Name: Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Durchflusszytometrie-Reinigung meiotischer Zellen aus Mäusetestes mittels FACS. Diese Methode ermöglicht die hochreine Isolation verschiedener meiotischer Fraktionen für zytogenetische und Genexpressionsanalysen.

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Dieses Projekt wurde zum Teil durch Gelder aus dem Bundesstaat Florida, um Scripps und Vergabe Zahlen R01GM085079 und R21HD061304 vom National Institute of General Medical Sciences und dem National Institute of Child Health and Human Development, bzw. unterstützt. Dies ist Manuskript Nummer 20917 von The Scripps Research Institute.

Dieses Protokoll kann in zwei wesentliche Schritte unterteilt werden: (1) die Dissoziation und Hoechst 33342 Färbung der Maus Hoden-Zellen, gefolgt von, wenn nötig, (2) FACS-Sortierung der relevanten meiotischen Fraktionen in allen Phasen der Meiose, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden. Einmal erfasst, können diese hoch angereichertes meiotischen Bevölkerung für eine breite Palette von Analysen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt die Dissoziation von einem Erwachsenen testis; Volumes können dementsprechend für Jugendliche oder für zusätzliche Hoden angepasst werden. 1. Testis Dissoziation <ol><li> Legen Sie eine decapsulated Hoden in einen 15-ml-Tube. </li><li> Add 3-ml Gey-Balance-Salzlösung (GBSS) mit 120 U / ml Collagenase Typ I. </li><li> Add 10 ul DNAse I (1mg/ml Stammlösung in 50% Glycerin) und schütteln Sie sie kräftig von Hand, bis Sie Hoden Tubuli beginnen distanzieren sehen. </li><li> Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C. </li><li> Dekantieren für 1 min vertikal bei Raumtemperatur und Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,2 bis 1,5. </li><li> Fügen Sie 2,5 ml GBSS mit Collagenase Typ I, 50 ul einer 50mg/ml Trypsin-Stammlösung in 1 mM HCl-Lösung, und 10 ul DNAse I (1mg/ml) resuspendiert und das Röhrchen mehrere Male. </li><li> Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C. </li><li> Mit Kunststoff-Einweg-Pasteur-Pipette mit breiter Öffnung, Pipette vorsichtig nach oben und unten für 3 min.No Klumpen sichtbar sein soll an dieser Stelle. </li><li> Add 30 ul Trypsin, 10 ul DNAse I, 40 ul Hoechst 33342 in DMSO (10 mg / ml) resuspendiert und das Röhrchen mehrere Male. </li><li> Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C. </li><li> Add 400-ul von fötalem Kälberserum (FCS) und mischen durch Invertieren, um Trypsin zu inaktivieren. </li><li> Finale Färbung wird durch Zugabe von 50 ul Hoechst 33342 resuspendiert in DMSO (10 mg / ml), und 10 ul DNAse I (1 mg / ml) durchgeführt. </li><li> Agitieren horizontal auf einen Höchstbetrag von 120 rpm für 15 min bei 33 ° C. </li><li> Die dissoziierten testis Probe wird dann durch zwei 40-um GBSS weitergegeben vorbefeuchtet Einwegfiltern über einen 50-ml konischen Rohr, dann 5 ul von Propidiumiodid (PI)-Lösung hinzugefügt und Probe wird vorsichtig gemischt mit einer Pipette mehrmals mit Einweg-Pasteur Pipette. </li><li> Die Probe wird auf einer 5-ml Kunststoff-Spritze durch eine 18-Gauge-Nadel übertragen. Letzteres wird durch eine 22-Gauge-Nadel für die Probenvorbereitung Lieferung ersetzt. Die Spritze wird auf Eis gelagert und geschützt vor Licht, bis sie zur FACS Verarbeitung. </li></ol> 2. FACS-Setup und Reinigung <ol><li> Sorting wurde auf einem Becton-Dickinson Aria IIU Zellsortierer durchgeführt. Die beschriebenen Bedingungen sollten daher als Ausgangspunkt verwendet werden, insbesondere wenn mit unterschiedlicher Ausrüstung. Wir haben oben beschriebenen Bedingungen gelten 7,8. </li><li> Da die Aria IIU keinen UV-Laser, passten wir das Protokoll zum Nachweis von Hoechst-Färbung mit einem 405nm violetten Laser zusätzlich verwendeten wir eine 488nm blauen Laser für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Detektion. Darüber hinaus wurden einige Filter modifiziert, um einige rote Laser Undichtigkeit was zu einer verbesserten Streudiagramm Schärfe zu begrenzen. </li><li> Die violetten