Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

Bei diesem Verfahren wird der Viro-Chip verwendet, ein panviraler Microarray-Assay, um klinische Proben auf bekannte und unbekannte Viren zu analysieren. Erste Nukleinsäuren werden aus klinischen Proben extrahiert. Anschließend wird die extrahierte RNA mit Hilfe von Zufallsprimern revertiert und transkribiert.

zweite Strang-CD-NA-Synthese wird durchgeführt und die CD-NA-Bibliothek wird mit randomisierter PCR amplifiziert. Dann wird die amplifizierte cd NA mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und zu einem viralen Chip-Microarray hybridisiert. Der letzte Schritt besteht darin, den Microarray zu scannen und zu analysieren.

Letztendlich können durch die Analyse des Chip-Microarrays Ergebnisse erzielt werden, die das Vorhandensein oder Fehlen eines Virus oder mehrerer Viren zeigen. Breitspektrum-Nachweismethoden wie ein viraler Chipp-Microarray werden in der diagnostischen Mikrobiologie benötigt, da häufige klinische Syndrome wie Lungenentzündung nicht spezifisch für einen einzelnen Krankheitserreger sind und aufgrund der ständig aufkommenden Bedrohung durch neuartige virale Krankheitserreger wie das SARS-Coronavirus und das neuartige H-eins-N-Eins-Influenzavirus aus dem Jahr 2009. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der diagnostischen Mikrobiologie zu beantworten. zum Beispiel, wie viel Prozent der nicht diagnostizierten Infektionen im klinischen Umfeld durch noch nicht identifizierte neuartige Viren verursacht werden können. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf eine bessere Diagnose akuter klinischer Erkrankungen im Krankenhaus, da wir gleichzeitig auf Hunderte bis Tausende potenzieller Krankheitserreger testen.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals im Jahr 2002, als wir beschlossen, die neu entwickelte Technologie der Microarrays, die im Labor von Dr. Joseph DeRisi an der UCSF entwickelt wurde, auf den Nachweis von Viren anzuwenden. Unser erster realer Testfall war die Verwendung des Viruschips zur Identifizierung eines neuartigen Coronavirus, das für SARS verantwortlich ist, im Jahr 2003, wobei das Verfahren von Anfang bis Ende von einem Techniker aus meinem Labor demonstriert wird, der die Verwendung des Viruschip-Assays an einer Nasenabstrichprobe eines Kindes demonstrieren wird, um die Ursache seiner akuten Atemwegserkrankung zu diagnostizieren. Nasopharynxabstrichproben werden in sterilen Behältern mit Virustransport und flüssigen Medien gesammelt und gefroren in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Lassen Sie das Röhrchen mit der Probe in einer Biosicherheitshaube auftauen und rühren Sie den Tupfer kurz in das Medium, bevor Sie den Tupfer in einem biogefährlichen Behälter entsorgen. Aliquotieren Sie dann 200 Mikroliter der Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie die Probe durch einen 0,22-Mikron-Spin-Filter, um sie von Viruspartikeln zu reinigen, und in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Verwenden Sie als Nächstes das Turbo-DNA-Kit von Ambien gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die genomische DNA des Wirts abzubauen und für geschützte verkapselte virale Nukleinsäuren aufzureinigen. Führen Sie anschließend eine RNA-Extraktion mit dem XMO ZR Virus-RNA-Extraktionskit oder dem Viruskit von Qiagen Ultraschall gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Messen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mit einem NanoDrop-Nukleinsäure-Spektrophotometer.

RNA-Konzentration beträgt vorzugsweise mindestens 10 Nanogramm pro Mikroliter, variiert jedoch von Probe zu Probe unter Verwendung eines dünnwandigen 200-Mikroliter-Röhrchens. Geben Sie einen Mikroliter Primer A in einer Konzentration von 40 PICA Mol pro Mikroliter zu vier Mikrolitern extrahierter RNA. Erhitzen Sie die Probe in einem Thermocycler fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius und lassen Sie das Röhrchen dann fünf Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen.

Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter eines Mastermixes hinzu, der zwei Mikroliter fünfmal RT-Puffer, einen Mikroliter 12,5 Millimolar, DNTP, einen Mikroliter Wasser 0,5 Mikroliter, 0,1 molare DTT und 0,5 Mikroliter hochgestelltes drei, reverse Transkriptase in einem Thermocycler enthält. Inkubieren Sie das Röhrchen 60 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Anschließend erhitzen Sie die Probe zwei Minuten lang auf 94 Grad Celsius.

