Name: Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Lernen Sie die funktionelle Integration adult geborener Neuronen im Hippocampus zu untersuchen. Diese Methode kombiniert retrovirale Markierung mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten von Mäusen.

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Diese Arbeit wurde von NINDS und American Heart Association zu S.Ge. finanziert Dieser Ansatz wurde ursprünglich gegründet, entwickelt und vom Autor in Dr. Hongjun Lied-Labor in der Johns Hopkins University. Wir möchten Dr. Hongjun Lied für seine Hilfe und Unterstützung bedanken.

1. Virus Injection High-Titer entwickelt Retrovirus (1 × 10 9 Einheiten / ml) wird durch Co-Transfektion von retroviralen Vektoren hergestellt und VSVG in HEK293T Zellen durch Ultrazentrifugation von viralen Überstand gefolgt. Für Herkunft und Produktionsmethoden, siehe den ausgezeichneten JoVE Demonstration (3). Hinweis: Young adult (4-6 Wochen alt) weibliche C57BL / 6 Mäuse (Charles River) wurden unter den Standardbedingungen untergebracht. Alle Verfahren folgen dem National Research Council Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren unter einem Protokoll, das von der Stony Brook University IACUC genehmigt. <ol><li> Thaw 2UL von gefrorenen Retrovirus pro Tier auf dem Eis. </li><li> Betäuben (100 ug Ketamin + 10 pg Xylazin pro Gramm Körpergewicht) und montieren Sie das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen (Steolting). Entfernen Sie die Haare auf dem Kopf, und wischen Sie die Haut mit 70% Ethanol. </li><li> Expose des Schädels und bohren Sie vier flachen Löchern mit einem zahnärztlichen Bohrer (0,6 mm-Bohrer) an den folgenden Koordinaten: <ul><li> anterioposterior = -2 mm von Bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm vom Bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li><li> anterioposterior = -2 mm von Bregma; lateral = ± 1,6 mm; ventral = 2,5 mm; anterioposterior = -3 mm vom Bregma; lateral = ± 2,6 mm; ventral = 3,2 mm. </li></ul></li><li> Montieren Sie einen 1μl Hamilton, Flachbild-Spritze und injizieren 0,5 ul Retrovirus pro Standort mit einer Rate von 0,25 ml / min in den Gyrus dentatus. (Siehe oben die Koordinaten für ventralen Tiefe.) Pause von 2 Minuten nach jeder Injektion, bevor langsam Zurückziehen der Spritze Flüssigkeit Rückfluss zu verhindern. Zwischen den Injektionen, kurz abspülen der äußeren Oberfläche der Spritze mit sterilem PBS und einem Applikator, um Spuren von Blut zu entfernen. </li><li> Schließen Sie die Wunde mit sterilen chirurgischen Nahtmaterial (Typ P-1, Größe 6-0) und kehren das Tier auf Standard Wohnbedingungen, bis die gewünschte Zeit Stadien nach der Injektion. </li></ol> 2. Slice-Vorbereitung Um qualitativ hochwertige akuten Scheiben von ausgewachsenen Mäusen, verwenden wir eine modifizierte Schneiden Lösung für Stück Vorbereitung (siehe unten). <ol><li> Pre-chill Schneiden Lösung auf 0-4 ° C auf Eis und Blase mit 95% O 2 -5% CO 2 für mindestens 30 Minuten. </li><li> Betäuben und transkardial perfuse ein Tier mit eiskaltem sauerstoffgesättigten Schneiden Lösung. </li><li> Schnelles Entfernen des Gehirns in eine Petrischale mit Filter-Papier mit kaltem, mit Sauerstoff Zuschnittlösung vorbenetzt. Cut off des Kleinhirns und in Scheiben schneiden einer