Laser mit einer 450/40nm Bandpass für den Nachweis von Hoechst Blau-Emission und eine 585/42nm Bandpass für Hoescht Red Emission konfiguriert. A 502nm langen Pass wurde zur Trennung von Blau von roter Fluoreszenz. </li><li> A 100 pm Düse wurde mit einem Tropfen Antriebsfrequenz von 28.000 Tropfen / Sekunde. Die Probe Schwelle lag bei rund 4000 Veranstaltungen / Sekunde. Die Temperaturregelung Option wurde für die Probenahme und Sammlung Röhrchen bei 4 ° C zu halten während der gesamten Dauer der Sortierung. Darüber hinaus wurde die Probe Agitation Feature bei 200 Umdrehungen pro Minute verwendet werden, um die Probe aus sedimentierenden der ganzen Art zu verhindern. </li><li> In der Regel wurden zwei vor drei Hoden pro 6 Stunden sort verarbeitet ermöglicht die Sammlung von 0,5-2.0x10 6 Zellen für jede Population (siehe repräsentativen Abschnitt). </li><li> Die Probe wurde in Aliquots von ca. 750μl aus der Spritze verzichtet sortiert. In der Zwischenzeit, während dieser Pausen die Sammlung Röhrchen wurden bei 4 ° C, geschützt vor Licht und vorsichtig gemischt vor der Wiederaufnahme zu sortieren. </li><li> Die sortierten Proben wurden in einem 12x75mm Glas Borosilikatglas Sammlung Röhrchen mit 250μl DMEM mit 10% FCS gesammelt. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Ein typisches FACS-Profil ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle wichtigen Schritte der Meiose sind identifiziert und werden in der Legende angegeben. Wenn der Hoechst 33342-Färbung nicht optimal ist, wird das globale Profil erscheinen wesentlich kompakter und weniger definiert. Ein häufiges Problem hinsichtlich nicht ausreichender Zugabe von DNAse, die eine schnelle Zelle Verklumpung auslösen wird. Die Zugabe von zusätzlichen DNAse überhaupt angeklagt Schritte in der Regel löst dieses Problem. Freeze-thawing der DNAse Lager (bei -20 ° C) sollte auf ein Minimum reduziert werden, da dies zu einer raschen Verlust der Enzymaktivität. Spo11 ist der meiotischen Endonuklease, Doppelstrang-Brüche an den Standorten der meiotischen Rekombination Hotspots 12 richtet. Abbildung 2 zeigt typische Profile eines Spo11-null Hoden, wo Doppelstrangbruch nicht ausgebildet sind, was zu einer gescheiterten Meiose 12, sowie eine pre-puberous Profil eines 13-Tage alt Maus, die asynchrone Natur von dieser ersten Welle der Meiose zeigt. Standard-zytogenetische Analysen unter Verwendung der Kombination von synaptonemal komplexe Protein 3 (SCP3) und phosphoryliert Histon-Antikörper H2AX stage-spezifischen Meiose Marker sollten zunächst verwendet werden, um bestätigt die Reinheit und die Art der Sortierung meiotischen Zellen, wie beschrieben Patentrechtsgelehrte 11. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Wildtyp-Meiose FACS-Profilen. A) Repräsentative Streudiagramm dargestellt. Die gated Zellen gezeigt werden. Beachten Sie die große Menge an Schutt in erwachsenen Hoden, die hauptsächlich aus leeren Membranen und Spermatide Schwänze. B) Ein Vertreter PI Plot zeigt die sehr begrenzte Menge an PI-positiven Zellen in einer Probe vorhanden. Die typische Gate wird gezeigt. C) Ein Vertreter Wildtyp-Hoechst 33342 FACS-Profil angezeigt wird. Die verschiedenen meiotischen Zellpopulationen, die unter Verwendung dieser Methode für weitere Untersuchungen werden können, sind angegeben: Spermatogonien (Sp), Pre-Leptotän (PL), Leptotän-Zygotän (L / Z), frühe-Pachytän (EP), Mitte-Pachytän ( MP), Late-Pachytän (LP), Diplotän (D), und runden Spermatiden (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Spo11-null-und Wildtyp-Tag 13 meiotischen FACS-Profilen. A) Ein typischer Spo11-null-Profil ist mit einer klaren meiotischen Versagen, in denen keine Bühne hinter dem Leptotän / Zygotän frühen Pachytän erkannt werden können dargestellt. B) Das Profil eines 13-Tage alten Wildtyp-männliche Maus zeigt die hohe Konzentration von Leptotän / Zygotän Zellen. Diese erste Welle der Meiose ist ziemlich asynchron, wie übersichtlich visualisiert mit dieser Methode.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

