Name: Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Fluoreszenzmikroskopie den mitochondrialen Transport in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume visualisieren. Diese Methode nutzt lentivirale Expression und einen kostengünstigen Inkubator.

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Wir möchten Donald Hutson für den Beitrag seines technischen Know-how und viel Geschick bei der Konstruktion und Herstellung von der Bühne-Top-Inkubator danken. Wir sind auch dankbar, dass Ayda Dashtaei für ihre hervorragende technische Unterstützung. Alle Arbeiten wurden von Neurosciences Research Foundation unterstützt.

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Der Einsatz Lentivirus-vermittelte Expression eines fluoreszierenden Proteins gezielt an die Mitochondrien in infizierten kultivierten Neuronen und eine preiswerte Labor Baustufe-Top-Inkubator, der Bildgebung an lebenden Zellen für längere Laufzeiten ermöglicht, haben wir in der Lage, die Verbindung zwischen mitochondrialen Bewegung und neuromodulatorischen Signale zu untersuchen wie Serotonin (5-HT), Dopamin (DA) und Acetylcholin (ACh). Unsere Studien haben dazu beigetragen, einen Signalweg, der zum ersten Mal, Links mitochondrialen Menschenhandel zu Veränderungen in der Aktivität von Neuronen moduliert durch Neurotransmitter wie 5-HT-und DA-Aufklärung -, dass im Herzen der neuronalen Funktion. Wir finden, dass die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen gezielt die Beobachtung der markierten Mitochondrien in lebenden kultivierten Neuronen über lange Zeiträume, die mehr physiologisch relevanter als die viel kürzere Laufzeiten möglich sind, mit vitalen Farbstoffe können zulässt. Darüber hinaus ermöglicht die Intensität der fluoreszierenden Proteins Signal uns zu halten Belichtungszeiten kurz während der Bildaufnahme, minimiert die Möglichkeit von Ausbleichen oder Phototoxizität. Schließlich ermöglicht eine einfache und kostengünstige Stufe-Top-Inkubator, der Umgebungstemperatur, Luftfeuchtigkeit und CO 2-Gehalt führt, bei gleichzeitiger Minimierung der Verdunstung von Medien, uns zu mitochondrialen Bewegung in lebenden Nervenzellen über Stunden oder sogar Tage zu folgen. Forscher, die auf einer Bühne-Top-Inkubator für die Langzeit-Beobachtungen von Mitochondrien Herstellung in lebenden Neuronen wollen, müssen sich nicht an die genauen Einzelheiten unserer Design, vorausgesetzt, die Eigenschaften der verwendeten Materialien (z. B. Gas-durchlässige Membran zur Verdampfung von Medien zu vermeiden ) und Grundsätze angewandt (zB Temperatur und Luftfeuchtigkeit, Pufferung des pH-Wertes, die Aufrechterhaltung der Osmolarität) sind in der Regel im Einklang mit dem, was in diesem Protokoll beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><th> Menge </th><th> Beschreibung (und Lokalisierung in Abbildung 1) </th></tr><tr><td> 1 </td><td> Gewebekultur-Inkubator (H) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Hitzebeständigem Kunststoff-Gehäuse (Delrin oder vergleichbare) (A) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kunststoff-Rahmen für 35mm GBM Deckel (für die Anbringung Membran Petrischale) (M) </td></tr><tr><td> 1-2 </td><td> linear ft. Klare PFTE (Teflon) Membran-Material </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Messing Flügelschrauben </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Kleine 10kOhm Kühlkörper Widerstände (verwendet als Heizelemente im Inneren der Bühne-Top-Inkubator-Gehäuse) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Transformer (Versorgung mit 9V Strom Widerstände) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Terrarium Temperaturregler und Sonde (thermostatische Regulierung der Macht an Kühlkörper Widerstände über Trafo) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ml Erlenmeyerkolben (Schalldämpfer für Schwingungsdämpfung im Schlauch vor der Stufe-Top-Inkubator) (K) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8 &quot;Sorbothane Blatt (Dichtungsmaterial für die Basis der Stufe-Top-Inkubator) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Luftdichte ABS (oder vergleichbar) Kunststoff-Box (Gehäuse für Aquarium-Pumpe) (J) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Aquarium Pumpe (I) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kleine Computer-Lüfter </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Kunststoffgehäuse für Lüfter (L) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 9V Transformator für Computer-Lüfter </td></tr><tr><td> 20-30ft </td><td> Nalgene oder Silikonschlauch (Verbindungen zwischen Gewebekultur und Bühne-Top-Inkubatoren, Feuchtigkeit Fallen) (F, G, N) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Plastic Hähne (zum Öffnen und Schließen Luftstrom vor und nach der Phase-Top-Inkubator) (O) </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Barbed Messing Schlauchverbinder (für Schlauchverbindungen zu / von der Bühne-Top-Inkubator und Aquarium Pumpe Gehäuse) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Messing Schnellkupplungen (für Schlauchverbindungen zu / von der Bühne-Top-Inkubator) </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Messing Schnellkupplungen (für Schlauchverbindungen zu / von der Bühne-Top-Inkubator) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Stage-top-Inkubator Teilen: <table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7280-5MG </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35 mm Glasboden-Schalen </td><td> MatTek </td><td> P35GC-0-14-C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Life Technologies </td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Life Technologies </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Lipid-reichen BSA </td><td> Life Technologies </td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L-Asparagin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0380-100G </td></tr><tr><td> L-Prolin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8381-100G </td></tr><tr><td> Vitamin B-12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> V2876-100MG </td></tr><tr><td> 5-HT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9523-25mg </td></tr><tr><td> 8-OH-DPAT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8520-25mg </td></tr><tr><td> Dopamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8502-5G </td></tr><tr><td> Bromocriptin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2134-25mg </td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D047-100MG </td></tr></tbody></table>

