Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine breite Palette an Keimzellen aus erwachsenen Maustestes gleichzeitig und in hoher Reinheit zu isolieren, um die dynamischen Vorgänge zu untersuchen, die während dieses einzigartigen Zellzyklus ablaufen. Dies wird erreicht, indem die Hodenzellen effizient durch eine Reihe enzymatischer Verdauungen mit Kollagenase und Trypsin in Gegenwart von DNA dissoziiert werden. Im zweiten Schritt erhält man eine Einzelzell-Suspension aus dem Hodengewebe.

Die trübe Suspension wird mit dem fluoreszierenden lebenden DNA-Farbstoff Hulk's 3 33 42 gefärbt, der es ermöglicht, verschiedene mitotische Zelltypen anhand ihres DNA-Gehalts und ihrer Dichte zu unterscheiden. Anschließend werden die mitotischen Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung analysiert, um alle erforderlichen Fraktionen für weitere Analysen wie zytogenetische oder Genexpressionsanalysen zu identifizieren und zu reinigen. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine effiziente Reinigung schwer zugänglicher mitotischer Zellpopulationen in hoher Reinheit zeigen, basierend auf umfassenden zytogenetischen und Expressionsarray-Studien.

Der Hauptvorteil dieses auf Fakten basierenden Protokolls gegenüber bestehenden Methoden wie Zentrifugation, Filtration oder Schwerkraftsedimentation besteht darin, dass es ermöglicht, die meiotischen Fraktionen in sehr hoher Reinheit in einem Schritt zu sammeln. Personen, die neu in dieser Methode sind, müssen sehr unterschiedliche Fähigkeiten kombinieren, um eine effiziente Gewebe-Dissociation und anschließende Inkubation durchzuführen, gefolgt von einer optimalen Zellsortierung, wobei gute Zusammenarbeit zwischen der Person, die die Zellen vorbereitet, und dem Bediener der Durchflusszytometrie sowie ein fundiertes Verständnis der Grundlagen dieses Protokolls für den Erfolg unerlässlich sind. Das Zell-Dissociationsprotokoll wird von Dr. I. Gatun, einem erfahrenen Postdoktoranden in unserem Labor, demonstriert, der dieses Protokoll erheblich verbessert hat.

BVN Tores. Unser Durchflusszytometrie-Operator führt Sie durch eine optimale Einrichtung für eine effiziente Zellsortierung. In diesem Protokoll wird die Dissoziation von zwei adulten Mäusetestes demonstriert; die Volumina können jedoch entsprechend für juvenile Tiere oder zusätzliche Testes angepasst werden.

Geben Sie zunächst drei Milliliter einer Augen-Balancesalzlösung, die 120 Einheiten pro Milliliter Kollagenase Typ I enthält, in das Röhrchen. Eine effiziente und vollständige Gewebe-Dissociation ist entscheidend für eine korrekte Färbung und erfolgreiche Zellseparation. Der Zusatz einer ausreichenden Menge an G-Einheit eins sowie die horizontale Positionierung des Röhrchens während der Schütteln ist sehr wichtig für eine effiziente Gewebe-Dissociation. Geben Sie ein verkapseltes Hodenorgan in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 10 µL DNA eins zum Hoden hinzu und schütteln Sie das Röhrchen kräftig von Hand, bis Sie sehen, dass sich die Hodentubuli zu lösen beginnen. Danach befestigen Sie das Röhrchen horizontal auf einem rotierenden Schüttler und schütteln es maximal 15 Minuten bei 120 U/min bei 33 °C. Nach 15 Minuten lassen Sie das Röhrchen eine Minute lang senkrecht bei Raumtemperatur stehen. Entsorgen Sie anschließend den Überstand mithilfe einer Einwegpipette. Geben Sie drei Milliliter einer mit Gaze balancierten Salzlösung, die Kollagenase Typ eins sowie 10 µL Dnase eins enthält, zur Probe hinzu.