Montagefläche mindestens 1 mm anterior der (sichtbare) Injektion Koordinaten. Kleben Sie die Gehirn-auf eine vibrotome Bühne und montieren Sie ihn in den Mahlraum mit Kalt-und sauerstoffreiches Schneid-Lösung gefüllt. </li><li> Bereiten koronalen oder horizontale Schnitte (300-350μm) und übertragen Sie sie mit einer großen Bohrung Pipette eine Inkubation Kammer mit Raumtemperatur ACSF sprudelte mit 95% O 2 / 5% CO 2. </li><li> Inkubieren Sie die Schnitte, sprudelnde kontinuierlich, bei 32 ° C für 30-60 Minuten. Return der Kammer auf Raumtemperatur für die Dauer der Aufnahme. </li></ol> 3. Elektrophysiologischen Experimenten <ol><li> 34 ° C - Scheiben sind in die Aufnahme Kammer, die kontinuierlich mit Sauerstoff gesättigt ACSF ist bei 32 ° C perfundiert übertragen </li><li> Eine bipolare Wolfram Stimulationselektrode ist in der molekularen Schicht des Gyrus dentatus mit geringer Vergrößerung Mikroskop-Objektiv (10-fach) platziert. </li><li> Newborn DGCs in der Sub-granular zone / Granularzelltumoren Schicht werden durch die Expression von GFP oder dTomato identifiziert. Whole-cell patchclamp Aufnahme befindet sich auf neugeborene Neuronen unter hoher Vergrößerung (40X) durchgeführt. </li><li> Firing Eigenschaften der aufgenommenen Zellen werden durch Injektion von einer Reihe von Strömen unter Current-Clamp-Modus erhalten. </li><li> Elektrische Reize werden durch die Stimulationselektrode über eine Stimulation Isolator durch die Recording-Software gesteuert geliefert, und evozierte postsynaptische Ströme in den neugeborenen DGCs werden aufgezeichnet. </li></ol> 4. Data Analysis Amplituden der evozierten postsynaptischen Antworten sind in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Erwachsenen-geboren Neuronen analysiert. 5. Repräsentative Ergebnisse Mit dem obigen Protokoll ist die GFP-Expression in Neugeborenen Gyrus dentatus Neuronen ähnlich Abbildung 1 gemeinsam. Beachten Sie, dass neugeborene Neuronen einfach visualisiert werden und sowohl Dendriten und Axone sind robust bezeichnet. Expression in dünne DGC Axonen und kleine Stacheln, hängt von der Qualität und der Titer des Virus, der Promotor verwendet und die Länge der in-vivo-Expression. In unseren Händen, sind neugeborene Zellen und subzellulären Organellen in der Regel innerhalb weniger Tage nach der Injektion sichtbar, und der Wirbelsäule Ausdruck kann von den frühesten Stadien der Entwicklung zurückgeführt werden. WLoch-Zell-Aufnahmen von neugeborenen Neuronen in verschiedenen Zeitstufen ermöglichen die Untersuchung einzigartig Neugeborenen Zelle Eigenschaften, zB Aktionspotentiale (Abbildung 2a), sowie den Prozess der synaptischen Integration in bestehende neuronale Schaltkreise während der Reifung (Abb. 2b). <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 2-Photonen-konfokale Abbildung von neugeborenen Neuronen in einer horizontalen Gyrus dentatus Abschnitt einer erwachsenen Maus. Grüne Zellen sind 21dpi (Tage nach der Injektion) GFP-exprimierenden Neugeborenen DGCs mit PUX-GFP Retrovirus bezeichnet. <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 a) Aktionspotential feuern Eigenschaften eines Neugeborenen DGC bei 21 dpi. B) repräsentativ evozierten exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) auf ein neugeborenes DGC bei 21 dpi erfasst.

