Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die in vivo Entwicklung einzelner Vorderhirn- und neuraler Vorläuferzellen durch Zeitraffer-Live-Bildgebung von Zebrafischembryonen zu beobachten. Dies wird durch die Elektroporation von DNA-Konstrukten erreicht, die für fluoreszierende Marker kodieren, die spärlich positionierte neurale Vorläuferzellen des Gehirns markieren. Elektroporierte Embryonen werden anästhesiert, in einem Aros mit niedrigem Schmelzpunkt montiert und mit konfokaler Zeitraffermikroskopie abgebildet.

Die Ergebnisse zeigen die in vivo Entwicklung einer bestimmten neuralen Vorläuferzelle des Vorderhirns. Diese Methode kann einen Einblick in die InVivo-Entwicklung von neuroprogenen Zellen geben. Es kann auch auf andere Regionen des Zentralnervensystems wie Membran, Hein und Rückenmark angewendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie z. B. der DNA- oder RNA-Injektion im Einzelzellstadium, besteht darin, dass sie zu einem bestimmten Entwicklungszeitpunkt genau auf das Eigeninteresse abzielt. Dieses Protokoll beginnt am Tag vor der geplanten Elektroporation. Sammeln Sie morgens 50 befruchtete Embryonen von verpaarten Zebrafischen, baden Sie die Embryonen in einem embryonalen Medium, das Phenyl Threa oder PTU enthält, inkubieren Sie die getauchten Embryonen am nächsten Tag 22 Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius.

22 Stunden nach der Befruchtung sind die Embryonen bereit für die Elektroporation. Beginnen Sie damit, die Embryonen manuell mit einer feinen Pinzette zu beschichten. Übertragen Sie die beschichteten Embryonen in 10 Milliliter Elektroporationsringerlösung, die PTU enthält, und betäuben Sie dann die Embryonen.

Bei 420 Mikrolitern Trica Bestand in einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter zur Lösung. Die Embryonen sind nun bereit für die Elektroporation, um die für die Elektroporation notwendigen Injektionsnadeln vorzubereiten. Glaskapillaren werden gezogen und ihre Spitzen mit einer Pinzette gebrochen, um einen scharfen Schmelzpunkt von 0,2 zu erreichen.

Es werden auch Agro-Lösungen benötigt, die eine 1%ige Lösung enthalten, die in Elektroporationsringen suspendiert ist, und eine 0,8%ige Lösung in embryonalem Medium zum Einbetten. Aliquotieren Sie die beiden verschiedenen Agro-Lösungen in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie sie in einem Wärmeblock bei etwa 37 Grad Celsius bereit. Dieses Protokoll verwendet das GAL-Vier-UAS-System, um die Genexpression in neuralen Vorläuferzellen zu steuern.

Zwei Plasmide werden verwendet, wenn GAL vier ff ubiquitär exprimiert und das andere GFP als Reaktion auf GAL vier ff exprimiert. Beide Plasmide werden durch Kits hergestellt, um das Präparat zu verwenden, konzentrieren Sie sie auf ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter unter Verwendung einer Natriumacetat-Ethanol-Fällung in einer Lösung von 10 Millimolar Tri cl. Nach Bestimmung der Plasmidkonzentration verdünnen Sie beide Plasmide in einer einzigen Lösung mit nukleasefreiem Wasser auf 500 Nanogramm pro Mikroliter.

Bei dieser Konzentration werden sie zusammen bewertet, um die Abgabe der Lösung zu visualisieren, und sie bei 10 % des Gesamtvolumens der Lösung mit Phenolrot färben. Die Lösung ist nun bereit für die Elektroporation und sollte auf Eis gelegt werden. Der Elektroporations-Rig besteht aus einem Stereo-Dissektionsmikroskop mit einer maximalen Vergrößerung von 50-fach.

Das Rig ist mit einem Luftdruckinjektor, zwei Mikrom-Manipulatoren und einem elektrischen Stimulator ausgestattet. Die Elektrode am linken Mikromanipulator verfügt über kundenspezifische Platin-Iridium-parallele bipolare Elektroden, unmittelbar vor der Elektroporation laden Sie die Injektionsnadel mit zwei Mikrolitern DNA-Lösung zurück und stellen Sie das Injektionsvolumen auf vier Nanoliter ein. Von diesem Zeitpunkt an erfordert das Protokoll Übung, um das Montieren, Eintauchen und sofortige Entfernen von zwei Embryonen aus der Agro-Lösung mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 1 % zu perfektionieren.

