Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen
April 16th, 2011
FRAP wurde verwendet, um die Mobilität von grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierter Proteine in kultivierten Zellen zu quantifizieren. Wir untersuchten die mobile / immobile Fraktionen der GFP durch die Analyse der Fluoreszenz-Recovery-Anteil nach Ausbleichen. In dieser Studie wurde FRAP am Rücken von Hippocampus-Neuronen durchgeführt.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Mobilität des verstärkten grünen Fluoreszenzproteins durch Messung des Frap des Proteins in einer interessierenden Region zu bestimmen. Dies wird durch die erste Durchtrennung des EGFP-Vektors in kultivierten Hippocampus-Neuronen von Ratten erreicht. Als nächstes wird die Fre-Aufnahme in einer interessierenden Wirbelsäule mit einem konfokalen Zeiss seven 10 Mikroskop durchgeführt.
Die Photobleaching-Rate kann dann mit der Software Image J und GraphPad Prism berechnet werden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Beweglichkeit von EGFP in einer Wirbelsäule aus einem kultivierten Hippocampus-Neuron durch konfokale Mikroskopie zeigen. Dieses Protokoll wurde von Chazen in Zusammenarbeit mit mir, Ronald Pet, sowie Ya, Wang Bahar Kisha und dem leitenden Autor der ursprünglichen Arbeit, Robert Ol, der im Oktober 2009 starb, entwickelt.
Wir widmen dieses Video seinem Andenken. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Proteindynamik zu beantworten, wie z. B. die Umsatzrate eines interessierenden Proteins in einer interessierenden Region. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Kultivierung embryonaler Hippocampus-Neuronen von Ratten am Tag 18 auf mit Poly de Lysin beschichteten Mattec 35-Millimeter-Glasbodenschalen an 16 bis 18 Tagen in vitro transfiktierten Neuronen unter Verwendung des Klon-Tech-Säugetier-Transfektionskits von Cal Foss, bevor Sie mit der Transfektion beginnen.
Bewahren Sie das Original-Nährmedium in einem sterilen 15-Milliliter-Röhrchen für die spätere Verwendung auf. Füllen Sie jede 35-Millimeter-Schale 30 Minuten vor der Transfektion mit 1,5 Millilitern des modifizierten Eagle-Mediums von DOL eco. Kombinieren Sie als nächstes 10 Mikrogramm P-E-G-F-P-N eine Plasma-DNA mit 12,4 Mikrolitern zweimoliger Kalziumlösung und erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit sterilem Wasser auf 100 Mikroliter.
Geben Sie die DNA-Mischung DROPWISE in 100 Mikroliter von zwei x Haufen gepufferter Kochsalzlösung. Vortexen des Puffers nach jedem Tropfen, der hinzugefügt wird. Nachdem Sie die endgültige Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen gelassen haben, fügen Sie die Puffer-DNA-Lösung zu den DMEM-inkubierten Neuronen hinzu.
Inkubieren Sie die Neuronen bei 37 Grad Celsius für ein bis eineinhalb Stunden. Nach der Inkubation das calciumphosphathaltige Medium aus den Kulturschalen entfernen und die Zellen mit DMEM waschen. Wiederholen Sie die DMEM-Wäsche insgesamt dreimal.
Tauschen Sie das DMEM-Medium gegen das Original-Kulturmedium aus, bevor Sie es in den Inkubator zurückgeben. Neuronen werden zwei bis vier Tage nach der Transfektion für das Frack-Experiment verwendet. Ersetzen Sie zunächst das Nährmedium in der 35-Millimeter-Glasbodenschale sofort durch die vorwärmbare Tyro-Lösung.
Für das Frack-Experiment kommt ein Zeiss LSM seven 10 Konfokalmikroskop zum Einsatz. Das Zeiss temp Modulsystem hält die Temperatur, die Luftfeuchtigkeit und den Kohlendioxidanteil des Arbeitssystems aufrecht. Stellen Sie sicher, dass der Kohlendioxidtank angeschlossen ist und dass die Wasserflasche, die zum Feuchtigkeitsausgleich verwendet wird, mit Wasser gefüllt ist.
