Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine breite Palette von Mitenzellen aus adulten Hoden von Mäusen sofort und in hoher Reinheit zu reinigen, um die dynamischen Prozesse zu untersuchen, die während dieses einzigartigen Zellzyklus ablaufen. Dies wird durch eine effiziente Dissoziation von Hodenzellen mit einer Reihe von enzymatischen Verdauen mit Kollagenase und Trypsin in Gegenwart von DNA erreicht. Eine, um in einem zweiten Schritt eine einzellige Testsuspension zu erhalten.

Die Testsuspension ist mit dem fluoreszierenden Lebend-DNA-Farbstoff 3 33 42 des Hulk gefärbt, der es ermöglicht, verschiedene myotische Zelltypen anhand ihres DNA-Gehalts und ihrer Dichte zu unterscheiden. Anschließend werden miotische Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung analysiert, um alle notwendigen Fraktionen für weitere Analysen, wie z.B. zytogenetische oder Genexpressionsanalysen, zu identifizieren und zu reinigen. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine effiziente Aufreinigung von schwer zu bekommenden miotischen Zellpopulationen bei hoher Reinheit auf der Grundlage umfassender zytogenetischer und Expressionsarray-Studien zeigen.

Der Hauptvorteil dieses faktenbasierten Protokolls gegenüber bestehenden Methoden wie Zentrifugal-, Literations- oder Schwerkraftsedimentation besteht darin, dass es ermöglicht, bei einer möglichst miotischen Fraktion in sehr hoher Reinheit zu sammeln. Personen, die neu in dieser Methode sind, müssen sehr unterschiedliche Fähigkeiten kombinieren, um eine effiziente Testdissoziation und -haltung durchzuführen, gefolgt von einer optimalen Zellsortierung, guten Interaktionen zwischen der Person, die die Zellen vorbereitet, und dem Durchflusszytometrie-Bediener sowie ein gutes Verständnis der Grundlagen dieses Protokolls, das für den Erfolg unerlässlich ist. Das Protokoll der Zelldissoziation wird von Dr. I Gatun demonstriert, einem leitenden Postdoc in unserem Labor, der dieses Protokoll erheblich verbessert hat.

BVN Tores. Unser Durchflusszytometrie-Bediener führt Sie durch ein optimales Setup für eine effiziente Zellsortierung. In diesem Protokoll wird eine Dissoziation von zwei adulten Maushoden gezeigt, wobei die Volumina für Jungtiere oder für zusätzliche Hoden entsprechend angepasst werden können.

Beginnen Sie mit drei Millilitern blickausgeglichener Salzlösung, die 120 Einheiten Kollagenase Typ eins pro Milliliter enthält, in das Röhrchen Eine effiziente, schmackhafte Dissoziation ist entscheidend für die korrekte Färbung und Probleme bei der Neusortierung der Zellen. Die Zugabe von ausreichend G nase one sowie die Platzierung des Rohres in horizontaler Position während des Rührens, ist sehr wichtig für eine effiziente Dissoziation des Tests. Legen Sie einen eingekapselten Hoden in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie 10 Mikroliter DNA in den Hoden und schütteln Sie das Röhrchen kräftig mit der Hand, bis Sie sehen, dass der Hodentubuli zu dissoziieren beginnt. Platzieren Sie das Röhrchen waagerecht auf einem rotierenden Schüttler und rühren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 33 Grad Celsius nach 15 Minuten mit maximal 120 U/min um. Eine Minute lang bei Raumtemperatur vertikal dekantieren. Verwenden Sie dann eine Einwegpipette, um den Überstand zu entsorgen. Geben Sie der Probe drei Milliliter salzbalancierte Salzlösung, die Kollagenase Typ eins enthält, sowie 10 Mikroliter D nase eins.

Schütteln Sie die Tube wieder einige Male mit der Hand. Bewegen Sie das Rohr 15 Minuten lang bei 33 Grad Celsius horizontal bei maximal 120 U/min, wie zuvor, dekantieren Sie eine Minute lang vertikal bei Raumtemperatur und entsorgen Sie dann den Überstand. Fügen Sie als nächstes 2,5 Milliliter GBSS hinzu, das Kollagenase enthält.