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

Kontinuierliche Neurogenese im Hippocampus von erwachsenen Säugetieren Gehirn bietet eine einzigartige experimentelle Modellsystem, um die neuronale Entwicklung und Integration in das reife Gehirn zu studieren. Das Protokoll hier vorgestellten verbindet retroviralen Kennzeichnung und elektrophysiologische Methoden, um die Integration von Neugeborenen dentatus Granulat Neuronen im Gehirn von erwachsenen Mäusen untersucht werden. Um sicherzustellen, dass Ihre Experimente erfolgreich sind, empfehlen wir die folgenden während der kritischen Schritte des Verfahrens: Zur Vermeidung von unerwünschten Infektion und Entzündung, sollten alle Instrumente sterilisiert (durch Autoklavieren, jede Art von Sterilisator oder 70% Ethanol) vor dem Eingriff werden. Verwenden Sie sterile PBS auf die Spitze der Spritze Nadel vor der Injektion zu waschen. Für Virus Injektion, müssen die Tiere gut auf der stereotaktischen Vorrichtung montiert sein und die Quellen der unnötige Bewegung muss während der Injektion minimiert werden. Vergewissern Sie sich, der Kopf ist gut fixiert und fest, und passen Sie die Nase Position der Maus auf Stufe Bregma und Lambda vor Berechnung Injektion Koordinaten. Auszug Virus in die Spritze schnell um die Exposition gegenüber Raumtemperaturen zu minimieren - Retroviren sind besonders temperaturempfindlich. Inject Virus langsam in der empfohlenen Rate, um den Druck zu minimieren. Die Anwendung der empfohlenen flacher Spitze Spritze (vs. gemeinsamen abgeschrägte Spitze) wird dafür sorgen, eine gleichmäßig verteilte Gyrus dentatus Infektion Bereich. Vor der Zubereitung Scheiben, müssen Schneid-Lösung und Inkubation ACSF mit 95% O 2 -5% CO 2 für mindestens 30 Minuten eingeleitet werden, damit Sauerstoff in die Lösung zu sättigen. Die Tiere sollten schnell durchströmt werden und Gewebe in kaltem, mit Sauerstoff gesättigte Lösung für die besten schneiden die Qualität erhalten bleibt. Für die Aufnahme, erhöhen Sie die Reizstärke allmählich, bis es eine postsynaptische Antwort. Ort wechseln der Stimulationselektrode in der molekularen Schicht des Gyrus dentatus wie nötig. Zusammengefasst bietet der empfohlene Ansatz einen Weg, um verschiedene Eigenschaften und mögliche funktionelle Rolle von Erwachsenen geboren Neuronen während Early-Stage-Integration zu erforschen in aktive, reife Schaltung.

<ul><li> Cutting-Lösung (in mM): 110 Cholinchlorid, 2,5 KCl, 1,3 KH 2 PO 4, 25,0 NaHCO 3, 0,5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 Dextrose, 1,3 Natriumascorbat, 0,6 Natriumpyruvat, 5,0 Kynurensäure. </li><li> Künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF, in mM): 125.0 NaCl, 25,0 NaHCO 3, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1,3 KH 2 PO 4, 1,3 MgCl 2, 1,3 Natriumascorbat, 0,6 Natriumpyruvat, 10 Dextrose. </li><li> Interne Lösung für whole-cell patchclamp (in mm): 120 Kaliumgluconat, 15 KCl, 4 MgCl 2, 0,1 EGTA, 10,0 HEPES, 4 MgATP, 0,3 Na 3 GTP, 7 Phosphokreatin (pH 7,4, 300 mOsm). </li></ul>

