Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Atemwegs-Epithelzellen zu isolieren, um die toxischen Wirkungen einer Exposition gegenüber Zigarettenrauch zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Tracheen von Mäusen präpariert und anschließend in einer Pronase-Lösung verdaut werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Epithelzellen zu gewinnen und die Kultur in flüssiger Form weiterzuzüchten.

Der dritte Schritt besteht darin, die Kulturen an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu differenzieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Exposition der epithelialen Zellen gegenüber apikalem Zigarettenrauch an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie eine vollständig differenzierte monolayerartige Anordnung epithelialer Zellen zeigen.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung beantworten, beispielsweise die Auswirkungen einer Exposition gegenüber Zigarettenrauch auf die Morphologie der CLIA sowie biochemische Marker für zelluläre Schädigungen, die durch Zigarettenrauch induziert werden. Beginnen Sie die Vorbereitungen für dieses Verfahren einen Tag vor der Sektion, indem Sie Hams herstellen. F 12 Medium mit Antibiotika, Hams F 12 Medium mit Antibiotika und 20 % F-B-S-M-T-E-C, Basalmedium mit Antibiotika.

MTEC-Medium mit 5 % FBS, DNA-Einlösung und Retinsäure-Stammlösungen sowie MTEC-Proliferationsmedium gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll herstellen. Alle chirurgischen Instrumente, die am Tag der Dissektion für die Dissektion verwendet werden sollen, sterilisieren. Sicherstellen, dass der Dissektionsbereich sauber ist und alle Dissektionsinstrumente griffbereit liegen.

Desinfizieren Sie die Zellkulturwerkbank. Anschließend arbeiten Sie in der Zellkulturwerkbank. Bereiten Sie eine Lösung mit 0,15 % Pronase vor.

Geben Sie 15 Milligramm Pronase zu 10 Millilitern Hams F12-Medien mit Antibiotika in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis.

Mäuse-Tracheen werden unter Verwendung standardmäßiger chirurgischer Verfahren von Mäusen präpariert, das Röhrchen mit den Tracheen desinfiziert und in die Gewebekulturhaube gebracht. Die Tracheengewebe in eine 100 Millimeter große Petrischale mit Ham's F12-Medium, das Antibiotika enthält, überführen. Mit sterilen chirurgischen Pinzetten das Bindegewebe von den Tracheen entfernen.

Überführen Sie dann die gereinigten Luftröhren in die zweite 100-Millimeter-Petri-Schale, die Hams F12-Medien mit Antibiotika enthält. Schneiden Sie die Luftröhren mit einer Präzisionsschere entlang der vertikalen Achse auf, um das Lumen freizulegen.

Überführen Sie die Tracheen in den 50-Milliliter-Konischkolben, der 10 Milliliter Pronase-Lösung enthält, und stellen Sie ihn über Nacht zur Inkubation bei vier Grad Celsius in den Kühlschrank. Bereiten Sie abschließend Transwell-Platten vor, die mit Kollagen Typ I beschichtet sind, für den Gebrauch vor. Am folgenden Tag geben Sie 50 Milligramm Kollagen pro Milliliter 0,02 N Essigsäure hinzu und pipettieren Sie je einen Milliliter dieser Lösung in jedes Loch einer 12er-Platte.

Gut trans Guttplatte. Die Platte in Parafilm einwickeln und über Nacht bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube stehen lassen. Am nächsten Tag.

Den Behälter mit den Maus-Tracheen vorsichtig 10 bis 12 Mal umdrehen. Anschließend die Inhalte des Behälters weitere 30 bis 60 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren lassen. Unter der Gewebekulturhaube 10 Milliliter Hams F12-Medium mit Antibiotika in 20 % FBS in den kegelförmigen Behälter mit dem verdauten Trachealgewebe pipettieren und 12 Mal umdrehen.

Pipettieren Sie anschließend 10 Milliliter Hams F12-Medium mit Antibiotika in 20 % FBS in jeweils drei 15-Milliliter-Kegelröhrchen. Überführen Sie das Trachealgewebe mit einer sterilen Pasteurpipette aus der Pronase-Lösung in das erste der Röhrchen, das das supplementierte Hams F12-Medium enthält.

Stellen Sie die Pronase-Lösung auf Eis, verschließen Sie das Röhrchen mit dem Trachealgewebe und mischen Sie vorsichtig durch 12-maliges Invertieren. Übertragen Sie anschließend mit der Pasteurpipette das Trachealgewebe in das zweite konische 15-Milliliter-Röhrchen und invertieren Sie dieses Röhrchen ebenfalls 12-mal. Wiederholen Sie den Übertragungs- und Invertiervorgang unter Verwendung des letzten konischen 15-Milliliter-Röhrchens.

Entfernen Sie abschließend mit der Pasteurpipette das Trachealgewebe und entsorgen Sie es. Danach entnehmen Sie die Pronase-Lösung aus dem Eis und mischen die drei 15-Milliliter-Volumina des supplementierten Ham's F12-Mediums mit der Pronase-Lösung. Zentrifugieren Sie die Probe in der gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 1.400 Umdrehungen pro Minute. Nach der Zentrifugation wird das Überstand verwerfen. Geben Sie anschließend etwa 100 bis 200 Mikroliter der DNAse-I-Lösung pro Trachea auf das Pellet und resuspendieren Sie es.