Übertragen Sie mit einer Glaspipette jedes in sein eigenes Tröpfchen Agros auf der Plattform oder Schale in das Tröpfchen. Verwenden Sie eine Fasersonde, um die Embryonen vorsichtig in eine dorsale Position nach oben zu bringen, bevor sich der Agro verfestigt. Dadurch wird das Vorderhirn sowohl für die Elektroden als auch für die Mikroinjektionsnadel zugänglich.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 10 Tröpfchen mit allen vorbereiteten Embryonen geladen sind. Führen Sie die Elektroden in die Aeros ein und führen Sie die Mikroinjektionsnadel in die Vorderhirnkammer ein. Injizieren Sie nun vier Nanoliter DNA-Mix.

Achten Sie auf den Fluss und achten Sie auf die Schwellung des Ventrikels. Sobald die Schwellung beobachtet wird, werden zwei Impulse mit einer Dauer von je einer Millisekunde von 4 27 0,5 Volt angelegt. Diese vier Impulse müssen in entgegengesetzter Polarität abgegeben werden.

Das Ergebnis ist eine bilaterale Mosaikmarkierung der vier neuralen Vorläuferzellen des Gehirns. Entfernen Sie nun die Injektionsnadel aus dem Vorderhirn und verschieben Sie das Stadium zum nächsten Embryo. Wiederholen Sie den Injektions- und Elektroporationsvorgang an jedem verbleibenden Embryo.

Sobald alle 10 Embryonen elektroporiert wurden, gießen Sie fünf Milliliter embryonales Medium über die Embryonen, um die Embryonen zu übertragen. Schälen Sie die Aros mit einem mikrochirurgischen Messer und geben Sie sie in eine frische Schüssel mit 30 Millilitern embryonalem Medium. Vor der Bildgebung werden die Embryonen etwa vier Stunden lang bei 28,5 Grad Celsius inkubiert, vier Stunden nach der Elektroporation.

Das EGFP-Signal ist beobachtbar. Wenn sie unter einem Epi-Fluoreszenz-Präpariermikroskop in einer weiteren Stunde oder fünf Stunden nach der Elektroporation betrachtet werden, wählen Sie die Embryonen mit stark mosaikartiger, aber starker EGFP-Expression in der Region der vier Gehirne aus. Übertragen Sie die ausgewählten Embryonen auf 10 Milliliter Medium und betäuben Sie sie mit einer Zugabe von 420 Mikrolitern Trica-Stamm in einer Konzentration von vier Milligramm pro Milliliter.

Die Bildgebung erfolgt auf dem temperaturgesteuerten Tisch eines konfokalen Mikroskops, das mit aufrechten Objektiven ausgestattet ist. Bereiten Sie das Zielfernrohr vor, indem Sie die Temperatur des Tisches auf 28,5 Grad Celsius einstellen. Embryonales Medium ebenfalls auf 28,5 Grad Celsius vorheizen.

Um einen Embryo zu bestücken, tauchen Sie ihn mit einer Glaspipette kurz in Aros und platzieren Sie ihn in der Mitte einer 35 Millimeter großen Kulturschale mit Glasboden. Richten Sie die Embryonen mit einer Fasersonde vorsichtig in eine dorsale Position nach oben, bevor sich der Agro verfestigt, und bedecken Sie sie mit drei Millilitern vorgewärmtem Medium. Der Embryo ist nun bereit für die Live-Bildgebung im Zeitraffer mit einem Wassertauchobjektiv, hier gezeigt, sind konfokale Zeitrafferbilder einer neuralen Vorläuferzelle.

Mit dieser Methode können wir beobachten, wie diese Zelle zwischen 28,5 und 41,5 Stunden nach der Befruchtung wandert und sich zweimal teilt. Durch die Minimierung der Laserleistung und die Auffüllung des Embryos können Medienbilder bis zu 60 Stunden nach der Befruchtung aufgenommen werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Elektroporation an genetisch markierten und videoneuroprogenen Zellen durchführt und wie man mit den Elektrodenembryonen umgeht.

Für die konfokale Bildgebung auf Zeitrafferebene kann diese Elektroporation nach dem Master in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.