Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, elektrische Ableitungen von parametralen Neuronen in organotypischen Schnitten des Neokortex zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst akute Schnitte von Ratten im postnatalen Alter von P8 bis P10 angefertigt werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Bic-Transfektion von CD NA. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Kultivierung der Schnitte für drei bis sieben Tage.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, elektrische Ableitungen von transfizierten Zellen mittels Strom- oder Spannungs-Klammer zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Parametallzellen in organspezifischen Schnitten ähnliche Eigenschaften aufweisen wie solche aus akuten Schnitten desselben Alters. Die Transfektion von GFP verändert diese Eigenschaften nicht, wodurch die Untersuchung von Neuronen nach genetischen Modifikationen von Ionenkanälen durch Ganzzell-Strom- oder Spannungs-Klammerableitungen ermöglicht wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht – im Vergleich beispielsweise zu akuten Schnitten – darin, dass Zellen ausreichend lange in einer normalen Umgebung gehalten werden können, um Ionenkanäle genetisch zu modifizieren. Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ionenkanäle zu beantworten, wie beispielsweise die funktionellen Rollen spezifischer Ionenkanaltypen. Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube, die Vakuum-Flow-Haube, chirurgisches Zubehör und Lösungen gemäß dem begleitenden Manuskript vor. Tragen Sie Handschuhe für alle nachfolgenden Schritte, nachdem Sie das vorbereitete Aliquot der Schneidelösung von 250 Millilitern filtriert und 40 Milliliter davon in einen 50-Milliliter-Becher umgefüllt haben.

Stellen Sie die Schneidkammer, die 40-Milliliter-Aliquoten und die restlichen 210 Milliliter der Schneidlösung unter dem laminaren Luftstromgehäuse bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank. Geben Sie 1,1 Milliliter Kulturmedium in drei diagonale Vertiefungen einer sechswelligen Platte. Wiederholen Sie dies für eine zweite Platte.

Sechs-Loch-Platte. Stellen Sie die Sechs-Loch-Platten mindestens eine Stunde lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie anschließend sterile Scheren, um vier Transferpipetten zu kürzen, die zum Übertragen von Schnitten verwendet werden.

Weitere drei Pipetten werden beibehalten, sobald die Lösungen zähflüssige Gemische geworden sind. Entnehmen Sie die 40 Milliliter-Aliquot der Schneidelösung aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie unter die Vakuumhaube. Begasen Sie sie mit 95 % Sauerstoff, 5 % Kohlendioxid.

Entfernen Sie dann die 210 Milliliter Schneidelösung aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie unter die laminare Luftströmungshaube. Begasen Sie diese ebenfalls mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie anschließend das Waschmedium aus dem Kühlschrank und begasen Sie es unter der laminaren Luftströmungshaube mit 100 % Sauerstoff.

Geben Sie zwei Milliliter Kulturmedium in eine Petrischale. Stellen Sie das verbleibende Kulturmedium zur späteren Mediumwechsel während der Woche gekühlt in den Kühlschrank, um die Gehirnschnitte vorzubereiten. Gießen Sie etwa 10 Milliliter kalte Schnittlösung aus dem 50-Milliliter-Becher unter dem Vakuumhauben in einen 25-Milliliter-Becher.

Nach Anästhesie und Enthauptung entnehmen Sie das Gehirn einer postnatalen Ratte im Alter von acht bis zehn Tagen. Spülen Sie das Gehirn etwa 30 Sekunden lang im Becher mit 30 Milliliter kalter Schneidelösung. Überführen Sie das Gehirn anschließend vorsichtig in den 25-Milliliter-Becher.

Wechseln Sie die Handschuhe und sättigen Sie die Handschuhe mit Ethanol. Tragen Sie dann das Gehirn in kalter Schneidelösung zur laminaren Flusswerkbank. Als nächster Schritt erfolgt die Orientierung und Blockierung des Gehirns, indem das Kleinhirn und die Frontalpole entfernt werden und ein teilweiser mittiger sagittaler Schnitt angelegt wird. Kleben Sie das präparierte Gehirn mit der Frontalkortex-Seite nach oben auf die Probehalterung.