neuromodulation und mitochondriale transport: live imaging in hippocampus-neuronen über lange zeiträume

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Um zu verstehen, die Beziehung zwischen mitochondrialen Transport und neuronale Funktion, ist es entscheidend, mitochondriale Verhalten in lebenden kultivierten Neuronen für längere Laufzeiten 1-3 beobachten. Dies ist nun durch den Einsatz von vitaler Farbstoffe und fluoreszierende Proteine, mit denen Zytoskelett-Komponenten, Organellen und anderen Strukturen in lebenden Zellen markiert und dann visualisiert werden können durch dynamische Fluoreszenz-Mikroskopie möglich. Zum Beispiel, in embryonalen Huhn sympathischen Neuronen wurde mitochondrialen Bewegung charakterisiert die vitalen Farbstoff Rhodamin 123 4. In einer anderen Studie wurden Mitochondrien visualisiert in Rattenvorderhirn Neuronen durch Transfektion von mitochondrial gezielte EYFP 5. Jedoch stellt Bildgebung von primären Neuronen über Minuten, Stunden oder sogar Tage eine Reihe von Fragen. An erster Stelle sind: 1) Pflege der Kultur, wie Temperatur, Feuchtigkeit und pH-Wert während langer Imaging-Sitzungen, 2) eine starke, stabile Fluoreszenz-Signal, um sowohl die Qualität der aufgenommenen Bilder und genaue Messung der Signalintensität während der Bildanalyse zu gewährleisten; und 3) die Begrenzung der Exposition Mal während der Bildaufnahme zu minimieren Bleichen und zur Vermeidung von Phototoxizität. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Beobachtung, Visualisierung und Analyse der mitochondrialen Bewegung in kultivierten Hippocampus-Neuronen mit hoher zeitlicher Auflösung und unter optimalen Lebens unterstützen Bedingungen erlaubt. Wir haben eine erschwingliche Bühne-Top-Inkubator, dass eine gute Temperaturregelung und atmosphärischen Gasstrom bietet gebaut, und schränkt auch den Grad der Medien Verdunstung, versicherte stabilen pH-Wert und Osmolarität. Dieser Inkubator ist über Ein-und Auslass-Schläuche, um eine Standard-Gewebekultur-Inkubator, der konstante Luftfeuchtigkeit und eine Atmosphäre von 5-10% CO 2 / Luft bietet. Diese Konstruktion bietet eine kostengünstige Alternative zu wesentlich teureren Mikroskop Inkubatoren, die nicht unbedingt versichern die Lebensfähigkeit der Zellen über viele Stunden oder sogar Tage. Zur Visualisierung Mitochondrien, infizieren wir Zellen mit einem Lentivirus kodierend für ein rot fluoreszierendes Protein, das an den Mitochondrien abzielt. Dies sichert eine starke und anhaltende Signal, das in Verbindung mit dem Einsatz eines stabilen Xenon-Lichtquelle, ermöglicht es uns, Belichtungszeiten während der Bildaufnahme zu begrenzen und alle, aber schließt Bleichen und Phototoxizität. Zwei Einspritzöffnungen am oberen Rand der Bühne-Top-Inkubator ermöglicht die akute Verabreichung von Neurotransmittern und anderen Reagenzien bestimmt zu modulieren mitochondrialen Bewegung. In der Summe Lentivirus-vermittelte Expression von einer Organelle gezielte rot fluoreszierendes Protein und die Kombination unserer Bühne-Top-Inkubator, eine konventionelle invertierten Fluoreszenzmikroskop, CCD-Kamera und Xenon-Lichtquelle ermöglichen es uns, Zeitraffer-Bilder der mitochondrialen Transport in erwerben lebenden Neuronen über lange Zeiträume als möglich in Studien den Einsatz konventioneller Vitalfarbstoffen und off-the-shelf lebenserhaltenden Systemen.

