Name: Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Finger-Stick-Methode zur Analyse übungsinduzierter Lymphozyten-Apoptose. Diese Technik ermöglicht präzise Immunzellmessungen für Sportwissenschaft und Immunologie.

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Diese Arbeit wurde von einem New Faculty Grant von der Fakultät Scholarship Council an der Western Kentucky University unterstützt.

1. Finger-Stick Blutprobenentnahme <ol><li> Sammlung von Vollblut ist in der Regel in Ruhe für eine Baseline-Messung (in der Regel folgende 10-15 min sitzen Rest), während oder unmittelbar nach einer Trainingseinheit, und während der post-Ausübungsfrist genommen (in der Regel 1-3 Stunden nach Beendigung der Übung). </li><li> Mit Universal-Vorsichtsmaßnahmen, zuerst zu sterilisieren der Fingerspitze mit 70% igem Alkohol. </li><li> Als nächstes Punktion der Website mit Hilfe eines automatisierten Lanzette oder einem ähnlichen Gerät. Obwohl wir eine 30-Gauge-Lanzette nach Thema Komfort nutzen, könnte eine größere Nadel verwendet werden. </li><li> Wischen Sie den ersten Tropfen Blut, und dann sammeln Blut in Kapillaren oder microvettes mit Lithium-Heparin behandelt Gerinnen zu verhindern. </li></ol> 2. Zell-Phänotypisierung und Apoptose-Färbung <ol><li> Fügen Sie 10 ul heparinisiertem Vollblut titriert Antikörper-Panel in 250 ul Bindungspuffer (siehe Tabelle 1 schematisch). Wir haben eine 1:20 Verdünnung Faktor mit Erfolg eingesetzt, aber jedes Labor sollte ihren Reagenzien titre die besten funktionierende Lösung zu bestimmen. Tabelle 1. Antikörper-Panel zur Bestimmung der Ausübung-induzierten Apoptose in Leukozyten Teilmengen. Frühe Apoptose wurde durch die Expression von Annexin V definiert, während späte Apoptose durch doppelte positive Markierung mit Annexin V und 7-AAD definiert wurde. Nekrotischen Zellen wurden Annexin V-und 7-AAD + Zellen nur. <table border="1"><tbody><tr><td> Tube 1 </td><td> Tube 2 </td><td> Rohr 3 </td><td> Tube 4 </td></tr><tr><td> Zellen nur Rohr </td><td> Annexin V - FITC </td><td> Annexin V - FITC </td><td> Annexin V - FITC </td></tr><tr><td></td><td> Anti menschlichen CD4 - PE </td><td> Anti menschliche CD8 - PE </td><td> Anti menschliche CD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td></tr><tr><td></td><td> Anti Menschliche CD45RA - APC </td><td> Anti Menschliche CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7-AAD = 7-Amino-Actinomycin D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper T-Lymphozyten, CD8 = Suppressor / zytotoxischen T-Lymphozyten, CD19 = B-Lymphozyten, CD45RA = naiv Zellpopulationen, FITC = Fluoresceinisothiocyanat, PE = Phycoerythrin. </li><li> Bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 Minuten. </li><li> Zentrifuge bei 1075 xg für 5-10 Minuten. </li><li> Dekantieren, zusätzlich 300 ul Red Blood Cell Lysis Buffer, und gründlich vortexen. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten. </li><li> Geben Sie 300 ul PBS zu RBC Lyse Reaktion zu stoppen. </li><li> Zentrifuge bei 1075 xg für 5-10 Minuten. </li><li> Dekantieren, Rack, und 50 ul Bindungspuffer. </li><li> Analysieren mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> Es wird empfohlen, auf ein Minimum, die folgenden Steuerelemente verwendet werden: a-Zellen nur Röhre als negative Kontrolle bei der Erkennung Hintergrund Autofluoreszenz dienen, und Röhrchen mit jedem einzelnen Fluorochrom auf Entschädigung während der ersten bis der Durchflusszytometer gesetzt. Darüber hinaus haben wir Schadensersatz Standard Perlen erfolgreich zum Aufbau unserer Experimente verwendet.