die untersuchung der integration von adult-geboren neurons

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenese tritt bei erwachsenen Säugetieren Gehirn in der Sub-ventrikuläre Zone (SVZ) der lateralen Ventrikel und in der Sub-körnige Zone (SGZ) der hippocampalen des ganzen Lebens. Frühere Berichte haben gezeigt, dass adulte Neurogenese mit vielfältigen Störungen des Gehirns, einschließlich Epilepsie, Schizophrenie, Depression und Angst (1) verbunden ist. Die Entzifferung der Prozess der normalen und aberranten Erwachsene geboren Neuron Integration kann Licht auf die Genese dieser Erkrankungen Schuppen und informieren die Entwicklung neuer Therapien. SGZ adulte Neurogenese Spiegel embryonale und postnatale neuronale Entwicklung, einschließlich der Stufen des Schicksals Spezifikation, Migration, Integration synaptischer und Reifung. Allerdings tritt eine vollständige Integration über einen längeren, 6-Wochen-Frist. Initial synaptischen Eingang zum Erwachsenen-geboren SGZ dentatus Körnerzellen (DGCs) ist GABAergen, gefolgt von glutamatergen Eingang bei 14 Tagen (2). Die spezifischen Faktoren, die Schaltung Bildung von Erwachsenen geboren Neuronen im Gyrus dentatus zu regulieren sind derzeit nicht bekannt. Unser Labor verwendet eine replikationsdefizient retroviralen Vektor basierend auf dem Moloney Maus-Leukämie-Virus, fluoreszierende Proteine ​​und die Hypothese auf regulatorische Gene, um diese wuchernden Zellen zu liefern. Diese virale Technik bietet eine hohe Spezifität und Auflösung für die Analyse von Zell-Geburtsdatum, Geschlecht, Morphologie und Synaptogenese. Ein typisches Experiment oft beschäftigt zwei oder drei Viren mit einzigartigen Label, Transgen und Promotor-Elemente für die Single-Cell-Analyse eines gewünschten Entwicklungsprozess in vivo. Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode für die Analyse von funktionalen neugeborenen Neuronen Integration mit einem einzigen grünen (GFP) oder rot (dTomato) fluoreszierendes Protein Retrovirus-und Patch-Clamp-Elektrophysiologie.

Ein Weg, um die Integration von Neugeborenen dentatus Körnerzellen im erwachsenen Tieren Studie beschrieben wird. Diese Technik verwendet eine technisch Retrovirus zu neugeborenen Neuronen, durch elektrophysiologische Aufnahmen folgten, um in vivo funktionale Integration bestimmen Etikett.

Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons

Die Neurogenese erfolgt im Gehirn adulter Säugetiere in der subventrikulären Zone (SVZ) des Seitenventrikels und in der subgranulären Zone (SGZ) der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Untersuchung der funktionellen Integration erwachsen geborener dentater Granulumzellen vorzustellen. Dies wird zunächst durch eine stereotaktische Injektion von Retrovirus in den Gyrus dentatus erwachsener Mäuse erreicht, um die neu gebildeten dentaten Granulumzellen zu markieren. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mäuse zu bestimmten Zeitpunkten mit kalter Schneidelösung zu perfundieren und das Gehirn zu entnehmen.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, akute Gehirnschnitte mit einem Vibratom herzustellen. Der vierte Schritt des Verfahrens besteht darin, Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen an neugebildeten Dornengranuszellen durchzuführen und die molekulare Schicht akuter Gehirnschnitte zu stimulieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die funktionelle synaptische Integration neugebildeter Neuronen zeigen, indem evozierte postsynaptische Ströme an neugebildeten Dornengranuszellen aufgezeichnet und analysiert werden.Die Hauptvorteile dieser Technik sind die retrovirale Markierung neugebildeter Neuronen im erwachsenen Gehirn und die akute Schnittpräparation des Gehirns von erwachsenen Tieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der adulten Neurogenese zu beantworten, beispielsweise die funktionelle Rolle neugebildeter Neuronen im erwachsenen Gehirn. Bereiten Sie die Virusinjektion vor, indem Sie das Retrovirus für das grün fluoreszierende Protein GFP oder das rot fluoreszierende Protein D-Tomate aus dem Gefrierschrank entnehmen und auf Eis auftauen. Tauen Sie es auf.Pro Tier werden zwei Mikroliter Retrovirus in eine vier bis sechs Wochen alte weibliche Maus injiziert, nachdem diese anästhesiert wurde. Prüfen Sie die Anästhesie durch Zudrücken der Zehennase, befestigen Sie die Maus am stereotaktischen Rahmen, rasieren Sie das Haar am Kopf ab und wischen Sie die Haut mit 70 %igem Ethanol ab. Benutzen Sie ein Skalpell, um die Haut zu schneiden und den Schädel freizulegen.Stellen Sie die Nasenposition der Maus so ein, dass bgma und Lambda dieselbe horizontale Ebene einnehmen, indem Sie einen Zahnarztbohrer mit einem 0,6-Millimeter-Bohrer verwenden. Bohren Sie vier Löcher durch den Schädel an den hier gezeigten Koordinaten. Füllen Sie eine ein-Mikroliter-Hamilton-Flachspitzen-Spritze schnell mit dem aufgetauten Retrovirus. Platzieren Sie sie über einer der bei minus zwei Millimetern bgma erzeugten Öffnungen, um das Retrovirus in den Gyrus dentatus zu injizieren. Senken Sie die Spritze auf eine vertikale Tiefe von 2,5 Millimetern ab. Injizieren Sie 0,5 Mikroliter Retrovirus mit einer Geschwindigkeit von 0,25 Mikrolitern pro Minute, um einen Rückfluss der Flüssigkeit zu verhindern.Warten Sie zwei Minuten nach jeder Injektion, bevor Sie die Spritze langsam zurückziehen. Spülen Sie die äußere Oberfläche der Spritzenkanüle kurz mit steriler PBS und einem Applikator ab, um Blutrückstände zu entfernen. Verwenden Sie das gleiche Verfahren, um 0,5 Mikroliter Retrovirus in die anderen drei Injektionsstellen in ventralen Tiefen von entweder 2,5 oder 3,2 Millimetern zu injizieren.Schließen Sie die Wunde mit sterilem chirurgischem Nahtmaterial und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück, bis die neuen Neuronen das gewünschte Reifedatum erreicht haben. Bereiten Sie nach Ablauf von 21 Tagen das Schneiden des Maushirns vor, indem Sie die notwendigen Lösungen herstellen. Kühlen Sie die Schnittlösung auf Eis bei null bis vier Grad Celsius und begasen Sie sie mindestens 30 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid.Stellen Sie die künstliche zerebrospinale Flüssigkeit oder A CSF bei Raumtemperatur und sprühen Sie sie mindestens 30 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid an. Nach 30 Minuten auf Eis bereiten Sie die eisgekühlte, sauerstoffgesättigte Schnittlösung für die Herzperfusion vor. Nach der Anästhesie der Maus führen Sie die Herzperfusion durch.Entfernen Sie dann schnell das Gehirn und legen Sie es in eine Petrischale mit Schittlösung und einem Stück Filterpapier in der Petrischale. Schneiden Sie das Kleinhirn ab und führen Sie anschließend einen koronalen Schnitt ein bis zwei Millimeter vor den Injektionsstellen durch, um eine ebene Fläche zu erhalten. Zum Montieren für Super.Kleben Sie das Gehirn auf eine Vibram-Plattform. Befestigen Sie die Plattform in der Schneidkammer des Vibram, die mit oxygenierter