Typ eins 50 Mikroliter Trypsin und 10 Mikroliter Dase. Man dreht das Rohr mehrmals um, rührt 15 Minuten lang bei 33 Grad Celsius mit maximal 120 U/min waagerecht. Verwenden Sie nach dem 15-minütigen Rühren eine Einwegpipette aus Kunststoff mit einer breiten Öffnung, um die Probe drei Minuten lang vorsichtig auf und ab zu pipettieren.

Zu diesem Zeitpunkt sollten keine Klumpen sichtbar sein. Fügen Sie dann 30 Mikroliter Trypsin, 10 Mikroliter DNA eins und 40 Mikroliter Hulks 3 33 42 hinzu, die in DMSO resuspendiert sind. Drehen Sie das Rohr mehrmals um.

Horizontal bei maximal 120 U/min für 15 Minuten bei 33 Grad Celsius rühren. Wenn das Rühren der Probe abgeschlossen ist, fügen Sie 400 Mikroliter fötales Kälberserum hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen, um das Trypsin zu inaktivieren. Um die endgültige Färbung durchzuführen, fügen Sie 50 Mikroliter Hoax 3 33 42 und 10 Mikroliter DNA hinzu.

Rühren Sie das Rohr erneut 15 Minuten lang bei 33 Grad Celsius horizontal mit maximal 120 U/min. Die dissoziierte Hodenprobe wird dann durch zwei 40-Mikron-Einwegfilter geleitet, die mit GBSS über ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen vorverheiratet sind. Geben Sie fünf Mikroliter Propidiumiodidlösung in die Probe und mischen Sie vorsichtig, indem Sie mehrmals mit einer Einweg-Pastenpipette pipettieren.

Übertragen Sie dann die Probe durch eine 18-Gauge-Nadel in eine Fünf-Milliliter-Kunststoffspritze. Ersetzen Sie dann die 18-Gauge-Nadel durch eine 22-Gauge-Nadel für die Probenabgabe. Bewahren Sie die Spritze abschließend auf Eis auf und schützen Sie sie vor Licht, bis die Probe für die Faxverarbeitung bereit ist.

Für dieses Experiment wird die Zellsortierung auf einem Backin-Dixon-Bereich durchgeführt. Zweitens wurden die Bedingungen für den Zellsortierer von denen angepasst, die zuvor für ein Durchflusszytometer verwendet wurden, das mit einem 360-Nanometer-Ultraviolett-Argonlaser und einem 488-Nanometer-Argonnenlaser ausgestattet war. Letztendlich muss die Einrichtung des Durchflusszytometers vom Bediener des Zellsortierers optimiert werden.

Da der Becton Dixon Aria two U keinen UV-Laser besitzt, wird das Protokoll zur Detektion von Falkenfärbungen mit einem 405 Nanometer violetten Laser angepasst. Hooks wird mit dem violetten 405-Nanometer-Laser angeregt und ein blauer 488-Nanometer-Laser wird sowohl für die PI-Anregung als auch für die Vorwärts- und Seitenstreudetektion verwendet. Darüber hinaus wurden die Filter für die Hos-Detektion modifiziert, um eine gewisse Leckage des roten Lasers zu begrenzen, was zu einer verbesserten Streudiagrammschärfe führt.

Der violette Laser ist mit einem 4 50 40 Nanometer Bandpass für die Detektion von gefälschter blauer Emission und einem 5 85 42 Nanometer Bandpass für gefälschte rote Emission konfiguriert. Ein 5 0 2 Nanometer langer Durchgang wird verwendet, um blaue von roter Fluoreszenz zu trennen. Der Unterschied zur Verwendung von zwei verschiedenen Filtersets wird hier gezeigt.

