Name: Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie der Virochip-Assay zur Erkennung bekannter und neuer Viren in klinischen Proben eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion mehrerer viralen Erreger.

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Wir danken David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, und Alexander Greninger für die initiale Entwicklung und Optimierung der Virochip Protokoll. Diese Arbeit wird durch ein NIH K08 zu gewähren und Abbott Discovery Award (CC) und dem Howard Hughes Medical Institute (bis JLD) unterstützt.

Die Schritte des Virochip Assay umfassen (1) Nukleinsäure-Extraktion aus klinischen Proben, (2) reverse Transkription der RNA extrahiert und 2 nd-cDNA-Synthese, (3) PCR-Amplifikation von cDNA zufällig grundiert, (3) Cy3 Fluoreszenzfarbstoff Einbau (4), die Hybridisierung von markierten Materials auf die Virochip Microarray, und (5) Scannen und Analyse (Abbildung 1). Das Protokoll unten wird die Nutzung des Virochip Assay auf einem Nasenabstrich Probe aus einem Kind zeigen, mit einem Influenza-ähnliche Erkrankung. Primersequenzen Primer A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 ' Primer B-5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 ' 1. Nukleinsäure-Extraktion <ol><li> Nukleinsäure-Extraktion aus klinischen Proben sollten unter Biosafety Level 2 (BSL-2) oder höher Bedingungen durchgeführt werden, da diese Proben potenziell infektiös sind. </li><li> Der Nasenabstrich Probe wird in virale Holding Medium transportiert. Aliquot 200 ul der Probe in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß. </li><li> Optional: pass Probe durch ein 0,22 um-Filter (für virale Partikel zu reinigen) </li><li> Optional: Vorbehandlung Probe mit DNAse (zum Host genomische DNA abbauen und reinigen für geschützte enkapsidiert viralen Nukleinsäure) mit dem Turbo DNAse Kit (Ambion) gemäß den Anweisungen des Herstellers </li><li> Entpacken Sie die Probe mit dem Zymo ZR Viral RNA Extraction Kit oder Qiagen UltraSens Virus Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 2. Reverse Transkription und 2 nd-cDNA-Synthese ("Round A") <ol><li> Add 1 UL 40 pmol / ul Primer A bis 4 uL extrahierte RNA. Hitze bis 65 ° C für 5 min in einem Thermocycler (zB GeneAmp PCR System 9700) und dann abkühlen lassen bei Raumtemp x 5 min. </li><li> Add 5 ul einer Master-Mix bestehend aus 2 ul 5X RT-Puffer, 1 ul 12,5 mM dNTP, 1 ul Wasser, 0,5 ul 0,1 M DTT und 0,5 ul SSIII RT (Invitrogen). Inkubation bei 42 ° C x 60 Minuten. </li><li> In einem programmierbaren Thermocycler, Hitze bis 94 ° C x 2 min (zum Abbruch der Reverse-Transkriptase-Reaktion), kühl bis 10 ° C, Puls Zentrifuge, und fügen Sie dann 5 ul Sequenase Mix, bestehend aus 1 ul 5X Sequenase Puffer, 3,8 ul Wasser, und 0,15 ul Sequenase (USB Corporation). Für 2 nd-Strang-Synthese, Rampe von 10 ° C bis 37 ° C über 8 min, 8 min halten, dann Hitze auf 94 ° C x 2 min (zu Sequenase inaktivieren) und kühlen bis 10 ° C (halten). </li><li> Optional: Rd Ein Beispiel cDNA kann an dieser Stelle bei -20 ° C gelagert werden </li></ol> 3. PCR-Amplifikation zufällig Primed cDNA ("Round B") <ol><li> Add 5 ul Rd Eine Stichprobe von 45 ul einer Master-Mix bestehend aus 5 ul 10x PCR-Puffer, 1 ul 12,5 mM dNTP, 1 ul 100 pmol / ul Primer B, 1 ul KlenTaq LA (Sigma) und 37 ul Wasser. </li><li> Run PCR-Protokoll wie folgt: 94 ° C, 2 min → (25 Zyklen von 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( halten) </li><li> Überprüfen Sie die Rd B-Probe auf einem 1,5% Agarose Elektrophorese-Gel. Ein Abstrich aus ca. 200 - 1000 bp sollte visualisiert werden (Abb. 2A) </li></ol> 4. Cy3 Fluoreszenzfarbstoff Incorporation <ol><li> Optional: ein weiteres Beispiel kann mit dem Cy5 Fluoreszenzfarbstoff markiert werden und hybridisiert die gleichen Microarray. </li><li> Zur Einarbeitung aa-dNTP, mit 5 ul Rd B-Probe zu 45 uL einer Master-Mix bestehend aus 5 uL 10x PCR-Puffer, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / ul Primer B, 1, 1 UL KlenTaq LA (Sigma) und 37 uL Wasser. Run PCR-Protokoll wie folgt: 94 ° C, 2 min → (15 Zyklen von 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( halten) </li><li> Reinigen Sie die Rd C Probe mit den