Sobald das Mikroskop eingerichtet ist, finden Sie mit dem 100-fach-Objektiv einen transfizierten, reifen Dendriten. Wenn die transfizierten Zellen in der Schale spärlich sind, suchen Sie mit dem 40-fach-Objektiv nach einer gewünschten Zelle. Wechseln Sie dann zum 100-fach-Objektiv.
Verwenden Sie zum Aufnehmen von Bildern einen fünffachen optischen Zoom und eine Auflösung von 2 56 x 2 56 Pixeln. Zur Darstellung eines kurzen Dendritenstücks mit mehreren Stacheln. Verwenden Sie zum Aufnehmen von Bildern die Nenngeschwindigkeit neun, die 0,5 Sekunden dauert.
Um einen Scan abzuschließen, stellen Sie die Lochblende auf zwei Mikrometer ein, um eine starke Fluoreszenz zu erhalten. Versuchen Sie beim Aufnehmen von Bildern, eine geringe Lasertransmission zu verwenden, z. B. ein bis 5 %, um ein Photobleichen des gesamten Bildes zu vermeiden. Wählen Sie als Nächstes die Wirbelsäule aus, die für dieses Experiment relevant ist.
Pilzstacheln mit einem Durchmesser des Wirbelsäulenkopfes von etwa einem Mikrometer werden ausgewählt, um ein Wrap-Experiment durchzuführen. Nehmen Sie vor dem Bleichen fünf Kontrollbilder auf und bleichen Sie dann die Wirbelsäule des Interesses 10 Mal bei nominalen 100 %. Die Lasertransmission nimmt unmittelbar nach dem Bleichen eine Reihe von Bildern auf. Das Zeitintervall sollte entsprechend den verschiedenen Zielproteinen und den unterschiedlichen Versuchsdesigns angepasst werden.
Für dieses Experiment werden nach dem Bleaching 15 Sekunden lang jede Sekunde Bilder aufgenommen. Speichern Sie als Nächstes die Bilder, um die Daten zu analysieren. Offene Bilder mit der Image J-Software Richten Sie den Bildstapel mit dem Ausrichtungswerkzeug so aus, dass der interessierende Rücken nicht schwebt und in der gleichen Position bleibt.
Messen Sie auf dem Bild die relative Fluoreszenzintensität der interessierenden Wirbelsäule, bei der es sich um einen transfizierten, aber ungebleichten Bereich handelt. Messen Sie den Hintergrundbereich in Zeitrafferbildern mit dem Intensitäts-Zeit-Monitor-Werkzeug von Bild J. Verwenden Sie einen nicht fluoreszierenden Bereich als Kurve für den Hintergrundbereich, um die Fluoreszenzintensität mit einer einphasigen Exponentialgleichung in der GraphPad Prism-Software oder einer ähnlichen Software anzupassen. Berechnen Sie abschließend den prozentualen Anteil der mobilen und immobilen Fluoreszenz. Gezeigt.
Hier sind die Frack-Messungen der EGFP-Fluoreszenz in einer Wirbelsäule eines kultivierten Hippocampus-Neurons. Der Bereich der Wirbelsäulensteuerung und des Hintergrunds sind markiert, und die rote Pfeilspitze zeigt den Zeitpunkt des Photo-Bleachings an. Die Fotos des gleichen Bereichs wurden vor und 0 1, 5, 10 und 15 Sekunden nach dem Photobleaching aufgenommen.
Die FRA-Kurven der EGFP-Fluoreszenz werden über einen Zeitraum von 15 Sekunden dargestellt, wobei die Punkte auf den Kurven die FRA in jeder Sekunde darstellen. Die Kurven wurden durch einphasige Exponentialgleichungen angepasst. Die durchschnittliche Fluoreszenz vor dem Photobleichen wurde mit 100 % gezähltIn diesem Experiment beträgt der mobile Anteil 87 % und der unbewegliche Anteil 13 % A.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mobilität von A GFP-markierten Proteinen mit Hilfe der FRAPPE-Technik messen können.