Das Protokoll hier vorgestellte erlaubt es, gleichzeitig von ausgewachsenen männlichen Mäusen reinigen das gesamte Spektrum der meiotischen Phase-Zellen mit sehr hoher Reinheit, so dass Forscher, die Dynamik dieser grundlegenden Prozess zu studieren. Gereinigte Zellen können für zahlreiche Anwendungen von RNA-Extraktion 9,10, nucleosome Mapping 11, rekombinantes Molekül-Erkennung, Protein-Analysen und vieles mehr verwendet werden. Allerdings haben Nachweismethoden auf die Menge an meiotischen Zelle...

<table><tbody><tr><td>Kollagenase Typ-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>In GBSS auf 12.000 U/ml auflösen, bei 4&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>In 1 mM HCl auf 50 mg/ml auflösen, bei 4&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Gesättigte Lösung (10 mg/ml in DMSO), bei 4&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>In Wasser/50 % Glycerin auf 1 mg/ml auflösen, bei -20&amp;#x00B0;C lagern</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s Pufferlösung mit physiologischen Salzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot;-Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

durchflusszytometrie reinigung der maus meiotischen zellen

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Die Heterogenität der Zelltypen in den Hoden und das Fehlen von meiotischen Zellkultur-Modellen erhebliche Hürden für die Untersuchung der eindeutigen Unterscheidung Programme, die offenkundig sind während der Meiose worden. Zwei wesentliche Methoden wurden entwickelt, um zu reinigen, in unterschiedlichem Ausmaß, verschiedenen meiotischen Fraktionen von Erwachsenen und Jungtieren: Elutriation oder Staput (Sedimentation) mit BSA und / oder Percoll-Gradienten. Beide Methoden beruhen auf Zellgröße und Dichte zu trennen meiotischen Zellen 1-5. Insgesamt, abgesehen von wenigen Zellpopulationen 6, scheitern diese Protokolle, um eine ausreichende Reinheit der zahlreichen meiotischen Zellpopulationen, die für die detaillierte molekulare Analysen ergeben. Darüber hinaus mit solchen Methoden in der Regel eine Art von meiotischen Zellen können zu einer bestimmten Zeit, die eine zusätzliche Ebene der Komplexität in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Homogenität beim Vergleich meiotischen Zellproben fügt gereinigt werden. Hier beschreiben wir eine raffinierte Methode, die man einfach visualisieren, zu identifizieren und zu reinigen meiotischen Zellen erlaubt, die aus Keimzellen zu runden Spermatiden, mit FACS mit Hoechst 33342 Färbung 7,8 kombiniert. Diese Methode bietet eine umfassende Momentaufnahme des gesamten meiotischen Prozess und ermöglicht es, hoch zu reinigen lebensfähige Zellen aus den meisten Stadium der Meiose. Diese gereinigten Zellen können dann im Detail für die molekulare Veränderungen, die Progression durch Meiose zu begleiten, zum Beispiel Veränderungen in der Genexpression 9,10 und die Dynamik der Nukleosomen Belegung an Hotspots der meiotischen Rekombination 11 analysiert werden.

