Sammeln Variable-Konzentration Isotherme Titrationskalorimetrie Datasets in Auftrag, um bindende Mechanismen bestimmen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das korrekte physikalische Modell zu identifizieren, das die Bindung eines Makromoleküls an seinen Liganden beschreibt, und die damit verbundenen thermodynamischen Parameter zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Stammlösung des Makromoleküls durch umfangreiche Dialyse hergestellt wird. Anschließend wird der interessierende Ligand im abschließenden Dialysepuffer aufgelöst und im zweiten Schritt werden die Konzentrationen aller Komponenten bestimmt.

Die Makromolekül- und Ligandenproben werden sorgfältig auf eine Reihe unterschiedlicher Konzentrationen verdünnt. Als nächstes wird eine Reihe von isothermen Titrationskalorimetrie- oder ITC-Experimenten bei verschiedenen Konzentrationen von Ligand und Protein durchgeführt, um im letzten Schritt des Verfahrens eine Reihe von ITC-Isothermen herzustellen. Die globale Analyse der Versuchsreihen wird unter Verwendung verschiedener physikalischer Modelle durchgeführt und das Modell mit der besten Gesamtübereinstimmung als korrekt identifiziert.

Heute zeige ich Ihnen eine Methode, die Ihnen helfen kann, biophysikalische Fragen zu beantworten, z. B. wie Proteinmoleküle ihre Liganden binden, und die genaue Messungen von Bindungsparametern wie Entropie, Entropie und Assoziationskonstanten vor dem Start dieses Protokolls liefern kann. Reinigen Sie das Protein von Interesse: Das Makromolekül, das in dieser Demonstration verwendet wird, ist ein Immun-GLYKOSID N sechs prime, eine subtile Transferase one I oder ein C sechs prime, I.To beginnen, vier Liter Dialysepuffer vorbereiten und auf vier Grad Celsius abkühlen. Als nächstes dialysieren Sie ein kleines Volumen einer Makromoleküllösung.

In diesem Fall werden fünf Milliliter 400 mikromolare AAC C sechs Prime, ein Auge in 1,3 Liter Dialysepuffer bei vier Grad Celsius hergestellt. Dies kann in einem Kühlraum oder einem Kühlschrank erfolgen, alle acht Stunden mit frischem Puffer wechseln und insgesamt dreimal dialysieren. Bewahren Sie die endgültige Dialyselösung auf.

750 Milliliter der endgültigen Dialyselösung durch einen 0,45-Mikron-Zellulosefilter filtrieren und bei vier Grad Celsius lagern. Dieser Puffer, der jetzt als laufender Puffer bezeichnet wird, wird für Spülungen und als Verdünnungsmittel verwendet. Spülen Sie für die Proben einen 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter gründlich mit Laufpuffer.

Wenden Sie die Proteinprobe und den Filter an. Entnehmen Sie die Probe vorsichtig in einem konischen Röhrchen, bevor Sie die Proteinlösung lagern, und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Standardproteinassay. In diesem Fall wird die Proteinkonzentration mit ABSORBENCE bei 280 Nanometern gemessen und die Enzymkonzentration berechnet.

Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten, der vom EXI-Proteomikserver generiert wird, lagern Sie das Protein so, dass die Langzeitstabilität maximiert wird. AAC C sechs Prime, ein Auge muss bei vier Grad Celsius gelagert werden, da es nach dem Einfrieren und Auftauen nicht mehr aktiv bleibt, danach lösten sich der Ligand und der laufende Puffer auf. Für diese Demonstration wurden vier Milligramm Acetyl-Coenzym A in 200 Mikrolitern Laufpuffer gelöst, um eine 25 Millimolare Stammlösung herzustellen.

