Eine Strategie, um de novo Mutationen in Common Störungen wie Autismus und Schizophrenie Identifizieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, de novo Mutationen bei häufigen genetischen Störungen identifizieren zu können. Sobald eine Krankheit identifiziert wurde, die der De-novo-Mutationshypothese entspricht, werden kritische Kriterien für die Auswahl der Patientenfälle angewendet, aus denen nach De-novo-Mutationen gesucht werden soll. Als nächstes wird eine qualitativ hochwertige Sequenzierung mit niedrigem Durchsatz oder die Sequenzierung des gesamten Exoms verwendet, um solche Mutationen mit dieser Strategie zu identifizieren.

De-Novo-Mutationen im Shank-3-Gen wurden bei Probanden mit Schizophrenie gefunden. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Genetik von Schizophrenie und Autismus geben. Es kann auch verwendet werden, um andere häufige Krankheiten wie die Melo-Retardierung zu untersuchen.

Nicht alle Krankheiten entsprechen dem De-novo-Krankheitsprofil. Bevor wir also das Protokoll skizzieren, sind dies die wesentlichen Kriterien, die eine Krankheit erfüllen muss, um ein Kandidat für eine Novo-Mutationskrankheit zu sein. Erkrankte Patienten zeigen eine verminderte Fitness.

Die Krankheit tritt häufig in sehr unterschiedlichen Umgebungen auf. Die Erkrankung ist mitunter mit einem höheren Alter des Vaters verbunden. Klassische Kopplungs- und Assoziationsstudien können einen signifikanten Teil der Vererbbarkeit von Krankheiten nicht erklären.

Und schließlich müssen Zwillingskonkordanzdaten ein De-novo-Modell unterstützen. Wenden Sie als Nächstes Kriterien an, um Proben mit einer hohen Wahrscheinlichkeit für eine De-novo-Mutation auszuwählen. Die De-novo-Mutation korreliert mit einem frühen Beginn, schweren Phänotypen, nicht betroffenen Eltern und älteren Vätern, denen Krankheitssymptome fehlen.

Die Verfügbarkeit von DNA kann die Probenauswahl einschränken. Sofern keine Proben sowohl vom Patienten als auch von den Eltern des Patienten zur Verfügung stehen, kann eine Übertragung nicht ausgeschlossen werden. Darüber hinaus ist die Verfügbarkeit zusätzlicher betroffener Kohorten und normaler Probanden für die Validierung eines identifizierten Kandidatengens erforderlich.

Wenn eine ausreichend große Stichprobengröße von Kandidaten und Kontrollen erfasst wurde, fahren Sie mit der Analyseauswahl des besten Kandidaten fort. Genes basiert auf einem Punktesystem. Dieser Kriterienkatalog kann beispielsweise für die Bewertung von Genen verwendet werden, die mit neurokognitiven Erkrankungen assoziiert sind.

Neurologische Erkrankungen wie zum Beispiel eine myotrophe Lateralsklerose würden ganz andere Kriterien anlegen. Dazu gehören synaptische Implikationsevidenz, synaptische Lokalisation, Evidenz, Gewebeexpression, Musterdaten, Tiermodell, Kognition, Daten, Argumente aus der genetischen Analyse und Beteiligung. Nach Anwendung dieser Kriterien können viele Gene zugunsten besserer Kandidaten aus der Studie herausgeparst werden.

Nach der Sequenzierung wenden die Kandidatengene eine Kombination aus zwei oder mehr Sequenzanalyse-Tools an, da diese in der Regel unterschiedlich funktionieren. Zum Beispiel ist die falsch-positive Mutationsrate für SMPs, wie sie von der Polys-Scan-Software berechnet wurde, wie in diesem Diagramm gezeigt, höher als die von der Poly Fred-Software berechnete Rate. Der Polys-Scan zeigt auch eine niedrigere Mutationsrate für Indels als für Poly Fred.

Als letzter Schritt für jeden Roman eliminiert die exonische Variante technische Artefakte durch Verdinglichung, PCR und Resequenzierung. Die interessierende Region der DNA, die aus Blutproben des Patienten extrahiert wurde, und beider Elternteile, die diesen Schritt an der Blut-DNA durchführen, ist wichtig, da einige Mutationen auf Artefakte zurückzuführen sein können, die durch die Teilung kultivierter Lymphoblasten-Zelllinien verursacht werden. Eine leistungsfähige Alternative zur Sequenzierung ausgewählter Kandidatengene ist die Verwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierung zur Sequenzierung der kodierenden Regionen von 16.000 Genen.

Kits zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung des gesamten Exoms sind jetzt von verschiedenen kommerziellen Unternehmen erhältlich. Wenn diese Sequenzen an das Labor zurückgegeben werden, stehen mehrere bioinformatische Werkzeuge zum Nachweis und zur Genotypisierung genomischer Variation zur Auswahl. Bevor Sie nun Mutationen innerhalb des gesamten Exoms priorisieren, wählen Sie Varianten aus eingestuften Kandidatengenen aus, wie zuvor erläutert.

Bei allen Varianten sollte jede nach zwei Kriterien priorisiert werden. Erstens sollte die Variante eindeutig sein und weder in den übergeordneten noch in den öffentlichen s- und p-Datenbanken vorhanden sein. Zweitens wird vorhergesagt, dass die Varianten die Funktion des Gens entsprechend ihrer Position in der Sequenz beeinflussen, indem sie entweder abschneiden oder verändern.

Die Beschichtung. Programme wie PolyPhen, Sift und Panther können alle diese Vorhersagen treffen, um andere ursächliche Mutationen zu identifizieren und sicherzustellen, dass die identifizierten Mutationen bei gesunden Personen nicht vorhanden sind, das gesamte Gen in zusätzlichen Patientenfällen und bei Kontrollen neu zu sequenzieren. Jedes Gen, das mindestens eine De-novo-Mutation enthält, die sich voraussichtlich als schädlich erweist, sollte eine weitere Validierung erhalten Studien bestätigte Varianten können funktionell charakterisiert werden, indem mRNA- und/oder Proteinanalysen an Zelllinien oder Tiermodellen durchgeführt werden, die die Mutationen tragen.

Diese funktionellen Analysen könnten an Zelllinien oder Tiermodellen unter Verwendung des qualitativ hochwertigen Canida-Genansatzes mit niedrigem Durchsatz durchgeführt werden. Bei Schizophrenie-Patienten wurde ein Gen mit zwei verschiedenen De-novo-Mutationen gefunden. Eine Nonsense-Mutation wurde bei drei betroffenen Brüdern gefunden.

In dieser Familie führte die Mutation zu einem vorzeitigen Beendigungssignal am Code auf 1.117 des Genschaftes. Drei. In einer anderen Familie wurde bei einer betroffenen Frau eine Missense-Mutation im selben Gen gefunden. Diese Mutation wandelt sich in Arginin in Tryptophan um, eine ganz andere Aminosäure bei Codon 536.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen und die beschriebenen Methoden angewendet haben, sollten Sie in der Lage sein, Ihre interessierende Krankheit zu bewerten, um zu sehen, ob die Novo-Mutationen eine Rolle spielen oder nicht.