Um die reverse Transkriptase-Reaktion abzubrechen, rufen Sie zwei Minuten lang auf 10 Grad Celsius und pulsieren Sie fünf Sekunden lang mit einer Zentrifuge. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter Quease-Mix hinzu, bestehend aus einem Mikroliter fünffachem Quease-Puffer, 3,8 Mikrolitern Wasser und 0,15 Mikrolitern Quease für die zweite Strangsynthese. Beschleunigen Sie den Thermocycler innerhalb von acht Minuten von 10 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius.

Acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius halten. Dann zwei Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzen, um die Quease zu inaktivieren und zu diesem Zeitpunkt auf 10 Grad Celsius aufzurufen. Falls gewünscht, lagern Sie die Probe mit 15 Mikrolitern CDNA bei minus 20 Grad Celsius.

Fügen Sie zunächst fünf Mikroliter CD NA-Probe zu 45 Mikrolitern eines Mastermixes hinzu, der aus fünf Mikrolitern 10-fachem PCR-Puffer, einem Mikroliter 12,5 Millimolar, DNTP, einem Mikroliter 100 Pomo pro Mikroliter Primer, B, einem Mikroliter Cleantech LA und 37 Mikrolitern Wasser besteht. Führen Sie dann das PCR-Protokoll wie folgt aus: 94 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 25 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 30 Sekunden. 50 Grad Celsius für 45 Sekunden und 72 Grad Celsius für eine Minute.

Dann ein kniender Schritt von 72 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von einem Halten bei 10 Grad Celsius nach der PCR. Überprüfen Sie das PCR-Produkt und ein 1,5%iges AOSE-Elektrophoresegel. Es sollte ein Abstrich von ca. 200 bis 1000 Basenpaaren sichtbar gemacht werden.

Um AAD DNTP zu integrieren, fügen Sie fünf Mikroliter virales PCR-Produkt zu 45 Mikrolitern eines Mastermixes hinzu, der aus fünf Mikrolitern 10-fachem PCR-Puffer, einem Mikroliter 12,5 Millimolar, A-A-D-N-T-P, einem Mikroliter 100 p Mehrfach-Mikroliter-Primer, B, einem Mikroliter ClinTech LA und 37 Mikrolitern Wasser besteht. Führen Sie das PCR-Protokoll wie folgt aus: 94 Grad Celsius für zwei Minuten, 15 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 30 Sekunden. 50 Grad Celsius für 45 Sekunden.

72 Grad Celsius für eine Minute und einen knienden Schritt von 72 Grad Celsius für fünf Minuten und halten bei 10 Grad Celsius. Reinigen Sie dann das neue PCR-Produkt mit dem DNA Clean und Concentrator Three Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und geben Sie 10 Mikroliter Elutionspuffer ein. Zu den 10 Mikrolitern PCR-Produkt wird ein Mikroliter eines molaren Bikarbonats und ein Mikroliter si drei hinzugefügt und eine Stunde lang im Dunkeln inkubiert.

Reinigen Sie anschließend die S-markierte Probe erneut mit DNA Clean und Concentrator Five Kit und eluieren Sie sie in 12 Mikrolitern Elutionspuffer. Verwenden Sie 1,5 Mikroliter Probe, um die CDNA-Konzentration und die Menge des Farbstoffs zu überprüfen, die in einem NanoDrop-Spektralphotometer in einem PCR-Streifenröhrchen bei einem Mikroliter eingearbeitet ist: 25-facher Fragmentierungspuffer, fünf Mikroliter, fünffacher Blockierungspuffer 9,5 Mikroliter oder Menge, die für eine normalisierte Endkonzentration von 10 Peak oder Mol pro Mikroliter SI, drei markierte Proben und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern erforderlich ist. Fügen Sie dann 25 Mikroliter zweifachen GX-Hybridisierungspuffer hinzu und schleudern Sie kurz nach unten, um Blasen zu entfernen.

Setzen Sie einen neuen Dichtungsschieber in die Hybridisierungskammer ein. Laden Sie 40 Mikroliter der Probe auf den Dichtungsschieber. Platzieren Sie als Nächstes das von Agilent gedruckte Virusarray mit der mit Agilent markierten Seite nach unten auf dem Dichtungsschieber und ziehen Sie die Schraube fest.

Stellen Sie die Hybridisierungskammer in einen 65 Grad Celsius heißen Ofen und hybridisieren Sie über Nacht mit einer langsamen Drehung von 10 Umdrehungen pro Minute, um die Arrays zu waschen. Zuerst den Puffer während des Erhitzens um zwei auf 37 Grad Celsius vorheizen. Füllen Sie einen 500-Milliliter-Kunststoffbehälter mit ca. 250 Millilitern Puffer. Eins.