Suspendieren Sie durch vorsichtiges Antippen. Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie das Gefäß bei 1.400 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand.

Danach acht Milliliter MTEC-Medium mit 10 % FBS auf das Pellet pipettieren und die Platte resuspendieren. Die Zellsuspension auf einer Paria-Platte bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid fünf bis sechs Stunden lang inkubieren. Dies ist ein Negativselektionsschritt zur Entfernung von Fibroblasten.

Nach der Inkubation sammeln Sie die Zellsuspension von der Platte und pipettieren Sie in ein 50-Milliliter-Konischglas. Spülen Sie die Platte anschließend zweimal mit je vier Millilitern MTEC-Medium, das 10 % FBS enthält. Überführen Sie beide Waschungen in das 50-Milliliter-Konischglas mit der Zellsuspension.

Pipettieren Sie ein Milliliter der Zellsuspension in ein Eppendorf-Röhrchen. Heben Sie diesen Aliquot für die Zytospin-Analyse und die Zellzählungszentrifugation auf. Das 50-Milliliter-Kegelröhrchen, das die verbleibenden 15 Milliliter Zellsuspension enthält, wird bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang mit 1.400 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.

Während der Zentrifugation die Kollagenlösung aus der zuvor vorbereiteten Transwell-Platte entfernen und verwerfen. Die Platte fünf Minuten lang unter dem Abzug trocknen lassen und danach nach dem letzten Waschschritt zweimal mit PBS waschen. Den gesamten PBS abpipettieren und nach der Zentrifugation 1,5 Milliliter Proliferationsmedium in das basale Kompartiment des Transwells pipettieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen an Proliferationsmedium, um 7,5 × 10⁴ bis 1 × 10⁵ Zellen pro Brunnen in 500 µL Suspension auszuplatieren. Pipettieren Sie 500 µL der Zellsuspension auf die apikale Oberfläche des Transwell-Polycarbonatmembran-Inserts. Inkubieren Sie die untergetauchten MTEC-Kulturen bei 37 °C in einem feuchten Inkubator mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid für sieben bis zehn Tage, wobei alle zwei Tage das Medium gewechselt wird.

Messen Sie den trans-epithelialen Zellwiderstand unter Verwendung eines Intervallographen. Wenn der epitheliale Widerstand 1000 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht hat und die Kulturen konfluent erscheinen, wechseln Sie zu einer LI-Kultur, indem Sie das apikale Medium entfernen.

Ersetzen Sie das Basalmedium außerdem durch MTEC-Grundmedium, das 2 % neues Serum und Retinsäure enthält. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 10 bis 14 Tage, um eine Differenzierung unter Medienwechsel alle zwei Tage zu ermöglichen. Stellen Sie zunächst die Rauchmaschine gemäß den Herstelleranweisungen ein.

Notieren Sie das Gewicht eines unbenutzten Polycarbonat-Feinfilters. Anschließend setzen Sie den Filter in den inline Edelstahlhalter am Probenahmeschlauch ein, der vom Probenahmeanschluss an der Rauchkammer zur Konstantstrom-Pumpe führt. Verbinden Sie die Probenahmeeinheit über einen Ablaufschlauch mit dem Gaszähler, wobei ein CS-Zell-Expositionssystem verwendet wird.

Exponieren Sie die apikale Seite der Transwell-Kulturen gegenüber Hauptstromrauch aus drei R4F-Forschungsreferenzfilterzigaretten. Exponieren Sie die Zellen gegenüber dem Rauch von einer bis zwei Zigaretten. Exponieren Sie Kontrollkulturen für eine äquivalente Expositionszeit gegenüber Raumluft nach der Gasprobennahme, bei der Gewichtszunahme auftritt.

Die Pool-Flex-Filter werden normalisiert auf die gesamte in Milligramm abgeschiedene Materialmenge. Für das gesamte probenahme Luftvolumen ergibt der Rauch einer bis zwei Zigaretten typischerweise 100 bis 200 Milligramm pro Kubikmeter TPM. Nach der Zigarettenexposition die Zellen und das basale Medium für weitere Analysen gewinnen.

Dies ist ein Beispiel für eine gesunde, monolayerartige Schicht von Maus-Atemepithelzellen, die auf nukleäre Epithelzellen und C-Marker gefärbt wurden. Eine erfolgreiche Isolierung, Proliferation und Differenzierung von Epithelzellen erfordert eine intakte monolayerartige Schicht mit einer kieselsteinartigen Morphologie. Die Kulturen sind im Wesentlichen frei von Fibroblasten.

Diese Elektronenmikroskopieaufnahmen sind repräsentativ für gesunde MTEC-Kulturen und zeigen die Ultrastruktur der verschiedenen Zelltypen sowie die ZILiEN-Morphologie. Dieses Live-Cell-Imaging-Video zeigt die gesunde C-Morphologie von MTEC-Kulturen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man murine tracheale Epithelzellen isoliert, sie an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche differenziert und ihnen Hauptstrom-Zigarettenrauch aussetzt.