Dieser Ligand kann bis zur Verwendung bei minus 78 Grad Celsius gelagert werden, um die ITC-Proben vorzubereiten. Berechnen Sie zunächst die Konzentration des Enzyms, um einen C-Wert von 64 zu erhalten, wie in dem schriftlichen Protokoll für AAC sechs Primzahlen I beschrieben. Dies entspricht einer Konzentration von 192 Mikromolaren. Bereiten Sie eine zwei Milliliter schwere Lösung des Makromoleküls in dieser Konzentration vor, verdünnen Sie die Stammlösung mit dem filtrierten Laufpuffer FIA settle Co-Enzym a tauen auf, das Acetal-Coenzym eine Lösung in einem Eiswasserbad. Sobald die Lösung des Acetal-Co-Enzyms aufgetaut ist, berechnen Sie vorsichtig die Konzentration der Ligandenlösung, indem Sie die Makromolekülkonzentration mit der Anzahl der Bindungsstellen multipliziert mit 10 multiplizieren.

Bereiten Sie die Lösung für das Acetyl-Co-Enzym vor, indem Sie 80 Mikroliter des 25 millimolaren ACE-Co-Enzyms, eine Stammlösung, zu 420 Mikrolitern Laufpuffer hinzufügen und mischen. Übertragen Sie die verdünnte Acetyl-Coenzym-ACE-Lösung in ein Pipettenfüllröhrchen und stellen Sie die restlichen 25 Millimolar Stammlösung zur Lagerung auf minus 78 Grad Celsius zurück. Entgasen Sie das a C sechs prim ein Auge und ein feinstoffliches Co-Enzym, A löst unter Vakuum fünf Minuten lang bei 19 Grad Celsius, was ein Grad Celsius unter der gewünschten experimentellen Lauftemperatur liegt.

Um die Injektionsspritze einzurichten, führen Sie die Spritze durch einen Spritzenhalter, bis sich die an der Vorderseite montierte Spritzenklemme auf der gleichen Höhe wie der Halter befindet. Führen Sie die zweite Spritzenklemme über die Injektionsspritze, bis sie fest gegen die Unterseite des Spritzenhalters gedrückt wird. Ziehen Sie die Klemme vorsichtig mit dem mitgelieferten 0,05-Zoll-Kugelschreiber-Sechskantantrieb fest.

Setzen Sie dann den Spritzenhalter in den Pipettenhalter ein. Schieben Sie den Pipetteninjektor vorsichtig in die Injektionsspritze und stellen Sie sicher, dass die Kolbenspitze direkt in das Loch der Spritze eingeführt wird. Schrauben Sie nach dem vollständigen Einsetzen den Sicherungsring des Spritzenhalters in den Pipetteninjektor.

Vor dem Laden der Ein-Augen-Protein-Probenlösung A a C sechs Prime ist die Probenzelle mit dem mit dem Gerät gelieferten Zellwaschsystem mit mindestens 50 Millilitern Laufpuffer zu waschen. Entfernen Sie den Restpuffer aus der Probenzelle, indem Sie mit einer 2,5-Milliliter-Glasspritze mit langer Nadel aspirieren. Entfernen Sie die Lösungen mit einer zweiten, sauberen, trockenen, langen Nadel aus dem Entgasungsvakuum.

2,5 Milliliter Spritze. Ziehen Sie vorsichtig mindestens 1,8 Milliliter der A-C-Sechs-Prime-One-Eye-Proteinprobe in die Spritze. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu vermeiden.

Sobald die Spritze mit der Proteinprobe beladen ist, führen Sie die Nadel in die Probenzelle ein und berühren Sie vorsichtig den Boden der Zelle. Heben Sie die Nadel etwa einen Millimeter an und injizieren Sie die Probe vorsichtig in die Zelle, bis überschüssige Flüssigkeit über der Oberseite der Probenzelle sichtbar ist. Um die Zelle von eingeschlossenen Luftblasen zu spülen, heben Sie die Nadel um etwa einen Zentimeter an, während Sie sicherstellen, dass die Lösung im Überlauf verbleibt, und ziehen Sie schnell etwa 0,25 Milliliter der Lösung ab und injizieren Sie sie.

Schieben Sie nun die Nadel vorsichtig an der Seite des Überlaufs nach oben. In der Probenvertiefung trifft die Nadel auf eine Kante. Entferne die gesamte Flüssigkeit über dieser Kante, da die Kante die gewünschte Höhe für die laufende Lösung anzeigt.