DNA Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 10 ul. </li><li> Add 1 ul 1M Bicarbonat (Sigma) und 1 uL Cy5 (GE Healthcare), die Rd C Probe. </li><li> Inkubieren x 1 Stunde im Dunkeln. </li><li> Reinigen Sie die Cy3-markierten Probe mit den DNA-Clean and Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Eluieren in 12 ul. </li></ol> 5. Hybridisierung zu Virochip Microarray <ol><li> Optional: Verwendung 1,5 ul der cDNA-Konzentration und der Menge an Farbstoff auf einem Nanodrop Spektrophotometer aufgenommen zu überprüfen (zur Normalisierung der Proben) </li><li> In einer PCR-Streifen Rohr add 1 ul 25X Fragmentierung Puffer, 5 ul 5X Blockierungspuffer, 9,5 ul (oder die Menge zu normalisieren) von Cy3-markierten Probe, und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 25 ul (Agilent) </li><li> Add 25 ul 2X GEx Hybridisierungspuffer (Agilent). Spin down kurz, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Legen Sie 40 ul der Probe auf Dichtung schieben. </li><li> Ort Agilent-gedruckt Virochip array (University of California, San Francisco / Agilent) (Seite mit der Aufschrift "Agilent" down) auf der Oberseite der Dichtung schieben und befestigen Sie Schraube fest. </li><li> Hybridisierung über Nacht in 65 ° C Backofen, Drehzahleinstellung bei 10 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Um Arrays, Vorwärmen Puffer 2 (Agilent) auf 37 ° C waschen Nehmen Sie Abstand Dichtung schieben / array Sandwich Unterwasserwelt in Puffer 1 (Agilent). Wash in Puffer 1 x 1 min. Wash in vorgewärmten Puffer 2 x 1 min. Langsam entfernen Folie aus Puffer 2, wobei darauf zu Blasen zu vermeiden (Verwendung Kimwipe weg Docht zusätzliche Feuchtigkeit wird sorgfältig vermieden direkt berühren aktive Seite des Arrays) </li><li> Legen Sie gleiten in Diahalter und insert into Array-Scanner. </li></ol> 6. Virochip Scanning und Analyse <ol><li> Scan Cy3-markierten Array mit 5 &amp;mgr; m oder 2 um je nach Instrument der Standard-Scan-Protokoll (Abbildung 2B). </li><li> Analysieren Virochip Microarrays durch visuelle Inspektion, Cluster-Analyse oder die automatisierte Virochip Analyse-Programm, E-Predict 11. Mit jeder dieser drei Methoden ist Influenzaviren leicht in der Nasenabstrich Probe (von einem Kind mit Grippe-ähnliche Erkrankung) (Abbildung 2C) erkannt </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt erledigt ist, sollte ein Abstrich auf Agarosegelelektrophorese nach dem Rd B Schritt (Abbildung 2A) gesehen werden. Die Virochip Microarray auf der Agilent-Plattform wird schwierig sein, visuell zu analysieren (Abbildung 2B), aber wenn ein Virus vorhanden ist, sollte leicht durch Sichtkontrolle, Cluster-Analysen und / oder E-Predict (Abbildung 1C) identifiziert werden. Als positive Kontrolle für den Test dienen, können Proben mit gemessenen Mengen von Nukleinsäure aus einem bekannten Virus (MS2 Bakteriophage zB Tabak-Mosaik-Virus) versetzt werden. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Virochip Microarray-Verarbeitung und Analyse. Extrahierte Nukleinsäure aus klinischen Proben werden nach dem Zufallsprinzip amplifiziert, markiert mit Fluoreszenzfarbstoffen und hybridisiert die Virochip Microarray. Microarrays sind bei 2 mm Auflösung gescannt und analysiert mit einer Vielzahl von rechnerischen Werkzeugen, einschließlich E-vorherzusagen. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Schritte in die Virochip Assay Nach der Verstärkung durch zufällige PCR, ein Abstrich von 200 -. 1000 bp sichtbar gemacht werden durch Gelelektrophorese (A) (B) Drei Virochip Microarrays aus dem 8 Arrays / Objektträger aus Glas dargestellt, mit einer kleinen Region. eines Microarray aufgeblasene im Einschub auf der rechten unteren Ecke. (C) Automated Microarray-Analyse mit viralen E-Predict enthüllt die Anwesenheit von Influenza A-Virus in der klinischen Probe. Die hohe Ähnlichkeit Score (s = 0,55) entspricht einem p-Wert, der nahe bei Null liegt, wodurch dieser eine äußerst signifikante Vorhersage.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
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<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
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<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

