamte probenahme Luftvolumen ergibt der Rauch einer bis zwei Zigaretten typischerweise 100 bis 200 Milligramm pro Kubikmeter TPM. Nach der Zigarettenexposition die Zellen und das basale Medium für weitere Analysen gewinnen.

Dies ist ein Beispiel für eine gesunde Monoschicht von murinen Atemepithelzellen, die auf Kerne, Epithelzellen- und C-Marker gefärbt wurden. Eine erfolgreiche Isolierung, Proliferation und Differenzierung von Epithelzellen erfordert eine intakte Monoschicht mit einer kieselsteinartigen Morphologie. Die Kulturen sind im Wesentlichen frei von Fibroblasten.

Diese Elektronenmikroskopieaufnahmen sind repräsentativ für gesunde MTEC-Kulturen und zeigen die Ultrastruktur der verschiedenen Zelltypen sowie die ZILiEN-Morphologie. Dieses Live-Cell-Imaging-Video zeigt die gesunde ZILiEN-Morphologie von MTEC-Kulturen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man murine tracheale Epithelzellen isoliert, sie an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche differenziert und ihnen Hauptstrom-Zigarettenrauch aussetzt.