Wir beschreiben ein Protokoll, das Bildgebung von Mitochondrien ermöglicht in lebenden Nervenzellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie über einen längeren Zeitraum. Imaging über längere Zeiträume durch Lentivirus-vermittelte Expression von mitochondrial gezielte fluoreszierendes Protein und Verwendung eines kostengünstigen Bühne-Top-Inkubator, entworfen und gebaut wurde in unserem Labor durchgeführt.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

Um die Beziehung zwischen dem mitochondrialen Transport und der neuronalen Funktion zu verstehen, ist es entscheidend, das Verhalten von Mitochondrien in lebenden kultivierten ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den mitochondrialen Transport in kultivierten Neuronen über einen langen Zeitraum mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem Mitochondrien in kultivierten Neuronen zunächst mit einem organellenspezifischen fluoreszierenden Protein markiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Bilder des mitochondrialen Transports unter Kontrollbedingungen aufzunehmen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zeitrafferaufnahmen der mitochondrialen Transportvorgänge nach akuter Gabe von Neuromodulatoren wie Serotonin aufzuzeichnen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Analyse der aufgezeichneten Zeitrafferaufnahmen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Neurotransmitter den mitochondrialen Transport modulieren.Derartige Ergebnisse werden nur durch die langdauernde Abbildung fluoreszenzmarkierter Mitochondrien in Neuronen erzielt. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der Markierung mit Vitalfarbstoffen oder der transienten Transfektion mit GFP besteht darin, dass langfristige Beobachtungen des mitochondrialen Transports in gesunden, kultivierten Neuronen möglich werden. Chen, ein assoziierter Mitarbeiter aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren, um eine stabil beheizte und befeuchtete Umgebung bereitzustellen.Der Inkubator mit Deckelplatte ist über einen geschlossenen Kreislauf mit einem standardmäßigen Zellkulturinkubator verbunden. Ein A-P-F-T-E-Membrandeckel für 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden ermöglicht den Gasaustausch zwischen der neuronalen Kultur und der Umgebung innerhalb des Inkubators. Zusammen mit weiteren Eigenschaften ermöglicht dies die Langzeitbeobachtung kultivierter Neuronen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Überführen Sie die Kulturschale mit kultivierten hippocampalen Neuronen, die das Mito-Turbo-Red-Protein exprimieren, in eine Zellkulturbank.Ersetzen Sie den Kunststoffdeckel durch den PFTE-Membran-Deckel und bringen Sie die Kulturschale zum Mikroskop. Befestigen Sie die Basis des Inkubators am Mikroskopständer und setzen Sie vorsichtig die mit der Membran bedeckte Kulturschale auf. Richten Sie im vertieften