Die Virochip Protokoll, wie hier beschrieben ist komplex und erfordert eine sorgfältige und qualifizierte Forschungs-Techniker. Richtig Reagenz-Konzentrationen und Bedingungen für die PCR, Kennzeichnung und Hybridisierung sind kritisch. Die Virochip Protokoll kann leicht modifiziert werden, um die Analyse der erkrankten Geweben durch die Verwendung eines Gewebes Extraktionsmethode wie TRIzol (Invitrogen) zur Nukleinsäure-Extraktion unterzubringen. Probes können hinzugefügt oder gelöscht werden, wie notwendig, um das gewünschte Spektrum und Breite der Abdeckung zu erzielen, z. B. Sonden zum Nachweis von viralen Ziele wie Bakterien und Pilze können entwickelt und hinzugefügt werden &quot;on-the-fly&quot;. Einige Anwendungen des Virochip Assay derzeit in Entwicklung sind Breitspektrum-virale Diagnostik im klinischen Labor, Ausbruch Untersuchung, Reinheit Screening von Medikamenten und Impfstoffen sowie neuartige virale Erreger entdeckt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz / Material </th><th> Name des Reagenz / Material </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 ul) </td><td> 2 ul 5X RT-Puffer </td></tr><tr><td> 1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ul Wasser </td></tr><tr><td> 0,5 ul 0,1 M DTT </td></tr><tr><td> 0,5 ul SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 ul) </td><td> 1 ul 5X Sequenase Puffer </td></tr><tr><td> 3,8 ul Wasser </td></tr><tr><td> 0,15 ul Sequenase (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd B PCR Master Mix (45 ul) </td><td> 5 ul 10x PCR-Puffer </td></tr><tr><td> 1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ul 100 pmol / ul Primer B </td></tr><tr><td> 1 ul KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 ul Wasser </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd C PCR Master Mix (45 ul) </td><td> 5 ul 10x PCR-Puffer </td></tr><tr><td> 1 ul 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ul 100 pmol / ul Primer B </td></tr><tr><td> 1 ul KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 ul Wasser </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hybridisierungspuffer (25 ul) </td><td> 1 ul 25X Fragmentierung Puffer (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 ul 5X Blocking-Puffer (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 ul (oder die Menge zu normalisieren) von Cy3-markierten Probe </td></tr><tr><td> Fügen Sie Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 25 ul </td></tr><tr><td> Agilent Virochip Microarray </td><td> Lizenz angemeldet, verfügbar ab Chiu Labor, UCSF </td></tr></tbody></table>

mit einem pan-viral microarray-assay (virochip) zur klinischen proben, die für virale erreger bildschirm