Der 5 85 42 Nanometer Filter ergibt kompaktere Zellpopulationen als der 6 30 30 Nanometer Filter. Daher sollte der Bediener bereit sein, verschiedene Kombinationen auf seinem eigenen Instrument auszuprobieren, um den besten Kompromiss zu erzielen. Zum Einsatz kommt eine 100-Mikron-Düse mit einer Tropfenantriebsfrequenz von 28.000 Tropfen pro Sekunde.

Der Schwellenwert für die Abtastrate beträgt ca. 4.000 Ereignisse pro Sekunde mit einer Flussrate zwischen eins und drei, um eine höhere Auflösung zu gewährleisten. Sortieren Sie die Probe in Aliquots von ca. 750 Mikrolitern, die aus der Spritze abgegeben werden. Bewahren Sie die verbleibende Probe in der Spritze während dieser Pausen auf Eis und vor Licht geschützt auf. Sammeln Sie die sortierten Proben in 12 x 75 Millimeter großen borisy angeordneten Entnahmeröhrchen aus Glas, die 250 Mikroliter DMEM enthalten, ergänzt mit 10 % FCS.

Um die Probe in den Entnahmeröhrchen bei vier Grad Celsius zu halten, verwenden Sie die Temperaturregelung für die gesamte Dauer der Sortierung. Verwenden Sie zusätzlich die Probenrührfunktion bei 200 U/min, um zu verhindern, dass die Probe während der Sortierung sedimentiert. Jedes Mal, wenn ein Aliquot der Hauptprobe hinzugefügt wird, ist es wichtig, auch die Entnahmeröhrchen zu betätigen, um die Integrität der gesammelten Zellen zu erhalten.

Repräsentative Faktenprofile werden hier gezeigt, in denen alle wichtigen Schritte der Wildtyp-Meiose in diesem Streudiagramm identifiziert sind, in dem die Gated Cells angezeigt sind, es gibt eine große Menge an Trümmern, die hauptsächlich leere Membranen und Spermienschwänze in den adulten Hoden enthalten. Ein repräsentatives Propidiumiodid-Diagramm zeigt eine sehr begrenzte Menge an Propidiumiodid-positiven Zellen, die in der Probe vorhanden sind. Der typische Gang ist in diesem repräsentativen Wildtyp-Hoax 3 33 42 Fax-Profil angegeben.

Die verschiedenen myotischen Zellpopulationen, die mit dieser Methode für weitere Studien gereinigt werden können, sind indizierte Spermatogonien, Präleptin, Leptin, Zygoten, Pacu, Diploten und rundes Sperat. Die letzten beiden Faktenprofile stammen von einem SPO 11 N Hoden und einem Wildtyp-Hoden von 13 Tage alten Mäusen. SPO 11 ist die miotische Endonuklease, die die Dublettenstrangbrüche an ihren Stellen der miotischen Rekombinations-Hotspots lenkt, und wie hier beobachtet, führt das Fehlen von SPO O 11 zu einem eindeutigen miotischen Versagen, da kein Stadium jenseits der frühen PACU der Leptinzygote nachgewiesen werden kann.

Im Gegensatz dazu zeigt das Profil einer 13 Tage alten männlichen Wildtyp-Maus eine hohe Konzentration an Leptin-Zygotenzellen. Diese erste Welle der Myose verläuft eher asynchron, wie deutlich sichtbar ist. Anwendung dieser Methodik Bei der Durchführung dieses Experiments ist es wichtig, eine ausreichende Menge an DNA zu verwenden.

Das Zentrum der Stadt für eine problemlose Sortierung. Obwohl die Forscher zunächst zögern, es zu verwenden, wird die Zugabe von DNA die Probenviskosität verringern und die Zelltrennung und -färbung verbessern, außerdem werden intakte Zellen nicht beschädigt. Die FOX-Methode zur Ation von matischen Zellen kann in einer Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, wie z. B. bei der D-N-A-R-N-A-Extraktion zur Untersuchung der Genexpressionsdynamik oder bei der Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Etablierung verschiedener epigenetischer Profilerstellung.