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

Ein minimal-invasive Probennahme und der nachfolgenden Analyse wird für die Analyse der frühen und späten Phasen der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose nachgewiesen. Es ist auch möglich, eindeutig ausschließt diejenigen Zellen, die nekrotisch, und nicht apoptotischer sind. Dieses Verfahren überwindet die Nachteile und Unannehmlichkeiten mit invasive Blutentnahme aus der Ellenbeuge Region zu mehreren Zeitpunkten vor assoziiert, während und unmittelbar nach dem Training oder der Sicherung eines Katheters für die Dauer ...

<table><tbody><tr><td>Puffer für die Durchflusszytometrie-Bindung</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Lanzettvorrichtung</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapillarröhrchen</td><td>heparinisierte Kapillarröhrchen</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC konjugiert</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE konjugiert</td><td>Anti-human, Klon RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE konjugiert</td><td>Anti-human, Klon OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE konjugiert</td><td>Anti-human, Klon HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Vitalitätsfärbereagenz</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC konjugiert</td><td>Anti-human, Klon HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

finger-stick blutprobenentnahme methodik zur bestimmung der Übung-induzierte lymphozyten apoptose

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Übung ist ein physiologischer Reiz der Lage, die Apoptose in Immunzellen. Bis heute haben verschiedene Einschränkungen bei der Messung dieses Phänomens identifiziert worden, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung des Zelltods. Aus diesem Grund ist es schwierig zu entscheiden, ob gemeldete Anstieg der Immun-Zell-Apoptose, um die tatsächlichen Auswirkungen von Bewegung auf das System kann dazu beigetragen werden, oder sind ein Spiegelbild der Zeit und Verarbeitung notwendig, schließlich erhalten diese Messung. In diesem Artikel zeigen wir eine schnelle und minimal-invasives Verfahren zur Analyse der durch körperliche Belastung ausgelöste Lymphozyten Apoptose. Im Gegensatz zu anderen Techniken wird Vollblut mit einem Antikörper-Panel sofort nach Erhalt einer Probe zugegeben. Nach der Inkubationszeit werden die roten Blutzellen lysiert und die Proben sind bereit, analysiert werden. Die Verwendung eines Finger-Stick Stichprobenverfahren reduziert das Volumen des Blutes benötigt, und minimiert das Unbehagen an Themen.

Übung ist in der Lage die Apoptose in Immunzellen. Es gibt verschiedene Mess-Beschränkungen, insbesondere in Bezug auf die benötigte Zeit zu isolieren und zu behandeln, eine Blutprobe vor der Bewertung. Nachgewiesene ist eine schnelle und minimal-invasives Verfahren für die Analyse von belastungsinduzierten Lymphozyten Apoptose.

Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose

Sport ist ein physiologischer Stimulus, der in der Lage ist, Apoptose in Immunzellen zu induzieren. Bisher wurden verschiedene Einschränkungen bei der Messung ...

Hallo, ich bin James Volta vom Exercise Science-Programm der Abteilung für Kinesiologie, Freizeit und Sport an der Western Kentucky University. Wir werden Ihnen den von uns entwickelten und angewandten Versuchsablauf zur Messung der Apoptose von Lymphozyten nach körperlicher Belastung vorstellen. Schauen wir uns das genauer an.Eine Blutprobe aus dem Finger wird unter Anwendung allgemeiner Vorsichtsmaßnahmen durch einen Fingerstich entnommen. Die Fingerspitze wird desinfiziert und anschließend punktiert. Der erste Blutstropfen wird abgewischt, danach wird das Blut in Kapillarröhrchen oder Mikrogefäße aufgenommen.10 Mikroliter Vollblut wurden in ein Antikörperfeld pipettiert, das für die Durchflusszytometrie geeignete Fluorochrome enthält, darunter Annexin V, Seven Aminoactin D, entweder CD4, CD8 oder CD19 sowie CD45ra. Zusätzlich wurde eine Kontrollprobe mit Zellen allein verwendet. Als Kontrolle zur Einstellung unserer Experimente haben wir Kompensationsperlen eingesetzt. Die Probe wird gründlich durch Vortexen gemischt und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation werden die Proben 10 Minuten lang zentrifugiert und danach in einer einzige