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Die Diagnose von viralen Ursachen vieler Infektionskrankheiten ist schwierig aufgrund der inhärenten Reihenfolge Vielfalt der Viren sowie die laufende Aufkommen neuer viraler Erreger wie SARS-Coronavirus und 2009 pandemische H1N1-Influenza-Virus, die nicht nachweisbar sind mit herkömmlichen Methoden. Um diese Herausforderungen anzugehen, haben wir bereits entwickelt und validiert eine pan-virale Microarray-Plattform namens Virochip mit der Fähigkeit, alle bekannten Viren sowie neue Varianten auf Basis der konservierten Sequenz Homologie 1 zu erfassen. Mit dem Virochip, haben wir das gesamte Spektrum der Viren mit Infektionen der Atemwege, einschließlich Fälle von ungeklärter critical illness bei hospitalisierten Patienten mit einer Empfindlichkeit entspricht oder überlegen gegenüber herkömmlichen klinischen Tests 2-5 assoziiert identifiziert. Die Virochip wurde auch genutzt, um neue Viren zu identifizieren, einschließlich des SARS-Coronavirus 6,7, einem neuartigen Rhinovirus Clade 5, XMRV (ein Retrovirus in Verbindung mit Prostata-Krebs) 8, Vogelgrippe Bornavirus (die Ursache eines Wasting Disease bei Papageien) 9, und eine neuartige cardiovirus bei Kindern mit Atemwegs-und Durchfallerkrankungen 10. Die aktuelle Version des Virochip hat zu einer Agilent Microarray-Plattform portiert worden und besteht aus ~ 36.000 Sonden aus über ~ 1.500 Viren in GenBank Stand Dezember 2009 abgeleitet. Hier zeigen wir die Schritte in der Bearbeitung eines Virochip Assay von Anfang bis Ende (~ 24 Stunden Bearbeitungszeit), einschließlich Probe Nukleinsäure-Extraktion, PCR-Amplifikation mit Random-Primern, Fluoreszenzfarbstoff Einarbeitung und Microarray-Hybridisierung, Scannen und Analyse.

Die Virochip ist ein pan-virale Microarray entwickelt, um gleichzeitig zu erkennen alle bekannten Viren sowie neue Viren auf der Basis von konservierten Sequenzhomologie. Hier zeigen wir, wie man ein Virochip Testlauf zu klinischen Proben auf das Vorhandensein von sowohl bekannte als auch unbekannte Viren zu analysieren.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

Die Diagnose viraler Ursachen vieler Infektionskrankheiten ist aufgrund der inhärenten Sequenzdiversität von Viren sowie des kontinuierlichen Auftretens ...