Eine effiziente Methode, um hochreine lebensfähig meiotischen Fraktionen aus Maus Hoden zu erhalten, ist beschrieben, die vereint ein raffiniertes Zelle Dissoziation Protokoll mit fluoreszierenden activated cell sorting (FACS). Diese Methode nutzt die Unterschiede in der DNA-Gehalt und nukleare Dichte der diskreten meiotischen Fraktionen.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

Die heterogene Natur der Zelltypen im Hoden sowie das Fehlen von Zellkulturmodellen für meiotische Zellen stellten erhebliche Hürden für die Untersuchung der ... dar.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine breite Palette an Keimzellen aus erwachsenen Maustestes gleichzeitig und in hoher Reinheit zu isolieren, um die dynamischen Vorgänge zu untersuchen, die während dieses einzigartigen Zellzyklus ablaufen. Dies wird erreicht, indem die Hodenzellen effizient durch eine Reihe enzymatischer Verdauungen mit Kollagenase und Trypsin in Gegenwart von DNA dissoziiert werden. Im zweiten Schritt erhält man eine Einzelzell-Suspension aus dem Hodengewebe.Die trübe Suspension wird mit dem fluoreszierenden lebenden DNA-Farbstoff Hulk's 3 33 42 gefärbt, der es ermöglicht, verschiedene mitotische Zelltypen anhand ihres DNA-Gehalts und ihrer Dichte zu unterscheiden. Anschließend werden die mitotischen Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung analysiert, um alle erforderlichen Fraktionen für weitere Analysen wie zytogenetische oder Genexpressionsanalysen zu identifizieren und zu reinigen. Es werden Ergebnisse erzielt, die eine effiziente Reinigung schwer zugänglicher mitotischer Zellpopulationen in hoher Reinheit zeigen, basierend auf umfassenden zytogenetischen und Expressionsarray-Studien.Der Hauptvorteil dieses auf Fakt

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Ein neuartiges Protokoll für die mechanische Aufbereitung von Hoden Zellsuspensionen von Nagetier Material, die Vermeidung Enzyme und Reinigungsmittel, beschrieben. Das Verfahren ist sehr einfach, schnell, reproduzierbar und macht gute Qualität Zellsuspensionen, die sich für Durchfluss Sortier-und RNA-Extraktion sind.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Wir beschreiben eine Sortierstrategie für Mausspermatiden mittels Durchflusszytometrie. Die Spermatiden werden in vier hochreine Populationen eingeteilt, darunter runde (Spermiogenese-Schritte 1-9), früh-elongierende (Spermiogenese-Schritte 10-12), spät-elongierende (Spermiogenese-Schritte 13-14) und längliche Spermatiden (Spermiogenese-Schritte 15-16). DNA-Färbung, Größe und Granulosität werden als Selektionsparameter verwendet.

Schritt spezifische Sortierung der Maus Spermatiden durch Durchflusszytometrie

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatien und lästigen Spermaatiden aus erwachsenen Maushoden mit einem diskontinuierlichen Rinderserum-Albumin-Dichtegradienten mit Standard-Laborgeräten.

Anreicherung von Pachyten-Spermatozyten und Spermatien aus Maushoden mit Standard-Laborgeräten

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Um die Perizyten des Gehirnkortikats der Maus zu erhalten, die den Anforderungen von scRNA-seq entsprechen, stellen wir ein kritisch optimiertes FACS-Protokoll auf Basis der CD13/CD31⁻-Auswahl vor. Unsere wichtigsten Verfeinerungen verbessern die Zelllebensfähigkeit und die RNA-Integrität erheblich und ermöglichen eine zuverlässige transkriptomische Profilierung.

Isolierung von Perizyten aus Mauskortikalgewebe mittels FACS zur Einzelzellsequenzierung

Erfahren Sie die Durchflusszytometrie-Reinigung meiotischer Zellen aus Mäusetestes mittels FACS. Diese Methode ermöglicht die hochreine Isolation verschiedener meiotischer Fraktionen für zytogenetische und Genexpressionsanalysen.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

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