finger-stick-blood-sampling-methodology-for-determination-exercise

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Dieses Video zeigt die Verwendung des ELISpot-Assays zur Beurteilung der Funktion von Antikörper-sezernierenden B-Zellen, ASCs. Die von den ASCs sezernierten Antikörper interagieren mit den membrangebundenen polyklonalen Antikörperfragmenten, die von den enzymkonjugierten IgG- oder IgM-Antikörpern nachgewiesen werden. Der farbige Fleck, der in jeder Vertiefung produziert wird, zeigt das Vorhandensein des Isotyps des spezifischen Antikörpers an, der mit der sekretorischen Aktivität der B-Zellen...

Funktionelle Bewertung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen mittels ELISpot-Assay

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Stimulation von Lymphozyten über nicht-typisierbare Haemophilus influenzae (NTHi) und zur Beurteilung der Immunantwort. Die Inkubation isolierter mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) mit NTHi bewirkt, dass die Bakterienzellen T-Lymphozyten stimulieren, was zur Zytokinproduktion führt. Nach Hemmung der Sekretion von Zytokinen wird eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die akkumulierten intrazellulären Zytokine in stimulierten...

Eine In-vitro-Technik zur Stimulation von Lymphozyten über pathogene Bakterien

Der Zweck dieses Videos ist es, die modifizierte Bergström-Skelettmuskelbiopsietechnik an menschlichen Probanden zu präsentieren.

Menschlichen Skelettmuskelbiopsie Verfahren unter Verwendung der modifizierten Technik Bergström

Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Messung der Phagozytose von Monozyten und Granulozyten und der oxidativen Burst-Aktivität in menschlichen Blutproben vorzustellen.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Diese Arbeit beschreibt einen fortgeschrittenen Arbeitsablauf zur genauen und schnellen Bestimmung der NK-Zellzahl (Natural Killer) und der Zytotoxizität von NK-Zellen in menschlichen Blutproben.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Die Erforschung des Stoffwechsels wird für die immunologische Forschung immer relevanter. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in Maus-Splenozyten sowie T- und B-Lymphozyten vor.

Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um mehrere Blutproben aus der Antecubital Vene während hochintensivem Intervalltraining zu erhalten. Dieses Protokoll kann nützlich sein für die Messung von Blut Metaboliten und endokrine Marker während der Übung.

Auswertung der Blut-Laktat und Plasma-Insulin im hoch-intensives Training von Antecubital Vene Katheterisierung

Um den Einfluss der Trainingsintensität auf physiologischen und biologischen Reaktionen zu beurteilen, wurden zwei verschiedene Übung Prüfprotokolle eingesetzt. Methoden skizziert Übung auf einem Fahrradergometer als inkrementelle maximale Sauerstoff-Verbrauch-Test und Ausdauer testen, Steady-State submaximalen Härtetest werden beschrieben.

Durchführung von Tests zur Messung der physiologischer und biologischen Reaktionen auf akute Übung beim Menschen Submaximalen und maximalen Ausdauerbelastungen

Erfahren Sie eine schnelle Finger-Stick-Methode zur Analyse übungsinduzierter Lymphozyten-Apoptose. Diese Technik ermöglicht präzise Immunzellmessungen für Sportwissenschaft und Immunologie.

Finger-Stick Blutprobenentnahme Methodik zur Bestimmung der Übung-induzierte Lymphozyten Apoptose

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