Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den mitochondrialen Transport in kultivierten Neuronen über einen langen Zeitraum mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem Mitochondrien in kultivierten Neuronen zunächst mit einem organellenspezifischen fluoreszierenden Protein markiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Bilder des mitochondrialen Transports unter Kontrollbedingungen aufzunehmen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Zeitrafferaufnahmen der mitochondrialen Transportvorgänge nach akuter Gabe von Neuromodulatoren wie Serotonin aufzuzeichnen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Analyse der aufgezeichneten Zeitrafferaufnahmen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Neurotransmitter den mitochondrialen Transport modulieren.

Derartige Ergebnisse werden nur durch die langdauernde Abbildung fluoreszenzmarkierter Mitochondrien in Neuronen erzielt. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der Markierung mit Vitalfarbstoffen oder der transienten Transfektion mit GFP besteht darin, dass langfristige Beobachtungen des mitochondrialen Transports in gesunden, kultivierten Neuronen möglich werden. Chen, ein assoziierter Mitarbeiter aus meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren, um eine stabil beheizte und befeuchtete Umgebung bereitzustellen.

Der Inkubator mit Deckelplatte ist über einen geschlossenen Kreislauf mit einem standardmäßigen Zellkulturinkubator verbunden. Ein A-P-F-T-E-Membrandeckel für 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden ermöglicht den Gasaustausch zwischen der neuronalen Kultur und der Umgebung innerhalb des Inkubators. Zusammen mit weiteren Eigenschaften ermöglicht dies die Langzeitbeobachtung kultivierter Neuronen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Überführen Sie die Kulturschale mit kultivierten hippocampalen Neuronen, die das Mito-Turbo-Red-Protein exprimieren, in eine Zellkulturbank.

Ersetzen Sie den Kunststoffdeckel durch den PFTE-Membran-Deckel und bringen Sie die Kulturschale zum Mikroskop. Befestigen Sie die Basis des Inkubators am Mikroskopständer und setzen Sie vorsichtig die mit der Membran bedeckte Kulturschale auf. Richten Sie im vertieften Öffnungsbereich das Inkubatorgehäuse an den Stahlstiften der Inkubatorbasis aus und senken Sie das Gehäuse auf die Basis ab.

Ziehen Sie die Daumenschrauben fest, bis eine gute Abdichtung zwischen Gehäuse und Basis erreicht ist. Schalten Sie vor dem Öffnen der Bildgebungssoftware den Filterrad-Controller des Mikroskops, die Lichtquelle und die CCD-Kamera ein. In diesem Protokoll wird für die Bildaufnahme das Objektträgerbuch fünf verwendet.

Wechseln Sie zu einem 63x-Ölimmersionsobjektiv und senken Sie das Objektivrevolver ab. Tragen Sie vorsichtig Immersionsöl auf die Oberfläche des Objektivs auf. Klicken Sie auf das Fokus-Fenster-Symbol in der Symbolleiste und schalten Sie die Hellfeldlampe ein, indem Sie den Lampenregler bewegen.

Um die Lichtintensität einzustellen, fokussieren Sie mithilfe der Okulare auf ein Zellfeld und wählen Sie eine Zelle von Interesse aus. Wählen Sie unter der Registerkarte „Scope“ mithilfe der Okulare den XI-drei-Filter aus, finden Sie die Fokusebene für die Mitochondrien in den Zellen, die mit dem Mito-Turbo-Red-Protein markiert wurden, und wechseln Sie dann zur CCD-Kamera. Klicken Sie auf das Symbol zur Aufnahme von Bildern in der Symbolleiste, beginnend mit einer anfänglichen Belichtungszeit von 100 Millisekunden.

Finden Sie die optimale Belichtung, indem Sie im Erfassungsfenster die Schaltflächen Test und Bestes finden verwenden. Aktivieren Sie unter dem Feld Aufnahmetyp die Option Zeitraffer und wählen Sie im Bereich Zeitraffer-Aufnahmeoptionen das gewünschte Bildintervall und die Dauer der Aufnahmesitzung aus.

Starten Sie die zeitraffende Bildaufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche „Start“ in der unteren rechten Ecke des Aufnahmefensters klicken. Nach der Erfassung einer Kontrollaufnahme geben Sie Neurotransmitter oder andere Reagenzien über die Injektionsöffnungen an der Oberseite des Inkubators auf dem Mikroskoptisch zu. Nach Zugabe des Serotoninrezeptoragonisten 8-OH-DPAT setzt sich die zuvor ruhende Mitochondrie, die durch den Pfeil markiert ist, entlang des Axons des hippokampalen Neurons in Bewegung.

Die mittlere Geschwindigkeit und Gerichtetheit einzelner Mitochondrien wird vor der Zugabe von Serotonin zusammengefasst. Der Großteil der Mitochondrien ist stationär; nach der Zugabe von Serotonin zeigen jedoch 42 % der Mitochondrien nun eine gerichtete Bewegung und legen größere Strecken zurück als jene, die in Abwesenheit von Serotonin eine gerichtete Bewegung zeigen. Umgekehrt sind nach der Zugabe von Dopamin am Ende der letzten 15 Minuten einer Bildaufnahmesitzung im Anschluss an dieses Verfahren 92 % der Mitochondrien stationär.

Andere Methoden zur Überwachung mehrerer Signale können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Zum Beispiel, wie die Kalziumaktivität und der mitochondriale Transport in Neuronen miteinander zusammenhängen.