Schnittlösung gefüllt ist. Senken Sie die Klinge ab und stellen Sie das Schneidefenster am Vibram ein.Beginnen Sie mit dem Schneiden des Gewebes. Schneiden Sie jeden Schnitt entlang der Mittellinie in zwei Hälften. Verwenden Sie eine Pipette mit großer Öffnung, um diese Schnitte in eine Inkubationskammer mit Raumtemperatur zu überführen.Temperatur: Eine mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchspülte Ringerlösung. Fortsetzen des Schneidens, bis das vordere Ende des Hippocampus sichtbar ist. Inkubieren Sie die Schnitte unter kontinuierlicher Begasung in einem Wasserbad bei 32 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten.Bringen Sie die Inkubationskammer für die Dauer der Aufzeichnung wieder auf die Randtemperatur. Die Schnitte sind nun bereit zur Aufzeichnung. Beginnen Sie damit, die Aufzeichnungskammer mit 32 bis 34 Grad Celsius warmer, mit Sauerstoff gesättigter A-CSF mit einer Geschwindigkeit von etwa zwei Millilitern pro Minute zu perfundieren.Verwenden Sie ein großes Bohrrohr, um eine Schnittprobe in die Ableitungskammer zu überführen. Platziere einen U-förmigen Platindraht mit Nylonfäden auf der Schnittprobe, um sie unter geringer Vergrößerung festzuhalten. Identifizieren Sie die molekulare Schicht des Gyrus dentatus. Danach senken Sie die Stimulations-Elektrode in die molekulare Schicht des Gyrus dentatus ab. Unter hoher Vergr&ouml;&szlig;erung identifizieren Sie die neugebildeten dentaten Granulazellen in der subgranul&auml;ren Zone oder granul&auml;ren Schicht anhand der Expression des gr&uuml;nen oder roten fluoreszierenden Proteins, das sie markiert.Orten Sie neue Neuronen, die GFP oder D-Tomato exprimieren, indem Sie zwischen DIC- und Fluoreszenzfiltern wechseln. Wählen Sie eine Zelle mit relativ heller Fluoreszenz und einem gesunden Zellkörper für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme aus. Führen Sie eine Glas-Mikropipette mit einer Spitzenwiderstand von drei bis sechs Megaohm, die mit der geeigneten intrazellulären Lösung gefüllt ist, in einen Mikropipettenhalter auf der Verstärkerkopfplatte unter dem Objektiv mit hoher Vergrößerung des Mikroskops ein.Senken Sie die Mikropipette mithilfe eines Mikromanipulators auf die ausgewählte Granularzelle des Gyrus dentatus ab und bilden Sie einen Ganzzell-Patch. Injizieren Sie eine Reihe von Strömen im Stromklampf-Modus und nehmen Sie die Feuereigenschaften des neuen Neurons auf. Geben Sie einzelne Pulse oder gepaarte Pulse elektrischer Reize über die Stimulations-Elektrode ab und registrieren Sie die hervorgerufenen postsynaptischen Ströme.Wenn keine postsynaptische Antwort auftritt, verschieben Sie die Stimulations-Elektrode an eine andere Position in der Molecularschicht und versuchen Sie, die postsynaptischen Ströme aufzuzeichnen, die von der neuen Stimulationsstelle ausgelöst werden. Nach Abschluss des Experiments verwenden Sie Clamp-Fit, um die Amplitude der ausgelösten postsynaptischen Antworten der neuen Neuronen zu messen. Diese Abbildung zeigt die GFP-Expression in neuen Neuronen im Gyrus dentatus einer erwachsenen Maus 21 Tage nach der Injektion von GFP-Retrovirus.Beachten Sie, dass die neu gebildeten Neuronen leicht sichtbar sind und sowohl die Dendriten als auch die Axone deutlich markiert sind. Die Dendriten sind die Fortsätze, die vom Soma in die molekulare Schicht des Gyrus dentatus reichen, und die Axone sind ebenfalls im Hilus und im Bereich CA3 sichtbar. Diese Abbildung zeigt Ganzzell-Aufzeichnungen in der Stromklampentechnik von einem neu gebildeten Dentatgranulumneuron 21 Tage nach der Injektion eines P-U-X-G-F-P-Retrovirus bei einer adulten Maus.Die obere Spur zeigt Aktionspotentiale, die durch Strominjektion ausgelöst wurden. Diese Abbildung zeigt postsynaptische Ströme, die in einem neugeborenen dentaten Granulumneuron 21 Tage nach der Virusinjektion hervorgerufen wurden. Durch Stimulation in der molekularen Schicht.Das Vorhandensein der postsynaptischen Antwort zeigt, dass das neu gebildete Neuron bereits in die bestehenden neuronalen Schaltkreise integriert ist und synaptische Eingaben von ENT unterschiedlicher Herkunft nach seiner Entwicklung erhält. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der adulten Neurogenese den Weg, um die funktionelle Integration neuer Neuronen im erwachsenen Gehirn zu untersuchen.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Adult-geboren Neuronen des Bulbus kann optogenetically gesteuert werden mit Channelrhodopsin2-exprimierenden lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach und chronischen Photostimulation mit einem implantierten Mini-LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