Entfernen Sie das Array aus der Hybridisierungskammer, tauchen Sie das Array ein und trennen Sie es vom Dichtungsschieber. Übertragen Sie das Array in den sauberen Behälter und waschen Sie es eine Minute lang in Puffer eins. Dann mit einem separaten 500-Milliliter-Plastikbehälter

Waschen Sie das Array eine Minute lang in vorgeheiztem Puffer zwei. Entfernen Sie das Array nach dem Waschen langsam aus dem Puffer. Zweitens, darauf zu achten, Blasen zu vermeiden.

Verwenden Sie ein Kim-Tuch, um überschüssige Feuchtigkeit abzuleiten, und achten Sie darauf, dass Sie die aktive Seite des Arrays nicht direkt berühren. Legen Sie abschließend den Objektträger mit der Agilent-Seite nach oben in den Objektträgerhalter und setzen Sie ihn in den Array-Scanner ein. Bei diesem Verfahren verwenden wir einen Agilent Zwei-Mikron-DNA-Microarray-Scanner.

Scannen Sie das SI-Array mit drei markierten Arrays bei fünf Mikrometern oder zwei Mikrometern gemäß dem Standard-Scanprotokoll des Geräts. Analysieren Sie virale Chipp-Microarrays durch Cluster-Analyse oder das automatisierte RO-Chipp-Analyseprogramm e unprädic. Mit dem Viro Chipp Microarray 2009 kann das neuartige Influenzavirus H one N one in der Nasenabstrichprobe eines Kindes mit grippeähnlicher Erkrankung leicht nachgewiesen werden.

Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der Viruschip in der Lage ist, nicht nur Atemwegsviren, sondern auch eine breite Palette von Viren aus einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe und Körperflüssigkeiten zu identifizieren. Einige Beispiele für den Virusnachweis in Vollblut und Serum mit dem Vichi, wie hier gezeigt. Dies sind Aufrufe, die Viro-Chip-Mikrostrahlen aus Blutproben entsprechen, entweder Vollblut oder Serum, das von vier Patienten für jede Probe entnommen wurde, wobei die beiden obersten Virusvorhersagen angezeigt werden, wobei die oberste Virusvorhersage den niedrigsten P-Wert aufweist.

In der hellblau hervorgehobenen Stichprobe ist beispielsweise die oberste Vorhersage für diese Stichprobe das Dengue-Virus Typ eins. Während die zweitplatzierte Vorhersage das Dengue-Virus Typ zwei ist, wurde das tatsächliche Virus in dieser Vollblutprobe in Übereinstimmung mit den Dict-Ergebnissen tatsächlich als Dengue-Virus Typ eins bestätigt. Eine weitere Anwendung des Viro-Chips ist die Entdeckung neuartiger Krankheitserreger.

Einige Beispiele sind die Entdeckungen des SARS-Coronavirus X-M-R-V-A, OME-Retrovirus, das mit Prostatakrebs und chronischem Müdigkeitssyndrom beim Menschen in Verbindung gebracht wird, und HTCV, ein neuartiges humanes Kardiovirus, das mit Atemwegs- und Durchfallinfektionen bei Kindern in Verbindung gebracht wird. Diese Technik kann in 12 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass alle notwendigen Geräte und Reagenzien nach diesem Verfahren verfügbar sind.

Andere Methoden wie die spezifische virale PCR-Amplifikation und die Tiefensequenzierung können durchgeführt werden, um ungewöhnliche virale Chip-Hybridisierungsmuster oder virale Chip-Ergebnisse, die auf das Vorhandensein eines neuartigen Virus nach seiner Entwicklung hindeuten, zu bestätigen und zu verfolgen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Onkologie, um die Assoziation neuartiger Viren mit Krebs zu erforschen, in den Bereichen Bioverteidigung und klinische Mikrobiologie, um kondensierte mikrobasierte Assays für eine schnelle Erregerdiagnose zu entwickeln, und im Bereich der Virologie für die Charakterisierung neuartiger Viren und ihrer Assoziation mit Krankheiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie alle Schritte des Viruschip-Mikrostrahlen-Assays durchführen, einem Breitband-Überwachungstest zum Nachweis viraler Krankheitserreger in klinischen Proben, von der Nukleinsäureextraktion über klinische Proben bis hin zur Mikrostrahlenhybridisierung und -analyse.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit klinischen Proben als biologisch gefährlich gilt und die Nukleinsäureextraktion in Labors durchgeführt werden sollte, die als Biosicherheitsstufe zwei oder höher eingestuft sind.