Dieses Verfahren verwendet den Viro-Chip, einen panviralen Microarray-Assay, um klinische Proben auf bekannte und unbekannte Viren zu analysieren. Zunächst werden Nukleinsäuren aus klinischen Proben extrahiert. Anschließend wird die extrahierte RNA mit Hilfe von zufälligen Primern revers transkribiert.Die Synthese des zweiten DNA-Strangs wird durchgeführt und die DNA-Bibliothek mittels zufälliger PCR amplifiziert. Anschließend wird die amplifizierte DNA mit fluoreszenten Farbstoffen markiert und auf einem viralen Chip-Microarray hybridisiert. Der letzte Schritt besteht in der Scannung und Analyse des Microarrays.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die anhand der Analyse des Chip-Microarrays das Vorhandensein oder Fehlen eines Virus oder mehrerer Viren zeigen. Breitband-Detektionsmethoden wie ein virales Chip-Microarray werden in der diagnostischen Mikrobiologie benötigt, da häufige klinische Syndrome wie Pneumonie nicht auf einen einzelnen Erreger beschränkt sind und aufgrund der ständigen Bedrohung durch neu auftretende virale Pathogene wie das SARS-Coronavirus und das neuartige Influenzavirus H1N1 aus dem Jahr 2009. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der diagnostischen Mikrobiologie beantworten, beispielsweise welcher Anteil undiagnostizierter Infektionen im klinischen Umfeld möglicherweise durch bislang unbekannte, neuartige Viren verursacht wird. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zu einer besseren Diagnose akuter Erkrankungen im Krankenhaus, da wir gleichzeitig auf Hunderte bis Tausende potenzieller Krankheitserreger testen.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals im Jahr 2002, als wir beschlossen, die neu entwickelte Technologie der Mikroarrays – eine Technik, die im Labor von Dr. Joseph DeRisi an der UCSF maßgeblich vorangetrieben wurde – für den Nachweis von Viren einzusetzen. Unser erster praktischer Anwendungsfall war der Einsatz des Virus-Chips zur Identifizierung eines neuartigen Coronavirus, das 2003 für das SARS verantwortlich war. Die vollständige Durchführung des Verfahrens wird hier von einer Technikerin aus meinem Labor demonstriert, die den Virus-Chip-Test an einem Nasenabstrich einer Kindes durchführt, um die Ursache ihrer akuten Atemwegserkrankung zu diagnostizieren. Nasopharyngeale Abstrichproben werden in sterilen Behältern mit Virus-Transportmedium, einer flüssigen Nährlösung, gesammelt und anschließend bei minus 80 Grad Celsius eingefroren gelagert.Im Biosicherheitswerkbank lassen Sie das Röhrchen mit der Probe auftauen und rühren Sie den Abstrich kurz in das Medium ein, bevor Sie den Abstrich in einen Behälter für biohazardöses Abfallmaterial entsorgen. Anschließend portionieren Sie 200 Mikroliter der Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Führen Sie die Probe durch einen 0,22-Mikron-Spinfilter, um virale Partikel zu reinigen, und sammeln Sie sie in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen auf.Verwenden Sie anschließend das Turbo DNA-Kit von Ambien gemäß den Herstelleranweisungen, um die genomische Wirtsdna ab abzubauen und die geschützte, verkapselte virale Nukleinsäure zu reinigen. Führen Sie danach eine RNA-Extraktion mit dem XMO ZR-Virus-RNA-Extraktionskit oder dem Qiagen-Ultraschall-Viruskit gemäß den Herstelleranweisungen durch. Bestimmen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mithilfe eines NanoDrop-Nukleinsäurespektrophotometers.Die RNA-Konzentration sollte vorzugsweise mindestens 10 Nanogramm pro Mikroliter betragen, kann jedoch je nach Probe variieren, wobei ein dünwwandiger 200-Mikroliter-Tube verwendet wird. Geben Sie ein Mikroliter Primer A mit einer Konzentration von 40 PICA-Mol pro Mikroliter zu vier Mikrolitern extrahierter RNA hinzu. Erhitzen Sie die Probe fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius in einem Thermocycler und lassen Sie den Tube anschließend fünf Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen.Fügen Sie anschließend fünf µL einer Master-Mix-Lösung hinzu, die zwei µL 5× RT-Puffer, ein µL 12,5 mmol DNTP, ein µL Wasser, 0,5 µL 0,1 mol DTT und 0,5 µL Superscript