Name: Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Whole-Cell-Aufnahme von Pyramidenzellen in organotypischen Neocortex-Schnitten junger Ratten. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Untersuchungen nach genetischer Manipulation.

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Die Autoren bedanken sich bei Mayumi Sakuraba und Rebecca Foehring für hervorragende technische Unterstützung danken. Darüber hinaus möchten wir Drs danken. Rodrigo Andrade für die Unterstützung bei der Umsetzung der organotypischen Kultur und biolistischen Transfektion Protokolle und Dr. Jeanne Nerbonne für die Bereitstellung von cDNA-Konstrukte für die Transfektion. NS044163 aus NINDS (zu RCF): Diese Arbeit wurde vom NIH gefördert.

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<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
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<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
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<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neokortex (4, 9-11). Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, verwenden wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck (1,14,15,17-19). Wir verwenden eine organotypischen Kultur Vorbereitung (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Aus dem Ansatz der Stoppini et al (16) modifiziert, um Zellmorphologie und der laminaren Muster d...

Chirurgie / Transfektion / Kultur: <ol><li> Brain-Slicer: Campden Vibroslice # MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA </li><li> Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Enthält: Gene gun, Helium Schlauchleitung mit Regler, Schläuche prep Station (# 165-2418), Spritze Kit, Tefzel Schläuche, Rohrschneider, Optimierung Kit (# 165-2424), Rohrschneider </li><li> Bio-Rad Helium Regulator (# 165-2413) </li><li> Einweg-Lieferungen für Helios von Bio-Rad: <ul><li> 1,6 um Gold-Mikropartikel: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubator: Forma Scientific Modell # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766). </li></ol> Media: <ol><li> Pferd Serum: Hyclone Spender equine # SH 30074. (HyClone, 925 West-Süd 1800, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS und HEPES, ohne Glutamin: Lonza BioWhittaker Catalog # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 bis 6288, Option 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks Salzlösung, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 bis 6288, Option 1. </li><li> MEM (GIBCO minimal essential medium, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955 bis 6288, Option 1. </li><li> 250 mL Millipore 0,2 um-Filter: # SC6PU02RE </li><li> Plastic Transferpipetten: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore Steriflip 0,22 um Filter (# SCGP00525) </li></ol> Artikel 6-8 von Tieren, Fisher Scientific, 1241 Botschafter Blvd, PO Box 14989, St. Louis, MO 63132. Aufnahme: <ol><li> Pipet Glas: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 Oktober Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 horizontalen Elektrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instruments Multiclamp 700B Verstärker: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> PClamp 10 Daten Erfassungs-Software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136 </li><li> Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949: lectrode Position wird mit Sutter ROE-200 Manipulatoren und PC-200-Controller gesteuert. </li><li> Mikroskop: Olympus BX-50WI aufrechten Mikroskop mit IR-DIC-Optik </li><li> IR-empfindliche Kamera OLY-150 (Olympus) oder DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 Nord Roeske Avenue, New York City, IN 46360). </li></ol>

whole cell aufnahme von einem organotypischen vorbereitung der neocortex

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neocortex. Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, haben wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck übernommen. Wir verwenden ein organotypischen Kultur Vorbereitung (16), um Zellmorphologie und der laminaren Muster der Hirnrinde zu halten. Wir in der Regel zu isolieren akuten neokortikalen Scheiben an postnatalen Tag 8-10 und halten die Scheiben in der Kultur für 3-7 Tage. Dies erlaubt uns, Neuronen in einem ähnlichen Alter wie in unserer Arbeit mit akuter Scheiben Studie und minimiert die Entwicklung von üppigen exzitatorischen Verbindungen in die Scheibe. Wir erfassen von visuell identifizierten Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V mit Infrarot-Beleuchtung (IR-) und Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DIC) mit ganzen Zelle Patch-Clamp-in Strom-oder Spannungs-Klemme. Wir verwenden biolistischen (Gene gun) Transfektion von Wildtyp-oder mutierte Kaliumkanal DNA, um die Expression der Kanäle, um ihre Funktion zu untersuchen manipulieren. Die transfizierten Zellen werden leicht durch Epifluoreszenzmikroskopie nach Co-Transfektion mit cDNA für das grün fluoreszierende Protein (GFP) identifiziert. Wir vergleichen Aufnahmen von transfizierten Zellen zu benachbarten, nicht transfizierten Neuronen in der gleichen Schicht aus dem gleichen Stück.

Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Wir haben die Expression und die funktionellen Rollen spannungsgesteuerter Kaliumkanäle in Pyramidenneuronen aus dem Neokortex von Ratten untersucht. Aufgrund der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elektrische Ableitungen von parametralen Neuronen in organotypischen Schnitten des Neokortex zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst akute Schnitte von Ratten im postnatalen Alter von P8 bis P10 angefertigt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Bic-Transfektion von CD NA. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Kultivierung der Schnitte für drei bis sieben Tage.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, elektrische Ableitungen von transfizierten Zellen mittels Strom- oder Spannungs-Klammer zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Parametallzellen in organspezifischen Schnitten ähnliche Eigenschaften aufweisen wie solche aus akuten Schnitten desselben Alters. Die Transfektion von GFP verändert diese Eigenschaften nicht, wodurch die Untersuchung von Neuronen nach genetischen Modifikationen von Ionenkanälen durch Ganzzell-Strom- oder Spannungs-Klammerableitungen ermöglicht wird.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht – im Vergleich beispielsweise zu akuten Schnitten – darin, dass Zellen ausreichend lange in einer normalen Umgebung gehalten werden können, um Ionenkanäle genetisch zu modifizieren. Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ionenkanäle zu beantworten, wie beispielsweise die funktionellen Rollen spezifischer Ionenkanaltypen. Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube, die Vakuum-Flow-Haube, chirurgisches Zubehör und Lösungen gemäß dem begleitenden Manuskript vor. Tragen Sie Handschuhe für alle nachfolgenden Schritte, nachdem Sie das vorbereitete Aliquot der Schneidelösung von 250 Millilitern filtriert und 40 Milliliter davon in einen 50-Milliliter-Becher umgefüllt haben.Stellen Sie die Schneidkammer, die 40-Milliliter-Aliquoten und die restlichen 210 Milliliter der Schneidlösung unter dem laminaren Luftstromgehäuse bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank. Geben Sie 1,1 Milliliter Kulturmedium in drei diagonale Vertiefungen einer sechswelligen Platte. Wiederholen Sie dies für eine zweite Platte.Sechs-Loch-Platte. Stellen Sie die Sechs-Loch-Platten mindestens eine Stunde lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie anschließend sterile Scheren, um vier Transferpipetten zu kürzen, die zum Übertragen von Schnitten verwendet werden.Weitere drei Pipetten werden beibehalten, sobald die Lösungen zähflüssige Gemische geworden sind. Entnehmen Sie die 40 Milliliter-Aliquot der Schneidelösung aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie unter die Vakuumhaube. Begasen Sie sie mit 95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid.Entfernen Sie dann die 210 Milliliter Schneidelösung aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie unter die laminare Luftströmungshaube. Begasen Sie diese ebenfalls mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie anschließend das Waschmedium aus dem Kühlschrank und begasen Sie es unter der laminaren Luftströmungshaube mit 100 % Sauerstoff.Geben Sie zwei Milliliter Kulturmedium in eine Petrischale. Stellen Sie das verbleibende Kulturmedium zur späteren Mediumwechsel während der Woche gekühlt in den Kühlschrank, um die Gehirnschnitte vorzubereiten. Gießen Sie etwa 10 Milliliter kalte Schnittlösung aus dem 50-Milliliter-Becher unter dem Vakuumhauben in einen 25-Milliliter-Becher.Nach Anästhesie und Enthauptung entnehmen Sie das Gehirn einer postnatalen Ratte im Alter von acht bis zehn Tagen. Spülen Sie das Gehirn etwa 30 Sekunden lang im Becher mit 30 Milliliter kalter Schneidelösung. Überführen Sie das Gehirn anschließend vorsichtig in den 25-Milliliter-Becher.Wechseln Sie die Handschuhe und sättigen Sie die Handschuhe mit Ethanol. Tragen Sie dann das Gehirn in kalter Schneidelösung zur laminaren Flusswerkbank. Als nächster Schritt erfolgt die Orientierung und Blockierung des Gehirns, indem das Kleinhirn und die Frontalpole entfernt werden und ein teilweiser mittiger sagittaler Schnitt angelegt wird. Kleben Sie das präparierte Gehirn mit der Frontalkortex-Seite nach oben auf die Probehalterung.Führen Sie nach Bedarf zusätzliche Skalpell-Schnitte durch, um die Größe der Schnitte einzuschränken. Anschließend stellen Sie den Träger mit dem Gehirn in die sterilisierte Metallschneidekammer. Befestigen Sie diese am vibrierenden Gewebeschneider.Füllen Sie das Bad mit eiskalter, perlförmiger Schneidelösung. Gießen Sie 30 Milliliter der verbleibenden Schneidelösung in einen 50-Milliliter-Becher und perlen Sie mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durch. Dieser Becher dient zum Sammeln der Schnitte.Schneiden Sie 250&nbsp;Mikrometer dicke koronare Schnitte des frontoparietalen Kortex. Geben Sie mindestens sechs Schnitte in den 50&nbsp;Milliliter fassenden Becher mit Schneidelösung. Geben Sie anschließend etwa zwei Milliliter Waschmedium in eine 35&nbsp;Millimeter große Petrischale.