Führen Sie nach Bedarf zusätzliche Skalpell-Schnitte durch, um die Größe der Schnitte einzuschränken. Anschließend stellen Sie den Träger mit dem Gehirn in die sterilisierte Metallschneidekammer. Befestigen Sie diese am vibrierenden Gewebeschneider.

Füllen Sie das Bad mit eiskalter, perlförmiger Schneidelösung. Gießen Sie 30 Milliliter der verbleibenden Schneidelösung in einen 50-Milliliter-Becher und perlen Sie mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durch. Dieser Becher dient zum Sammeln der Schnitte.

Schneiden Sie 250 Mikrometer dicke koronare Schnitte des frontoparietalen Kortex. Geben Sie mindestens sechs Schnitte in den 50 Milliliter fassenden Becher mit Schneidelösung. Geben Sie anschließend etwa zwei Milliliter Waschmedium in eine 35 Millimeter große Petrischale.

Überführen Sie die Schnitte mit einer ausgeschnittenen Pipette aus der Schneidelösung in die Petrischale mit Waschmedium. Waschen Sie die Schnitte dreimal, wobei Sie jeweils frische Pipetten verwenden, um das Medium zuzugeben und die Abfalllösungen nach dem Waschen abzusaugen. Überführen Sie die Schnitte anschließend in die 35-Millimeter-Petrischale mit Kulturmedium. Entfernen Sie danach die Deckel der Verpackungen für die Netz-Einlegestücke, lassen Sie die Einlegestücke jedoch in den Verpackungen.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um mithilfe einer ausgeschnittenen Transferpipette einen Mesh-Einsatz aus der Verpackung zu heben. Übertragen Sie eine Schnittstelle aus dem Kulturmedium auf das Netz. Bringen Sie die Schnittstelle mit einer intakten Transferpipette in der Mitte der Membran ein und positionieren Sie sie dort.

Entfernen Sie überschüssiges Kulturmedium. Legen Sie nun den Netz-Einsatz mit seiner Schnittfläche in eine der flüssigkeitsgefüllten Vertiefungen der 6-Loch-Platte. Achten Sie darauf, die Bildung von Luftblasen unter dem Netz zu vermeiden, nachdem Sie je eine Schnittfläche in jede flüssigkeitsgefüllte Vertiefung gelegt haben.

Stellen Sie beide 6-Loch-Platten zurück in den Inkubator und inkubieren Sie sie etwa eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. In der Zwischenzeit reinigen Sie den Arbeitsbereich unter der laminaren Luftabsaugung, um die Transfektion vorzubereiten. Als nächster Schritt wird das BioRad Helios Genkanone geladen, wobei die erste Position frei bleibt.

Laden Sie eine Patrone mit CD-NA-beschichteten Geschossen in jede zweite Position des Patronenhalters der Genkanone. Anschließend setzen Sie den Patronenhalter in die Genkanone ein. Zunächst entleeren Sie die Waffe, indem Sie ein Geschoss ohne Projektil abfeuern.

Danach den Lauf vorrücken, um eine Kartusche mit CDNA.Bullets zu erreichen. Entnehmen Sie die 6-Loch-Platten dem Inkubator und platzieren Sie sie unter der laminaren Flussabsaughaube; halten Sie die Waffe vertikal direkt über der 6-Loch-Platte und schießen Sie eine Scheibe bei 100 PSI. Danach den Lauf weiterdrehen und diesen erneut durch Abfeuern einer leeren Ladung reinigen. Beschleunigen Sie die verbleibenden Scheiben mit je einem Schuss pro Scheibe.