III Reverse Transkriptase enthält, in einen Thermocycler. Inkubieren Sie das Gefäß bei 42 °C für 60 Minuten. Erhitzen Sie dann die Probe auf 94 °C für zwei Minuten. Um die Reverse-Transkriptase-Reaktion abzubrechen, zwei Minuten lang auf 10 Grad Celsius abkühlen und kurz zentrifugieren (fünf Sekunden). Als Nächstes fünf Mikroliter Quease-Mix hinzufügen, bestehend aus einem Mikroliter fünfmal Quease-Puffer, 3,8 Mikrolitern Wasser und 0,15 Mikrolitern Quease für die Synthese des zweiten Strangs. Den Thermocycler innerhalb von acht Minuten von 10 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius hochfahren.8 Minuten bei 37 Grad Celsius halten. Dann auf 94 Grad Celsius für 2 Minuten erhitzen, um die Quease zu inaktivieren, und auf 10 Grad Celsius abkühlen. Falls gewünscht, die Probe mit 15 µL cDNA bei minus 20 Grad Celsius lagern.Zunächst fünf µL CD-NA-Probe zu 45 µL einer Master-Mix-Lösung hinzufügen, die aus fünf µL 10× PCR-Puffer, einem µL 12,5 mmolar DNTP, einem µL 100 Pico-mol pro µL Primer B, einem µL Cleantech LA und 37 µL Wasser besteht. Anschließend den PCR-Protokollschritt wie folgt durchführen: 94 °C für zwei Minuten, gefolgt von 25 Zyklen mit jeweils 94 °C für 30 Sekunden, 50 °C für 45 Sekunden und 72 °C für eine Minute.Danach eine abschließende Inkubation bei 72 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von einer Lagerung bei 10 Grad Celsius nach der PCR. Überprüfen Sie das PCR-Produkt mittels eines 1,5 %igen Agarose-Elektrophoresegels. Ein Bandenmuster von etwa 200 bis 1000 Basenpaaren sollte sichtbar sein.Um AAD dNTP einzubauen, geben Sie fünf Mikroliter virales PCR-Produkt zu 45 Mikrolitern einer Master-Mix-Lösung hinzu, die aus fünf Mikrolitern 10× PCR-Puffer, einem Mikroliter 12,5 Millimolar A-A-D-N-T-P, einem Mikroliter 100 pM pro Mikroliter Primer B, einem Mikroliter ClinTech LA und 37 Mikrolitern Wasser besteht. Führen Sie das PCR-Protokoll wie folgt durch: 94 Grad Celsius für zwei Minuten, 15 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 30 Sekunden und 50 Grad Celsius für 45 Sekunden.72 Grad Celsius für eine Minute und ein abschließender Schritt von 72 Grad Celsius für fünf Minuten, anschließend Halten bei 10 Grad Celsius. Reinigen Sie dann das neue PCR-Produkt mit dem DNA Clean- und Concentrator-Kit gemäß den Herstelleranweisungen und lösen Sie es in 10 Mikrolitern Elutionspuffer auf. Geben Sie einen Mikroliter einer einmolarigen Bicarbonatlösung und einen Mikroliter si drei zu den 10 Mikrolitern PCR-Produkt hinzu und inkubieren Sie eine Stunde im Dunkeln.Als Nächstes reinigen Sie erneut die mit S markierte Probe mit dem DNA Clean and Concentrator Five Kit und eluieren in 12 Mikrolitern Elutionspuffer. Verwenden Sie 1,5 Mikroliter der Probe, um die cDNA-Konzentration und die Menge der eingebauten Farbstoffe auf einem NanoDrop-Spektrophotometer in einer PCR-Streifenkappe zu bestimmen, mit einem Volumen von einem Mikroliter, 25-mal Fragmentierungspuffer, fünf Mikrolitern 5-mal Blockierpuffer, 9,5 Mikrolitern oder der Menge, die für eine normalisierte Endkonzentration von 10 Spitzen- oder Mol pro Mikroliter der mit SI drei markierten Probe erforderlich ist, und Wasser auf ein Gesamtvolumen von 25 Mikrolitern. Geben Sie anschließend 25 Mikroliter zweifachen GX-Hybridisierungspuffers hinzu und zentrifugieren Sie kurz, um Blasen zu entfernen.Platzieren Sie eine neue Dichtungsfolie in die Hybridisierungskammer. Geben Sie 40 Mikroliter der Probe auf die Dichtungsfolie. Legen Sie danach den mit „Agilent“ markierten bedruckten viralen Array mit der Markierungsseite nach unten auf die Dichtungsfolie und befestigen Sie die Schraube fest.Platzieren Sie die Hybridisierungskammer in einem Ofen bei 65 Grad Celsius und hybridisieren Sie über Nacht bei einer langsamen Rotation von 10 Umdrehungen pro Minute, um die Arrays zu waschen. Erwärmen Sie zunächst Puffer zwei auf 37 Grad Celsius. Füllen Sie einen 500 Milliliter fassenden Kunststoffbehälter mit etwa 250 Millilitern Puffer.Eins.Entfernen Sie das Array aus der Hybridisierungskammer, tauchen Sie das Array ein und lösen Sie es von der Dichtungsplatte. Überführen