Überführen Sie die Schnitte mit einer ausgeschnittenen Pipette aus der Schneidelösung in die Petrischale mit Waschmedium. Waschen Sie die Schnitte dreimal, wobei Sie jeweils frische Pipetten verwenden, um das Medium zuzugeben und die Abfalllösungen nach dem Waschen abzusaugen. Überführen Sie die Schnitte anschließend in die 35-Millimeter-Petrischale mit Kulturmedium. Entfernen Sie danach die Deckel der Verpackungen für die Netz-Einlegestücke, lassen Sie die Einlegestücke jedoch in den Verpackungen.Verwenden Sie dann eine Pinzette, um mithilfe einer ausgeschnittenen Transferpipette einen Mesh-Einsatz aus der Verpackung zu heben. Übertragen Sie eine Schnittstelle aus dem Kulturmedium auf das Netz. Bringen Sie die Schnittstelle mit einer intakten Transferpipette in der Mitte der Membran ein und positionieren Sie sie dort.Entfernen Sie überschüssiges Kulturmedium. Legen Sie nun den Netz-Einsatz mit seiner Schnittfläche in eine der flüssigkeitsgefüllten Vertiefungen der 6-Loch-Platte. Achten Sie darauf, die Bildung von Luftblasen unter dem Netz zu vermeiden, nachdem Sie je eine Schnittfläche in jede flüssigkeitsgefüllte Vertiefung gelegt haben.Stellen Sie beide 6-Loch-Platten zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie etwa eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. In der Zwischenzeit reinigen Sie den Arbeitsbereich unter der laminaren Luftabsaugung, um die Transfektion vorzubereiten. Als nächster Schritt wird das BioRad Helios Genkanone geladen, wobei die erste Position frei bleibt.Laden Sie eine Patrone mit CD-NA-beschichteten Geschossen in jede zweite Position des Patronenhalters der Genkanone. Anschließend setzen Sie den Patronenhalter in die Genkanone ein. Zunächst entleeren Sie die Waffe, indem Sie ein Geschoss ohne Projektil abfeuern.Danach den Lauf vorrücken, um eine Kartusche mit CDNA.Bullets zu erreichen. Entnehmen Sie die 6-Loch-Platten dem Inkubator und platzieren Sie sie unter der laminaren Flussabsaughaube; halten Sie die Waffe vertikal direkt über der 6-Loch-Platte und schießen Sie eine Scheibe bei 100 PSI. Danach den Lauf weiterdrehen und diesen erneut durch Abfeuern einer leeren Ladung reinigen. Beschleunigen Sie die verbleibenden Scheiben mit je einem Schuss pro Scheibe.Nach dem Einsetzen die Sechs-Well-Platten zurück in den Inkubator stellen und die Schnitte für zwei bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Medium alle zwei Tage wie folgt wechseln: Unter dem laminaren Flusswerkwerk neue Medien in die drei unbesetzten Vertiefungen geben. Danach die Sechs-Well-Platte wieder mindestens eine Stunde in den Inkubator stellen, nach einer Stunde die Platte zurück in den laminaren Flusswerkhelm bringen und mit mit Ethanol gereinigten gebogenen Pinzetten jeden Netz-Einleger mit seinem Schnitt in eine neue Vertiefung versetzen, das alte Medium absaugen und die Platte anschließend wieder in den Inkubator zurückstellen.Nach mehreren Tagen der Inkubation sind die Schnitte nun bereit für Ganzzell-Aufzeichnungen. Entnehmen Sie unter der laminarer Luftstrom-Werkbank eine sechswellige Platte aus dem Inkubator. Verwenden Sie mit Ethanol gereinigte gebogene Pinzette, um einen Netz-Einsatz und dessen Schnitt zu entfernen.Bringen Sie dann die sechswellige Platte wieder in den Inkubator. Überführen Sie anschließend die Petrischale mit dem Netz-Einsatz und dem Schnitt in den Aufnahmебereich und erzeugen Sie Spannung mithilfe einer Pinzette oder eines flexiblen Metallstücks. Falls erforderlich, schneiden Sie das Netz mithilfe eines Skalpells Nummer 11 rings um den Schnitt herum ab und führen Sie die endgültigen Schnitte mit der Schere zu Ende.Verwenden Sie dann Pinzette, um den Schnitt und das daran befestigte Netz in die Ableitungskammer zu überführen. Befüllen Sie den Schnitt auf dem Objektträger eines aufrechten Mikroskops unter IR-DIC-Optik mit kohlegasgesättigter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit. Visualisieren Sie die parametralen Neurone in den Schichten zwei, drei oder fünf unter Epifluoreszenz und dem FITC-Filter.Suchen Sie die grünen transfizierten Zellen unter IR-DIC-Mikroskopie. Achten Sie auf die cDNA-Partikel, die als kleine schwarze Punkte innerhalb der Zellen sichtbar sind. Wählen Sie eine transfizierte Zelle für die Ganzzellableitung aus.Als Nächstes führen Sie eine Mikroelektrode zu der ausgewählten Zelle und verwenden sanften Unterdruck, um eine Gigaohm-Dichtung zu erzielen. Anschließend wenden Sie zusätzlichen Unterdruck an, um in die Zelle einzudringen und die Ganzzell-Aufnahme zu erreichen. Die Zelle ist nun bereit für Strom- oder Spannungs-Klemmaufnahmen.Diese Abbildung zeigt ein fluoreszenzoptisches Bild von Zellen, die mit cDNA für GFP transfiziert wurden. Die folgenden Aufnahmen stammen von Zellen, die mit cDNA für GFP transfiziert wurden. Dargestellt ist ein Aktionspotential in einer parametakortikalen Zelle der Schicht drei als Reaktion auf eine über dem Schwellenwert liegende Strominjektion von 10 Millisekunden Dauer.Diese Abbildung zeigt wiederholtes Feuern eines parametalen Neurons der Schicht fünf als Reaktion auf eine zweisekündige Strominjektion von 400 Pikoa mpere. Diese Abbildung zeigt eine Spannungsclamp-Aufzeichnung von einem parametalen Neuron der Schicht fünf. Tetrodotoxin wurde verwendet, um den spannungsabhängigen Natriumstrom zu blockieren.Die Spuren stellen nach außen gerichtete Kaliumströme dar, die durch eine Serie von 500 Millisekunden langen Spannungsschritten von einem Haltepotential von minus 70 Millivolt hervorgerufen wurden. Einmal beherrscht, können die geringe Vorbereitung und die Transfektion inklusive Vorbereitungszeit in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens.Es ist wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten und die Dicke sowie die Abmessungen des Schnitts zu begrenzen, um Austrocknung zu verhindern. Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.Vielen Dank.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Dieses Video zeigt, wie eine feine Pipette in der Nähe von Hirnschnitten positioniert wird, um eine Versiegelung mit einer neuronalen Zelle zu bilden. Durch den Sog wird die Zellmembran aufgebrochen, wodurch eine Ganzzell-Patch-Klemme entsteht, die Strommessungen für elektrophysiologische Experimente ermöglicht.