Quelle: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Live-Bildgebung mit anschließender Einzelzellverfolgung zur Überwachung der Zellbiologie und des Verlaufs der Abstammungslinie mehrerer neuronaler Populationen. J. Vis. Exp. (2017) Die Das Video zeigt den Prozess der Vorbereitung, Bildgebung und Verfolgung adulter neuronaler Stammzellen in Echtzeit, um zelluläres Verhalten, einschließlich Teilung und Differenzierung, zu untersuchen.

 Live-Bildgebung und Einzelzell-Tracking zur Überwachung der neuronalen Abstammung in adulten neuralen Stammzellen

Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen.

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

Dieser Videoartikel veranschaulicht ein umfassendes Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung aller Stadien der adulten Hippocampus-Neurogenese innerhalb desselben Gewebeabschnitts. Wir haben eine Methode entwickelt, um die Einschränkungen der indirekten multiplen Immunfluoreszenz zu überwinden, die entstehen, wenn geeignete Antikörper von verschiedenen Wirtsspezies nicht verfügbar sind.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Anspruchsvolle junge Neuronen im neuen Hirnregionen kann wichtige Erkenntnisse, wie die Umwelt neuronalen Schicksal und Reifung formt zu offenbaren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ernte Interneuron Vorstufen von bestimmten Gehirnregionen und verpflanzen sie entweder Homotopically oder heterotopically in das Gehirn des postnatalen Welpen.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Hier wird eine Methode zur Sequenzierung einzelner Kerne, die aus dem Gyrus dentatus der Maus isoliert wurden, vorgestellt, die die meisten Neuronen durch Fluoreszenz-aktivierte Kerne (FAN)-Sortierung ausschließt. Dieser Ansatz generiert qualitativ hochwertige Expressionsprofile und erleichtert die Untersuchung der meisten anderen Zelltypen, die in der Nische vertreten sind, einschließlich seltener Populationen wie neuraler Stammzellen.

Fluoreszenzaktivierte Kerne negative Sortierung von Neuronen kombiniert mit Einzelkern-RNA-Sequenzierung zur Untersuchung der neurogenen Hippocampus-Nische

Hier verwenden wir HD-MEA, um in die Computerdynamik großer neuronaler Ensembles einzutauchen, insbesondere in Hippocampus-, Riechkolbenschaltkreisen und menschlichen neuronalen Netzwerken. Die Erfassung der raumzeitlichen Aktivität in Kombination mit Computerwerkzeugen bietet Einblicke in die Komplexität neuronaler Ensembles. Die Methode verbessert das Verständnis der Gehirnfunktionen und identifiziert möglicherweise Biomarker und Behandlungen für neurologische Störungen.

Aufzeichnung und Analyse der multimodalen Dynamik großskaliger neuronaler Ensembles auf einem CMOS-integrierten Mikroelektrodenarray mit hoher Dichte

Moderne Neurowissenschaften müssen Unterschiede zwischen vielen Arten erforschen, einschließlich Labornagetiere und Menschen. Dennoch entstehen technische Schwierigkeiten, wenn großhirnige Säugetiere beteiligt sind. Dieser Ansatz adressiert die interartische Variation neuronaler Populationen bei sehr unterschiedlichen Säugetieren und liefert vergleichbare Ergebnisse, die zur Aufdeckung evolutionärer Muster kartiert werden können.

Ein vergleichender Ansatz für quantitative Zellzählungsstudien in sehr unterschiedlichen Säugetierhirnen

Lernen Sie die funktionelle Integration adult geborener Neuronen im Hippocampus zu untersuchen. Diese Methode kombiniert retrovirale Markierung mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten von Mäusen.

Die Untersuchung der Integration von Adult-geboren Neurons

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