Überblick
Diese Studie verwendet Fluoreszenz-Recovery nach Photobleaching (FRAP), um die Mobilität von verbessertem grün fluoreszierenden Protein (EGFP) in hippokampalen Neuronen zu beurteilen. Durch die Analyse des Fluoreszenz-Recovery-Prozentsatzes werden die mobilen und immobilen Anteile von EGFP quantifiziert und liefern Einblicke in die Proteindynamik innerhalb neuronaler Dornen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- FRAP ist eine Technik zur Untersuchung der Dynamik von Proteinen in lebenden Zellen.
- EGFP ist ein weit verbreiteter fluoreszierender Marker zur Verfolgung der Proteinbewegung.
- Die Studie konzentriert sich auf hippocampale Neuronen, die für Lernen und Gedächtnis entscheidend sind.
- Das Verständnis der Proteinmobilität kann Aufschluss über die synaptische Funktion und Plastizität geben.
Zweck der Studie
- Um die Mobilität von EGFP-markierten Proteinen in neuronalen Dornen zu messen.
- Um die mobilen und immobilen Anteile des Proteins zu bestimmen.
- Um zum Verständnis der Proteindynamik in neuronalen Umgebungen beizutragen.
Verwendete Methoden
- Zellkultur embryonaler rattischer hippocampaler Neuronen.
- Transfektion von Neuronen mit EGFP mittels Calciumphosphat-Methode.
- FRAP durchgeführt mit einem Zeiss LSM 710 Konfokalmikroskop.
- Datenanalyse durchgeführt mit Image J und GraphPad Prism Software.
Hauptergebnisse
- Der mobile Anteil von EGFP im Dorn wurde mit 87% gefunden.
- Der immobile Anteil wurde mit 13% bestimmt.
- Fluoreszenz-Recovery-Kurven wurden mit einphasigen exponentiellen Gleichungen angepasst.
- Die Ergebnisse liefern Einblicke in die Dynamik des Proteinumsatzes in neuronalen Dornen.
Schlussfolgerungen
- FRAP ist eine effektive Methode zur Untersuchung der Proteinmobilität in lebenden Neuronen.
- Die Ergebnisse erweitern unser Verständnis der Proteindynamik in der synaptischen Funktion.
- Diese Forschung kann zukünftige Studien zu Proteinwechselwirkungen und synaptischer Plastizität beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of protein mobility in neuronal subcompartments is critical for de-risking early CNS target validation and understanding synaptic protein turnover. FRAP-based measurement of EGFP-tagged protein dynamics in dendritic spines provides predictive confidence for mechanistic studies and informs translational continuity in neurobiology-focused pipelines. This capability supports portfolio decisions by clarifying protein trafficking and turnover in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of protein mobility and turnover in live neuronal systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing mobile and immobile protein fractions in synaptic compartments.
- Provides functional readouts for target engagement and pathway interrogation in CNS models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and analysis workflows for reproducible quantification of protein dynamics.
- Facilitates assay standardization through defined imaging parameters and quantitative recovery metrics.
- Enables downstream screening of modulators affecting protein trafficking or stability in neurons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neuronal models for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of synaptic targets.
- Provides quantitative endpoints for risk-adjusted advancement of CNS-targeted assets.
Pipeline & Workflow Integration
FRAP-based protein mobility analysis integrates into the discovery-to-preclinical continuum for CNS drug development, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development.
- Discovery Biology: Quantifies protein turnover and trafficking, informing target validation and pathway mapping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides mobile/immobile fraction data and recovery kinetics for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings in cultured neurons to preclinical models of synaptic dysfunction.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable workflow for protein mobility studies across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by quantifying protein dynamics in live neurons.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis protocols for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying mechanistic underpinnings of synaptic protein turnover.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on quantitative mobility metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to high-resolution confocal imaging platforms and robust analytical software (e.g., ImageJ, GraphPad).
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptation to other neuronal or non-neuronal systems may require protocol optimization.
- Photobleaching and imaging conditions must be carefully controlled to ensure data reliability.