Etablierung einer Ganzzell-Voltage-Clamp-Konfiguration für elektrophysiologische Aufzeichnungen in Hirnschnitten

Dieses Video beschreibt eine Methode zur gleichzeitigen Abbildung und Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von transgenen Gehirnschnitten, die neuronenspezifische fluoreszierende Proteine enthalten. Das Verfahren besteht darin, den Hirnschnitt in einer Perfusionskammer mit belüfteter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit zu halten, fluoreszenzmarkierte Zellen mit einer Lichtquelle anzuregen und die elektrischen Signale mit einer Mehrkanalsonde und einer Patch-Klemme aufzuzeichnen.

Gleichzeitige optische und elektrophysiologische Überwachung von neuronalen Zellen in Hirnschnitten

Pair-Aufzeichnungen sind simultane Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von zwei synaptisch verbundenen Neuronen, die eine präzise elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung der Synapsen zwischen einzelnen Neuronen ermöglichen. Hier beschreiben wir die detaillierte Methodik und die Anforderungen für die Etablierung dieser Technik in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen in jedem Labor, das für Elektrophysiologie ausgestattet ist.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Closed-Loop-Protokolle werden in der modernen Elektrophysiologie immer weiter verbreitet. Wir stellen eine einfache, vielseitige und kostengünstige Möglichkeit vor, komplexe elektrophysiologische Protokolle in kortikalen Pyramidenneuronen in vitro mit einem Desktop-Computer und einer digitalen Erfassungsplatine durchzuführen.

Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Erfahren Sie die Whole-Cell-Aufnahme von Pyramidenzellen in organotypischen Neocortex-Schnitten junger Ratten. Diese Methode ermöglicht elektrophysiologische Untersuchungen nach genetischer Manipulation.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

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