Sie das Array in den sauberen Behälter und waschen Sie es eine Minute lang in Puffer eins. Anschließend mit einem separaten 500 Milliliter fassenden Kunststoffbehälter.Spülen Sie das Array eine Minute lang in vorgewärmtem Puffer zwei. Nach dem Spülen entfernen Sie das Array langsam aus Puffer zwei, wobei Sie darauf achten müssen, Blasen zu vermeiden.Verwenden Sie ein Kim-Tuch, um überschüssige Feuchtigkeit abzuziehen, und achten Sie dabei darauf, die aktive Seite des Arrays nicht direkt zu berühren. Legen Sie schließlich den Objektträger mit der Agilent-Seite nach oben in den Objektträgerhalter und setzen Sie ihn in den Array-Scanner ein. In diesem Verfahren verwenden wir einen Agilent Two-Micron-DNA-Microarray-Scanner.Scannen Sie das SI-drei-markierte Array mit fünf Mikrometern oder zwei Mikrometern gemäß dem standardmäßigen Abtastprotokoll des Instruments. Analysieren Sie virale Chipp-Microarrays durch Clusteranalyse oder das automatisierte RO-Chipp-Analyseprogramm e unpredic. Mithilfe des Viro-Chipp-Microarrays wird das neuartige Influenza-H1N1-Virus aus dem Jahr 2009 leicht in der Nasenabstrichprobe eines Kindes mit grippeähnlicher Erkrankung nachgewiesen.Außerdem haben wir gezeigt, dass der virale Chip in der Lage ist, nicht nur Atemwegsviren, sondern auch ein breites Spektrum von Viren aus verschiedenen Geweben und Körperflüssigkeiten zu identifizieren. Einige Beispiele für die Virusdetektion in Vollblut und Serum mithilfe des Vichi sind hier dargestellt. Es handelt sich um Ere-Aufrufe, die Viro-Chip-Mikroarrays aus Blutproben entsprechen, entweder aus Vollblut oder Serum, die von jeweils vier Patienten entnommen wurden. Für jede Probe sind die beiden besten Virusvorhersagen angegeben, wobei die oberste Virusvorhersage den niedrigsten P-Wert aufweist.Beispielsweise ist bei der in hellblau hervorgehobenen Probe die bestbewertete Vorhersage für diese Probe das Dengue-Virus Typ eins. Obwohl die an zweiter Stelle klassifizierte Vorhersage das Dengue-Virus Typ zwei ist, wurde das tatsächlich in dieser Vollblutprobe vorhandene Virus eindeutig als Dengue-Virus Typ eins bestätigt, was mit den dict-Ergebnissen übereinstimmt. Eine weitere Anwendung des Viro-Chips liegt in der Entdeckung neuartiger Krankheitserreger.Beispiele hierfür sind die Entdeckungen des SARS-Coronavirus X-M-R-V-A, des OME-Retrovirus, das mit Prostatakrebs und chronischem Erschöpfungssyndrom beim Menschen in Verbindung steht, sowie des HTCV, eines neuartigen menschlichen Kardiovirus, das mit Atemwegs- und Durchfallinfektionen bei Kindern assoziiert ist. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in 12 Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass sämtliche notwendigen Geräte und Reagenzien gemäß diesem Protokoll verfügbar sind.Andere Methoden wie die spezifische virale PCR-Amplifikation und die Tiefensequenzierung können durchgeführt werden, um ungewöhnliche Hybridisierungsmuster oder Ergebnisse von Virus-Chips zu bestätigen und weiterzuverfolgen, die auf das Vorhandensein eines neuartigen Virus hindeuten, nachdem es entwickelt wurde. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Onkologie den Weg, um die Assoziation neuartiger Viren mit Krebserkrankungen zu erforschen; im Bereich der biologischen Abwehr und der klinischen Mikrobiologie ermöglichte sie die Entwicklung kompakter, mikrobasierter Assays für eine schnelle Pathogendiagnostik sowie auf dem Gebiet der Virologie die Charakterisierung neuartiger Viren und deren Zusammenhang mit Erkrankungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie alle Schritte des viralen Chip-Mikroarray-Assays durchgeführt werden – eines breit angelegten Überwachungstests zur Detektion viraler Pathogene in klinischen Proben, beginnend bei der Nukleinsäure-Extraktion aus klinischen Proben bis hin zur Mikroarray-Hybridisierung und -Analyse.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit klinischen Proben als biologisch gefährlich gilt und die Nukleinsäure-Extraktion in Laboren der Biosicherheitsstufe zwei oder höher durchgeführt werden sollte.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