Schütteln Sie das Röhrchen erneut mehrmals von Hand. Schütteln Sie das Röhrchen horizontal mit maximal 120 U/min für 15 Minuten bei 33 Grad Celsius, stellen Sie es anschließend eine Minute lang senkrecht bei Raumtemperatur zum Absetzen hin und verwerfen Sie danach den Überstand. Fügen Sie danach 2,5 Milliliter GBSS mit Kollagenase hinzu.

Geben Sie 50 µL Trypsin und 10 µL Dase zu. Invertieren Sie das Röhrchen mehrmals und agitieren Sie es horizontal mit maximal 120 U/min für 15 Minuten bei 33 °C. Nach der 15-minütigen Agitation pipettieren Sie die Probe vorsichtig mit einer Einweg-Plastikpipette mit großem Öffnungsdurchmesser drei Minuten lang mehrmals auf und ab.

Zu diesem Zeitpunkt sollten keine Klumpen sichtbar sein. Anschließend 30 Mikroliter Trypsin, 10 Mikroliter DNase I und 40 Mikroliter Hülks 3 33 42, in DMSO resuspendiert, hinzufügen. Das Röhrchen mehrmals umdrehen.

Schwenken Sie horizontal mit maximal 120 U/min für 15 Minuten bei 33 Grad Celsius. Wenn die Schüttelung der Probe abgeschlossen ist, geben Sie 400 Mikroliter fötales Kälberserum hinzu und mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen des Röhrchens, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Für die endgültige Färbung geben Sie 50 Mikroliter Hoax 3 33 42 und 10 Mikroliter DNAs hinzu.

Nochmals den Kolben horizontal mit maximal 120 U/min für 15 Minuten bei 33 Grad Celsius schütteln. Die dissoziierte Hodenprobe wird anschließend über zwei 40-Mikrometer-Filter, die zuvor mit GBSS befeuchtet wurden, in ein 50-Milliliter-Konischglas filtriert. Fügen Sie fünf Mikroliter Propidiumiodidlösung zur Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einer Einweg-Pasteurpipette.

Als Nächstes überführen Sie die Probe mithilfe einer 18-Gauge-Nadel in eine fünf Milliliter fassende Plastikspritze. Ersetzen Sie dann die 18-Gauge-Nadel durch eine 22-Gauge-Nadel für die Probenaufgabe. Bewahren Sie die Spritze schließlich auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht, bis die Probe zur Fax-Bearbeitung bereit ist.

Für dieses Experiment wird die Zellsortierung in einem Backin-Dixon-Bereich durchgeführt. Zwei, die Zellsortierbedingungen wurden aus den zuvor für einen Durchflusszytometer mit einem 360 Nanometer Ultraviolett-Argon-Laser und einem 488 Nanometer Argon-Laser verwendeten Bedingungen übernommen. Letztendlich muss die Einrichtung des Durchflusszytometers vom Zellsortierbediener optimiert werden.

Da der Becton Dixon Aria zwei U keinen UV-Laser besitzt, wird das Protokoll zur Detektion der Hawk-Färbung unter Verwendung eines violetten Lasers mit 405 Nanometer angepasst. Hooks wird durch den violetten Laser mit 405 Nanometer angeregt, und ein blauer Laser mit 488 Nanometer wird sowohl für die PI-Anregung als auch für die Detektion des vorwärts- und seitwärts gestreuten Lichts verwendet. Zusätzlich werden die Filter für die Hos-Detektion modifiziert, um eine gewisse Durchlässigkeit für rotes Laserlicht zu begrenzen, was zu einer verbesserten Schärfe der Streudiagramme führt.

Der Violettlaser ist mit einem Bandpass von 450/40 Nanometern für die Detektion blauer Emission und einem Bandpass von 585/42 Nanometern für die Detektion roter Emission konfiguriert. Ein Langpassfilter mit 502 Nanometern wird verwendet, um die blaue von der roten Fluoreszenz zu trennen. Der Unterschied bei der Verwendung zweier verschiedener Filter-Sets wird hier gezeigt.