Um die Injektionsspritze zu laden, befestigen Sie die Aufblähungsspritze aus Kunststoff an der Einfüllöffnung und senken Sie die Kolbenspitze bis zur Oberseite der Einfüllöffnung ab. Legen Sie nun das Pipettenfüllröhrchen mit der Ligandenlösung von DGA auf den Boden des Pipettenhalters. Vergewissern Sie sich, dass die Spritzenspitze den Boden des Füllrohrs nicht berührt, und ziehen Sie die Lösung langsam in die Spritze, bis eine kleine Menge in das Röhrchen der Ladespritze gelangt.

Schließen Sie anschließend die Einfüllöffnung, indem Sie die Kolbenspitze absenken. Dies geschieht durch Klicken auf die Schaltfläche zum Schließen des Füllports. Dann um alle Luftblasen zu entfernen, die sich während des Ladens verfangen haben könnten.

Bereinigen und nachfüllen, indem Sie auf die Schaltfläche "Bereinigen nachfüllen" klicken. Spülen und nachfüllen insgesamt dreimal. Sobald der Nachfüllvorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie das Füllrohr aus dem Pipettenhalter und wischen Sie die Spritzenspitze vorsichtig mit Laborseidenpapier ab.

Senken Sie nun die Spritze der Pipetteneinheit in die Probe ab. Seien Sie vorsichtig und gehen Sie langsam vor, da sich die Nadel leicht verbiegen kann. Stellen Sie sicher, dass die Spritze vollständig eingeführt ist, indem Sie auf die Basis des Verriegelungskragens drücken.

Sobald die Spritze gesichert ist, stellen Sie die gewünschte Betriebstemperatur ein und wählen Sie eine Referenzleistung, die etwas größer ist als der erwartete maximale Injektionswärmestrom. In diesem Beispiel werden 20 Grad Celsius bzw. 20 Mikrokalorien pro Sekunde als Betriebstemperatur bzw. Referenzleistung verwendet. Programmieren Sie dann die gewünschten Einspritzmengen und -verzögerungen.

Hier werden 28 Injektionen verwendet, wobei die erste ein Volumen von zwei Mikrolitern und eine 62. Verzögerung und die nachfolgenden Injektionen ein Volumen von 10 Mikrolitern mit einer 332. Verzögerung haben. Das hier gezeigte Experiment bildet die Grundlage für die Generierung eines Datensatzes mit einer einzigen Konzentration, um die erforderlichen zusätzlichen Kurven zu erzeugen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit abnehmenden Makromolekül- und Ligandenkonzentrationen.

Stellen Sie sicher, dass alle Makromolekül- und Ligandenproben aus derselben Stammlösung stammen, um Konzentrationsfehler zu minimieren. Hier ist die rohe isotherme Titrationskalorimetrie-Spur dargestellt, die aus der Titration von 3,86 millimolaren Liganden Acetyl Coenzym A in 192 Mikromolar des Mikromoleküls erzeugt wurde. A A C sechs Primzahl eins.

Augenintegrierte Werte wurden verwendet, um die Bindungsparameter mit einer sequentiellen Anpassung an zwei Stellen zu bestimmen. Diese Grafik zeigt die durch ITC erzeugten Isothermen unterschiedlicher Konzentrationen von ACE, Coenzym A und AAC C sechs Prime One Eye. Die experimentellen Daten, die durch offene Kreise dargestellt werden, wurden sowohl an ein Modell mit zwei unabhängigen Standorten als auch an ein sequentielles Modell mit zwei Standorten angepasst.

Eine bessere Übereinstimmung zeigt sich beim sequentiellen Modell mit zwei Standorten. Die verwendeten Proteinkonzentrationen sind im Begleittext definiert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie mit Ihrer Verdünnung sehr genau sind, da die Änderung der Konzentrationen einen drastischen Einfluss auf Ihre Ergebnisse haben kann.