In diesem Video demonstrieren wir den Prozess zum Nachweis von Antikörper-Isotypen in mehreren menschlichen Serumproben anhand eines Microarray-Objektträgers, der mit antigenen Subtypen von Influenzavirusstämmen gedruckt wurde.

Viraler Antigen-Microarray-Assay zum Nachweis von Antikörper-Isotypen im Serum gegen virales Antigen

Dieses Video zeigt einen viralen Attachment-Assay zum Screening antiviraler Verbindungen. Unter Verwendung von genetisch veränderten Hepatitis-C-Viren und Luciferase werden inhibitorische Effekte auf die Virusanheftung bewertet, was sich in einer geringeren Lichtintensität in gleichzeitig behandelten Vertiefungen im Vergleich zu Vertiefungen, die nur mit dem Virus behandelt wurden, zeigt.

Ein Virus-Attachment-Assay für das Screening von antiviralen Verbindungen

Eine integrierte Mikrofluidvorrichtung thermoplastischen Chip zur Verwendung als molekulare Diagnostik entwickelt. Der Chip führt Nukleinsäureextraktion, reverse Transkriptase und PCR. Methoden zur Herstellung und den Betrieb der Chip beschrieben.

Mikrofluidischen Chip Herstellung und Verfahren zur Influenza Detect

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

In-vitro-Assays zur Messung der Virusreplikation wurde durch die Entwicklung von rekombinanten RNA-Viren Luciferase oder andere Enzyme, die Biolumineszenz exprimieren verbessert. Hier werden wir ausführlich ein Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die solche rekombinante Stämme von Masern-und Chikungunya-Viren, um Breitspektrum antiviralen Medikamenten aus chemischen Bibliotheken zu isolieren verbindet.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Hier beschreiben wir ein Protokoll für den Einsatz von Hochdurchsatz-Screening der RNAi Host Ziele aufzudecken, die manipuliert werden können, um die onkolytische Viren Therapie zu verbessern, speziell Rhabodvirus und Vaccinia-Virus-Therapie, aber es kann leicht an andere onkolytische angepasst werden Virus-Plattformen oder für die Entdeckung von Host-Gene, die Replikation des Virus in der Regel zu modulieren.

Genomweiten RNAi-Screening, Host Faktoren zu identifizieren, die onkolytische Viren Therapie zu modulieren

Erfahren Sie, wie der Virochip-Assay zur Erkennung bekannter und neuer Viren in klinischen Proben eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion mehrerer viralen Erreger.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

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