Der 5 85 42 Nanometer-Filter ergibt kompaktere Zellpopulationen als der 6 30 30 Nanometer-Filter. Daher sollte der Bediener bereit sein, verschiedene Kombinationen an seinem eigenen Gerät auszuprobieren, um den besten Kompromiss zu erzielen. Eine 100-Mikron-Düse wird mit einer Tropfantriebsfrequenz von 28.000 Tropfen pro Sekunde verwendet.

Die Proben-Schwellwertfrequenz liegt bei etwa 4.000 Ereignissen pro Sekunde bei einer Flussrate zwischen eins und drei, um eine höhere Auflösung zu gewährleisten. Sortieren Sie die Probe in Aliquots von etwa 750 Mikrolitern, die aus der Spritze abgegeben werden. Während dieser Pausen bewahren Sie die verbleibende Probe in der Spritze auf Eis und lichtgeschützt auf. Sammeln Sie die sortierten Proben in 12 mal 75 Millimeter großen Glasborosilikat-Röhrchen, die 250 Mikroliter DMEM ergänzt mit 10 % FCS enthalten.

Um die Probe in Sammelröhrchen bei vier Grad Celsius zu halten, verwenden Sie die Temperaturregelung während der gesamten Sortierung. Zusätzlich sollten Sie die Probenaufwirbelung bei 200 U/min nutzen, um eine Sedimentation der Probe während der Sortierung zu verhindern. Jedes Mal, wenn eine Aliquotprobe der Hauptprobe hinzugefügt wird, ist es wichtig, die Sammelröhrchen ebenfalls vorsichtig anzustupsen, um die Integrität der gesammelten Zellen zu bewahren.

Hier sind repräsentative FACS-Profile dargestellt, bei denen alle wichtigen Schritte der meiotischen Teilung des Wildtyps in diesem Streudiagramm identifiziert wurden, wobei die sortierten Zellen gekennzeichnet sind. In den adulten Hoden ist eine große Menge an Zelltrümmern vorhanden, die hauptsächlich leere Membranen und Spermiengeißel enthalten. Ein repräsentatives Propidiumiodid-Diagramm zeigt eine sehr geringe Anzahl an propidiumiodidpositiven Zellen in der Probe. Der typische Gang wird in diesem repräsentativen Wildtyp-Hoax-3-33-42-FACS-Profil angezeigt.

Die verschiedenen mütischen Zellpopulationen, die mit dieser Methode für weitere Untersuchungen gereinigt werden können, sind angegeben als Spermatogonien, präleptotän, leptotän, Zellstadien der Synaptonämie, Pachytän, Diplotän und runde Spermatozyten. Diese letzten beiden Profilierungen stammen aus einem SPO11-defizienten Hoden und einem Wildtyp-Hoden von 13 Tage alten Mäusen. SPO11 ist die mütische Endonuklease, die Doppelstrangbrüche an den Stellen der mütischen Rekombinations-Hotspots veranlasst, und wie hier beobachtet, führt das Fehlen von SPO11 zu einem eindeutigen mütischen Versagen, da kein Stadium jenseits des frühen Pachytäns nachweisbar ist.

Im Gegensatz dazu zeigt das Profil eines 13 Tage alten männlichen Wildtyp-Mäuses eine hohe Konzentration an Leptin-Zygotenzellen. Diese erste Welle der Meiose ist deutlich asynchron, wie klar zu erkennen ist. Bei Verwendung dieser Methodik ist es wichtig, eine ausreichende Menge an DNA zu verwenden, während man dieses Experiment durchführt.

Die Stadt ist zentral für die problemlose Sortierung. Obwohl die Untersuchenden anfangs zögern, sie zu verwenden, verringert der Zusatz von DNA die Viskosität der Probe und verbessert die Zellseparation und -anfärbung, wobei intakte Zellen nicht beschädigt werden. Die FOX-Methode zur Isolation von intakten Zellen kann für eine breite Palette nachgeschalteter Anwendungen eingesetzt werden, wie beispielsweise die DNA-RNA-Extraktion zur Untersuchung der Dynamik der Genexpression oder die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Erstellung verschiedener epigenetischer Profilierungen.