Nach dem Einsetzen die Sechs-Well-Platten zurück in den Inkubator stellen und die Schnitte für zwei bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Medium alle zwei Tage wie folgt wechseln: Unter dem laminaren Flusswerkwerk neue Medien in die drei unbesetzten Vertiefungen geben. Danach die Sechs-Well-Platte wieder mindestens eine Stunde in den Inkubator stellen, nach einer Stunde die Platte zurück in den laminaren Flusswerkhelm bringen und mit mit Ethanol gereinigten gebogenen Pinzetten jeden Netz-Einleger mit seinem Schnitt in eine neue Vertiefung versetzen, das alte Medium absaugen und die Platte anschließend wieder in den Inkubator zurückstellen.

Nach mehreren Tagen der Inkubation sind die Schnitte nun bereit für Ganzzell-Aufzeichnungen. Entnehmen Sie unter der laminarer Luftstrom-Werkbank eine sechswellige Platte aus dem Inkubator. Verwenden Sie mit Ethanol gereinigte gebogene Pinzette, um einen Netz-Einsatz und dessen Schnitt zu entfernen.

Bringen Sie dann die sechswellige Platte wieder in den Inkubator. Überführen Sie anschließend die Petrischale mit dem Netz-Einsatz und dem Schnitt in den Aufnahmебereich und erzeugen Sie Spannung mithilfe einer Pinzette oder eines flexiblen Metallstücks. Falls erforderlich, schneiden Sie das Netz mithilfe eines Skalpells Nummer 11 rings um den Schnitt herum ab und führen Sie die endgültigen Schnitte mit der Schere zu Ende.

Verwenden Sie dann Pinzette, um den Schnitt und das daran befestigte Netz in die Ableitungskammer zu überführen. Befüllen Sie den Schnitt auf dem Objektträger eines aufrechten Mikroskops unter IR-DIC-Optik mit kohlegasgesättigter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit. Visualisieren Sie die parametralen Neurone in den Schichten zwei, drei oder fünf unter Epifluoreszenz und dem FITC-Filter.

Suchen Sie die grünen transfizierten Zellen unter IR-DIC-Mikroskopie. Achten Sie auf die cDNA-Partikel, die als kleine schwarze Punkte innerhalb der Zellen sichtbar sind. Wählen Sie eine transfizierte Zelle für die Ganzzellableitung aus.

Als Nächstes führen Sie eine Mikroelektrode zu der ausgewählten Zelle und verwenden sanften Unterdruck, um eine Gigaohm-Dichtung zu erzielen. Anschließend wenden Sie zusätzlichen Unterdruck an, um in die Zelle einzudringen und die Ganzzell-Aufnahme zu erreichen. Die Zelle ist nun bereit für Strom- oder Spannungs-Klemmaufnahmen.

Diese Abbildung zeigt ein fluoreszenzoptisches Bild von Zellen, die mit cDNA für GFP transfiziert wurden. Die folgenden Aufnahmen stammen von Zellen, die mit cDNA für GFP transfiziert wurden. Dargestellt ist ein Aktionspotential in einer parametakortikalen Zelle der Schicht drei als Reaktion auf eine über dem Schwellenwert liegende Strominjektion von 10 Millisekunden Dauer.

Diese Abbildung zeigt wiederholtes Feuern eines parametalen Neurons der Schicht fünf als Reaktion auf eine zweisekündige Strominjektion von 400 Pikoa mpere. Diese Abbildung zeigt eine Spannungsclamp-Aufzeichnung von einem parametalen Neuron der Schicht fünf. Tetrodotoxin wurde verwendet, um den spannungsabhängigen Natriumstrom zu blockieren.

Die Spuren stellen nach außen gerichtete Kaliumströme dar, die durch eine Serie von 500 Millisekunden langen Spannungsschritten von einem Haltepotential von minus 70 Millivolt hervorgerufen wurden. Einmal beherrscht, können die geringe Vorbereitung und die Transfektion inklusive Vorbereitungszeit in etwa zwei Stunden durchgeführt werden. Bei Durchführung dieses Verfahrens.

Es ist wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten und die Dicke sowie die Abmessungen des Schnitts zu begrenzen, um Austrocknung zu verhindern. Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

Vielen Dank.