Öffnungsbereich das Inkubatorgehäuse an den Stahlstiften der Inkubatorbasis aus und senken Sie das Gehäuse auf die Basis ab.Ziehen Sie die Daumenschrauben fest, bis eine gute Abdichtung zwischen Gehäuse und Basis erreicht ist. Schalten Sie vor dem Öffnen der Bildgebungssoftware den Filterrad-Controller des Mikroskops, die Lichtquelle und die CCD-Kamera ein. In diesem Protokoll wird für die Bildaufnahme das Objektträgerbuch fünf verwendet.Wechseln Sie zu einem 63x-Ölimmersionsobjektiv und senken Sie das Objektivrevolver ab. Tragen Sie vorsichtig Immersionsöl auf die Oberfläche des Objektivs auf. Klicken Sie auf das Fokus-Fenster-Symbol in der Symbolleiste und schalten Sie die Hellfeldlampe ein, indem Sie den Lampenregler bewegen.Um die Lichtintensität einzustellen, fokussieren Sie mithilfe der Okulare auf ein Zellfeld und wählen Sie eine Zelle von Interesse aus. Wählen Sie unter der Registerkarte „Scope“ mithilfe der Okulare den XI-drei-Filter aus, finden Sie die Fokusebene für die Mitochondrien in den Zellen, die mit dem Mito-Turbo-Red-Protein markiert wurden, und wechseln Sie dann zur CCD-Kamera. Klicken Sie auf das Symbol zur Aufnahme von Bildern in der Symbolleiste, beginnend mit einer anfänglichen Belichtungszeit von 100 Millisekunden.Finden Sie die optimale Belichtung, indem Sie im Erfassungsfenster die Schaltflächen Test und Bestes finden verwenden. Aktivieren Sie unter dem Feld Aufnahmetyp die Option Zeitraffer und wählen Sie im Bereich Zeitraffer-Aufnahmeoptionen das gewünschte Bildintervall und die Dauer der Aufnahmesitzung aus.Starten Sie die zeitraffende Bildaufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche „Start“ in der unteren rechten Ecke des Aufnahmefensters klicken. Nach der Erfassung einer Kontrollaufnahme geben Sie Neurotransmitter oder andere Reagenzien über die Injektionsöffnungen an der Oberseite des Inkubators auf dem Mikroskoptisch zu. Nach Zugabe des Serotoninrezeptoragonisten 8-OH-DPAT setzt sich die zuvor ruhende Mitochondrie, die durch den Pfeil markiert ist, entlang des Axons des hippokampalen Neurons in Bewegung.Die mittlere Geschwindigkeit und Gerichtetheit einzelner Mitochondrien wird vor der Zugabe von Serotonin zusammengefasst. Der Großteil der Mitochondrien ist stationär; nach der Zugabe von Serotonin zeigen jedoch 42 % der Mitochondrien nun eine gerichtete Bewegung und legen größere Strecken zurück als jene, die in Abwesenheit von Serotonin eine gerichtete Bewegung zeigen. Umgekehrt sind nach der Zugabe von Dopamin am Ende der letzten 15 Minuten einer Bildaufnahmesitzung im Anschluss an dieses Verfahren 92 % der Mitochondrien stationär.Andere Methoden zur Überwachung mehrerer Signale können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Zum Beispiel, wie die Kalziumaktivität und der mitochondriale Transport in Neuronen miteinander zusammenhängen.

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